二甲双胍改善由C9ORF72肌萎缩侧索硬化/额颞叶痴呆相关多聚甘氨酸-精氨酸诱导的线粒体损伤

目的·探索C9ORF72肌萎缩侧索硬化/额颞叶痴呆(amyotrophic lateral sclerosis/frontotemporal dementia,ALS/FTD)相关的多聚甘氨酸-精氨酸(poly-glycine-arginine,poly-GR)对线粒体形态及功能的影响,并分析二甲双胍对由poly-GR诱导的线粒体损伤的修复作用及其可能的机制。方法·采用慢病毒感染法分别构建能够稳定表达50个重复甘氨酸-精氨酸序列[(glycine-arginine)50,(GR)_(50)]和绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的SK-N-SH细胞,即(GR)_(50)-SK细胞株和GFP CTRL-SK细胞株。采用蛋白质印迹法(Western blotting)验证已构建细胞中(GR)_(50)蛋白的表达水平,并采用荧光显微镜观察GFP CTRL-SK细胞的GFP表达。采用碘化丙啶(propidium iodine,PI)染色分别检测(GR)_(50)-SK、GFP CTRL-SK细胞的凋亡水平。利用免疫荧光(immunofluorescence,IF)染色分析(GR)_(50)蛋白在细胞内的定位情况。采用超氧化物指示剂MitoSOX Red分别对(GR)_(50)-SK、GFP CTRL-SK细胞的氧自由基进行染色,并利用荧光显微镜观察红色荧光强度以评估线粒体活性氧水平的变化。采用透射电镜分别观察(GR)_(50)-SK、GFP CTRL-SK细胞的线粒体形态。采用Western blotting检测(GR)_(50)-SK、GFP CTRL-SK细胞的蛋白激酶B(protein kinase B,PKB,又称AKT)及其磷酸化水平。利用SC79激活(GR)_(50)-SK细胞中的AKT,并采用MitoSOX Red染色及PI染色实验分析AKT磷酸化后细胞的线粒体活性氧水平及凋亡水平。利用二甲双胍处理(GR)_(50)-SK、GFP CTRL-SK细胞,随后通过上述方法以及ATP检测试剂盒检测细胞的凋亡水平、线粒体活性氧水平、线粒体形态、AKT及其磷酸化水平、ATP浓度情况。结果·Western blotting结果提示(GR)_(50)-SK细胞构建成功,荧光显微镜的观察结果显示GFP CTRL-SK细胞构建成功。PI染色结果显示,(GR)_(50)-SK细胞较GFP CTRL-SK细胞的凋亡水平更高(P=0.016)。IF结果提示,(GR)_(50)-SK细胞中(GR)_(50)蛋白与线粒体存在部分共定位。与GFP CTRL-SK细胞相比,(GR)_(50)-SK细胞的线粒体形态及结构存在明显异常,其活性氧水平明显上升。(GR)_(50)-SK细胞中的AKT水平与GFP CTRL-SK细胞相仿,但磷酸化AKT水平显著下降。SC79处理(GR)_(50)-SK细胞后,可显著上调其AKT磷酸化水平,并下调其活性氧水平及凋亡水平。二甲双胍处理可明显上调(GR)_(50)-SK细胞中的磷酸化AKT水平,但对AKT水平无影响;可重塑该细胞中的部分线粒体形态结构、降低活性氧水平、增加ATP的生成(P=0.000),并下调细胞的凋亡水平(P=0.000)。结论·(GR)_(50)可通过下调AKT磷酸化引起线粒体形态及功能异常,并促进细胞凋亡;而二甲双胍则可抑制由(GR)_(50)蛋白诱导的上述病理事件的发生。

多聚精氨酸蛋白转导域-凋亡素融合蛋白的原核表达及其生物活性

目的原核表达多聚精氨酸蛋白转导域-凋亡素融合蛋白,并检测其生物活性。方法应用PCR法扩增Arg9-VP3序列,与载体pET-43.1a连接后,转化E.coliBL21(DE3),IPTG诱导表达。表达产物经Ni2+-NTA纯化后,进行肠激酶裂解、超滤浓缩,并检测其生物活性。结果重组表达质粒pET-43.1a-Arg9-VP3经酶切鉴定和序列分析,证明构建正确。转化E.coliBL21(DE3)后,重组蛋白获得可溶性表达。纯化的融合蛋白纯度达90%以上,可抑制HeLa细胞增殖。结论已成功地在大肠杆菌中表达了多聚精氨酸蛋白转导域-凋亡素融合蛋白,纯化的融合蛋白具有诱导HeLa细胞凋亡的能力。

多聚精氨酸融合增强型绿色荧光蛋白制备方法及穿膜效果

为了方便细胞穿膜肽R9融合蛋白的可溶性表达及功能上的研究,构建了pSUMO(小分子泛素样修饰蛋白)-R9-EGFP(增强型绿色荧光蛋白)原核表达载体。分别纯化EGFP及R9-EGFP蛋白后,作用于HepG2,细胞经流式细胞仪及激光共聚焦检测R9细胞穿膜肽的作用效果。实验结果显示在SUMO分子伴侣的作用下,R9-EGFP融合蛋白获得可溶性表达。经流式细胞仪检测,R9细胞穿膜肽可以快速有效的携带目的蛋白进入细胞内部且呈时间、剂量依赖性,大约1.5 h以后荧光强度进入平台期。共聚焦显微镜检测结果表明R9细胞穿膜肽可以有效携带EGFP进入HepG2细胞,并显示主要聚集在细胞浆内。同时体外经肝素抑制实验显示,肝素抑制R9-EGFP穿膜的效率达到50%。这些结果表明,可以利用pSUMO-R9/Ni-NTA表达纯化系统,快速、有效地表达出可溶性多聚精氨酸融合蛋白,同时R9细胞穿膜肽可以有效地携带目的蛋白进入细胞内,为进一步研究多聚精氨酸的穿膜机制提供了基础。

鱼精蛋白的抑菌机理

鱼精蛋白对细菌呼吸系统能产生微弱的抑制作用 ,但这并不是其抑菌活性的主要途径 ;鱼精蛋白主要是以分子中多聚精氨酸或多聚精氨酸与其它少数几个氨基酸以某一种结构或形式和细菌细胞壁结合 ,破坏细胞壁的形成 。

R9-FOXM1(1-234aa)重组蛋白批量纯化及其抑瘤效应研究

通过基因工程构建重组表达质粒pET15b-R9-FOXM1(1-234aa),转化大肠杆菌建立构建表达R9-FOXM1(1-234aa)的菌株.采用原核表达系统和His-tag亲和纯化手段,规模化制备纯化穿膜肽R9-FOXM1(1-234aa),获得的蛋白的纯度达到90%以上.用R9-FOXM1(1-234aa)穿膜肽处理不同的肿瘤细胞,通过MTT实验研究其细胞效应.结果显示:当R9-FOXM1(1-234aa)穿膜肽的浓度达到2mM时,肿瘤细胞的死亡率为50%左右.实验表明穿膜肽R9-FOXM1(1-234aa)抑制不同肿瘤细胞的生长,有可能成为治疗肿瘤的潜在蛋白类药物.

重组分子靶向R9-GRIM-19融合蛋白治疗肝癌的疗效与机制

目的探讨多聚精氨酸蛋白转导域R9作为维甲酸/干扰素联合应用诱导细胞死亡相关基因(GRIM)-19载体表达R9-GRIM-19融合蛋白对肝癌的治疗作用。方法应用PCR法扩增R9-GRIM-19序列,与载体p ET32 a(+)连接,在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)上表达并经Ni2+-NTA纯化,在体外及体内检测R9-GRIM-19融合蛋白抑制肝癌生长的能力。结果 p ET32a-R9-GRIM-19重组质粒在大肠杆菌BL21菌株内实现了高效表达;R9-GRIM-19融合蛋白能够进入肝癌HepG2细胞内,并能抑制Hep G2细胞的增殖;体内抑瘤实验表明R9-GRIM-19对肝癌Hep G2小鼠移植瘤具有明显的抑制作用。结论成功地在大肠杆菌中表达了R9-GRIM-19融合蛋白,纯化的融合蛋白具有抑制肝癌生长的能力。

跨膜转导肽TAT、9R和牛Sox2融合蛋白原核表达载体的构建与表达研究

【目的】构建pTAT-bSox2-9R融合表达载体,并对其进行原核表达研究,为利用TAT和多聚精氨酸(9R)的跨膜作用实现转录因子蛋白直接重编程牛体细胞提供科学资料。【方法】以GenBank上公布的牛Sox2基因编码区序列为基础,设计并合成含酶切位点、跨膜转导肽TAT和9R的引物;利用PCR扩增方法获得包括Sox2、TAT和9R的重组DNA序列,并将其克隆到空质粒pTAT-HA上,从而构建pTAT-HA-bSox2-9R重组表达载体;将经酶切鉴定和测序验证后的重组表达载体转化大肠杆菌,在不同IPTG浓度和诱导时间等条件下进行诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE和Western blot分析。【结果】成功获得bSox2-9R重组序列,成功构建重组质粒pTATbSox2-9R;pTAT-bSox2-9R在0.6mmo/L的IPTG于37℃诱导4h的条件下表达目的蛋白约36ku,经Western blot验证为目的蛋白。【结论】成功获得了pTAT-bSox2-9R融合蛋白,为多聚精氨酸蛋白转导域(PTD)介导的转录因子蛋白直接重编程黄牛体细胞以获得诱导多潜能干细胞的研究积累了原始资料。

牛c-Myc/TAT/9R融合表达载体构建及其原核表达研究

原癌基因c-Myc虽然在许多肿瘤组织中特异性高表达,但它也是机体正常细胞生长与增殖所必需的因子,然而目前家畜诱导多潜能干细胞(iPS)研究中关于多功能转录因子cMyc的报道很少。为此,研究拟利用蛋白转导区域(PTD)的跨膜作用,构建TAT-bc-Myc-9R融合表达载体,并对其进行原核表达,旨在为转录因子蛋白重编程牛体细胞奠定基础。试验以牛c-Myc基因编码区序列为参考,设计并合成含酶切位点、跨膜转导肽TAT和9R的引物,利用PCR等基因工程方法获得包括牛c-Myc、TAT和9R的重组原核表达载体(pTAT-HA-bcMyc-9R);酶切鉴定和DNA测序结果表明,试验成功获得bc-Myc-9R重组序列,成功构建重组质粒pTAT-bc-Myc-9R;不同IPTG浓度和诱导时间条件对该重组载体的诱导表达和SDSPAGE分析表明,TAT-bc-Myc-9R在0.6mmol/L IPTG和37℃诱导6h条件下表达约57KDa的目的蛋白。这些结果为PTD介导的转录因子蛋白直接重编程牛体细胞以获得iPS研究积累了科学资料。

EGFP-Arg7融合蛋白表达及在HeLa细胞中的转导活性

目的构建pET-28a-EGFP-Arg7重组子,观察表达的融合蛋白EGFP-Arg7在细胞内的转导活性。方法构建EGFP-Arg7(阴性对照为EGFP)序列,与pET-28a连接后,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,并经Ni2+-NTA纯化。纯化产物作用于HeLa细胞后用荧光显微镜观察其转导活性。结果重组pET-28a-EGFP-Arg7经酶切鉴定和序列分析,证明构建正确。转化E.coli BL21(DE3)后,重组蛋白获得可溶性表达。纯化后的融合蛋白纯度达90%以上。重组蛋白EGFP-Arg7作用于HeLa细胞后用荧光显微镜可观察到强绿色荧光。结论 Arg7具有很好的转导活性,能携带与其连接的蛋白质穿过HeLa细胞膜。

载BMP-2基因纳米粒缓释微球的制备及其成骨诱导效能的研究

目的构建多聚精氨酸-壳聚糖/p BMP-2纳米粒,探讨包封多聚精氨酸-壳聚糖/p BMP-2纳米粒的PELA微球的体外成骨诱导效能。方法构建多聚精氨酸修饰的壳聚糖多聚物,并与BMP-2质粒基因凝聚成纳米粒子,检测其表征。荧光显微镜及Western blot分析其体外细胞转染效能。进而,将纳米粒子包入PELA微球,与MC3T3-E1细胞共培养,检测BMP-2蛋白表达,茜素红染色分析其成骨诱导分化效能。结果多聚精氨酸-壳聚糖/p BMP-2纳米粒粒径(81.39±22.96)nm,能有效介导BMP-2基因转染MC3T3-E1细胞,转染率高于裸质粒组及壳聚糖/p BMP-2纳米粒组(P<0.05)。PELA微球呈球形,粒径为(43.34±15.24)μm,包封率达(67.49±0.85)%,42 d内累积释药(56.87±5.09)%,与MC3T3-E1共培养,第7天BMP-2分泌量达最高(64.348±2.396)pg/m L,21 d后分泌量仍能达到(51.763±1.789)pg/m L。茜素红染色钙结节形成数量明显高于对照组。结论多聚精氨酸-壳聚糖能有效凝聚BMP-2基因成纳米级粒子,促进细胞转染,并可通过PELA微球的包封实现纳米粒的长效缓释,促进成骨分化。