桑色素对脑缺血再灌注损伤大鼠多聚腺苷酸二磷酸核糖聚合酶和核因子-κB表达的影响

目的探讨桑色素对大鼠脑缺血再灌注损伤区炎性递质多聚腺苷酸二磷酸核糖聚合酶(poly adeno-sine diphosphate ribose polymerase,PARP)和核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)表达的影响。方法采用线栓法复制大鼠大脑中动脉缺血再灌注模型,将动物随机分为假手术组,模型组,尼莫地平组,桑色素高、中、低剂量组。观察各组大鼠的神经功能损害评分(neurological severity scores,NSS),采用蛋白质印迹法和PCR分别检测梗死区NF-κB和PARP蛋白及其mRNA的表达水平。结果与模型组比较,桑色素各剂量组大鼠NSS,以及半暗带区PARP蛋白、NF-κB蛋白、PARP mRNA、NF-κB mRNA表达水平均显著降低(P<0.05,或P<0.01);桑色素高剂量组在降低上述指标方面显著优于桑色素低、中剂量组及尼莫地平组(P<0.05,或P<0.01)。结论桑色素可能通过下调炎性递质NF-κB和PARP的表达而抑制炎性反应,从而促进脑缺血损伤神经功能的恢复。

多聚腺苷酸二磷酸核糖聚合酶及其生物学功能的研究进展

多聚腺苷酸二磷酸核糖聚合酶(PARP)及其相关功能和机制是近年来科学研究的全新领域,PARP参与了转录与调控、DNA的复制与修复、凋亡作用等病理生理过程。笔者就PARP的生物学功能的研究进展进行综述。

多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶2评估原发性肝癌患者预后的价值

目的观察原发性肝癌患者癌组织多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(polyadenosine diphosphate ribose polymerase,PARP)2表达变化,探讨其预测原发性肝癌患者预后的价值。方法原发性肝癌患者70例,均行肝癌根治性切除术,术后给予肝动脉化疗栓塞治疗、分子靶向治疗、免疫治疗等,随访2年。取手术切除癌组织及癌旁组织,采用实时荧光定量PCR法检测PARP2mRNA相对表达量;比较不同临床病理特征者PARP2mRNA相对表达量。依据随访结果,34例发生复发转移及死亡者为预后不良组,余36例为预后良好组,比较2组病理分级低分化、有微血管侵犯、术前血清甲胎蛋白≥400μg/L、PARP2mRNA相对表达量≥3.64等比率;多因素Cox回归分析原发性肝癌患者术后2年预后不良的影响因素;绘制ROC曲线,评估癌组织PARP2表达预测原发性肝癌患者预后的效能。结果70例患者癌组织PARP2 mRNA相对表达量(3.64±0.61)高于癌旁组织(2.29±0.43)(t=15.134,P<0.001)。临床分期Ⅱ期(3.82±0.75)、病理分级低分化(3.91±0.68)、有微血管侵犯(3.88±0.64)、术前血清甲胎蛋白≥400μg/L(3.82±0.69)者癌组织PARP2mRNA相对表达量分别高于临床分期Ⅰ期(3.22±0.62)、病理分级中高分化(3.47±0.57)、无微血管侵犯(3.37±0.55)、术前血清甲胎蛋白<400μg/L(3.24±0.61)者(P<0.05);不同年龄、性别、原发病、Child-Pugh分级、肿瘤直径、肿瘤数目以及有无肝硬化、肿瘤包膜者癌组织PARP2mRNA相对表达量比较差异均无统计学意义(P>0.05)。预后不良组低分化(55.88%)、有微血管侵犯(70.59%)、术前血清甲胎蛋白≥400μg/L(85.29%)、癌组织PARP2 mRNA相对表达量≥3.64(73.53%)比率均高于预后良好组(22.22%、36.11%、52.78%、36.11%)(P<0.05),不同年龄、性别、原发病、Child-Pugh分级、肿瘤直径、肿瘤数目、临床分期及有无肝硬化、肿瘤包膜比率与预后良好组比较差异均无统计学意义(P>0.05)。病理分级低分化(HR=3.331,95%CI:2.048~5.417,P<0.001)、有微血管侵犯(HR=5.503,95%CI:3.527~8.585,P<0.001)、术前血清甲胎蛋白≥400μg/L(HR=4.667,95%CI:2.976~7.319,P<0.001)、癌组织PARP2mRNA相对表达量≥3.64(HR=4.942,95%CI:3.067~7.964,P<0.001)是原发性肝癌患者预后不良的危险因素。癌组织PARP2mRNA相对表达量以3.71为最佳截断值,预测原发性肝癌患者术后2年预后不良的AUC为0.734(95%CI:0.616~0.853,P<0.05),灵敏度为52.94%,特异度为86.11%。结论原发性肝癌患者癌组织PARP2表达上调,病理分级低分化、有微血管侵犯、术前血清甲胎蛋白≥400μg/L、PARP2mRNA相对表达量≥3.64是其术后2年预后不良的危险因素,癌组织PARP2表达在原发性肝癌患者预后评估中具有较高价值。

miR-222调控多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶-1在高糖致人肾系膜细胞外基质沉积中作用

目的探讨miR-222调控多聚二磷酸腺苷(ADP)核糖聚合酶-1(PARP-1)在高糖致人肾系膜细胞外基质沉积中的作用。方法体外培养人肾系膜细胞株(HMC),使用高糖(25 m M)处理人肾系膜细胞,部分细胞应用miR-222抑制物或miR-222模拟物进行干预处理,Western blot检测PARP-1及FN蛋白表达。结果高糖培养组HMC在24 h时miR-222的表达上调,较对照组上调2.53倍,两组间比较,差异有统计学意义(P<0.05)。高糖+miR-222模拟物组HMC转染miR-222模拟物,可有效下调其靶蛋白PARP-1的表达,是高糖培养组的52.2%;高糖+miR-222抑制物组HMC转染miR-222抑制物,可有效上调其靶蛋白PARP-1的表达,较高糖培养组升高17.3%,两组间比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。HMC细胞转染miR-222模拟物,可有效下调FN的表达,是高糖培养组的60.9%;而转染miR-222抑制物可有效上调纤维连接蛋白(FN)的表达,较高糖培养组升高18.8%,两组间比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 miR-222可通过调控PARP-1促进HMC基质增生。

多聚腺苷酸二磷酸核糖聚合酶-1在乙醇致小鼠脑损伤中的表达及意义

目的探讨多聚腺苷酸二磷酸核糖聚合酶-1（PARP-1）在乙醇致小鼠脑损伤中的变化及意义。方法建立乙醇致脑损伤模型，将12只新生雄性乳鼠于出生后随机分为2组，7d时参照文献报道方法，按2g/kg乙醇（20％无菌盐水溶液）皮下注射，间隔2h后再次注射。对照组乳鼠仅注射生理盐水。通过苏木素一伊红（HE）染色鉴定模型制备成功后，采用实时定量逆转录聚合酶链反应（RT-qPCR）及免疫组织化学（IHC）法检测PARP-1mRNA及蛋白水平的变化。结果RT．qPCR显示，乙醇组PARP-1mRNA相对表达量（11．960±2．136，n=6）较生理盐水组PARP-1mRNA相对表达量（4．333±1．667，n=6）显著增加，差异有统计学意义（P〈0．05）。同时，IHC检测提示生理盐水组PARP-1蛋白未见明显表达，阳性率为16．7％（1/6），乙醇组中PARP-1蛋白表达增强，阳性率为83．3％（5/6），差异有统计学意义（P〈0．05）。结论乙醇致小鼠脑损伤模型中，PARP-1表达增强，提示其参与乙醇致脑损伤的分子过程。

高糖通过调节腺苷酸活化蛋白激酶/聚二磷酸腺苷核糖聚合酶-1的磷酸化抑制B细胞淋巴瘤/白血病-6基因表达的研究

目的探讨高浓度葡萄糖对B细胞淋巴瘤/白血病-6基因(BCL-6)的影响及其是否通过腺苷酸活化蛋白激酶α/聚二磷酸腺苷核糖聚合酶-1(AMPKα/PARP 1)磷酸化途径。方法分离培养人脐静脉内皮细胞,用不同浓度的葡萄糖孵育脐静脉内皮细胞24 h,RT-PCR和Western blot检测检测内皮细胞AMPK hr172和PARP-1 Ser-177的磷酸化、BCL-6及炎症因子血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)、单核细胞去化因子-1(MCP-1)和MCP-3的表达。用不同浓度的AMPK磷酸化激动剂AICAR(0、0.5、1mmol/L)孵育脐静脉内皮细胞4 h;Western blot检测内皮细胞AMPKhr 172和PARP-1 Ser-177的磷酸化及BCL-6表达。用AICAR预处理内皮细胞4 h,然后加入高浓度葡萄糖(30 mnol/L)作用于内皮细胞24 h,Western blot及免疫荧光检测内皮细胞AMPK hr 172和PARP-1 Ser-177的磷酸化及BCL-6表达。结果高浓度葡萄糖可抑制AMPK hr 172和PARP-1 Ser-177的磷酸化,降低内皮细胞BCL 6的表达,同时,炎症因子VCAM-1、MCP-1和MCP-3表达增加。AICAR能增强内皮细胞AMPKhr 172和PARP 1Ser-177的磷酸化,BCL-6表达增加。AICAR可逆转高浓度葡萄糖对AMPKhr 172和PARP 1 Ser-77的磷酸化及BCL-6表达的抑制作用。结论高浓度葡萄糖通过抑制AMPARP-1磷酸化减少BCL-6的表达,从而使炎症表达增加。

基于Caspase-3/PARP通路探究龟鹿二仙胶及拆方对IL-1β诱导的退变软骨细胞凋亡及细胞外基质的影响

目的 基于半胱氨酸蛋白酶3/多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(Caspase-3/PARP)通路探究龟鹿二仙胶及拆方对白细胞介素-1β(IL-1β)诱导的退变软骨细胞凋亡及细胞外基质(ECM)的影响。方法 采用SD大鼠制备空白血清、龟鹿二仙胶含药血清、龟甲胶含药血清及鹿角胶含药血清,采用酶消法体外培养C57BL/6小鼠软骨细胞。将软骨细胞分为5组,空白组加入空白血清培养,模型组加入IL-1β和空白血清培养,龟鹿组加入IL-1β和龟鹿二仙胶含药血清培养,龟板组加入IL-1β和龟甲胶含药血清培养,鹿角组加入IL-1β和鹿角胶含药血清培养,干预24 h后,采用CCK-8法检测软骨细胞活性,采用TUNEL法检测软骨细胞凋亡情况,采用免疫荧光染色法检测Caspase-3、PARP-1表达情况,分别采用Western blot和qRT-PCR法检测细胞中Caspase-3、PARP-1、基质金属蛋白酶-13(MMP-13)、聚集蛋白聚糖(Aggrecan)蛋白及mRNA表达情况。结果 与空白组比较,模型组软骨细胞活性明显降低(P<0.05),软骨细胞凋亡率明显升高(P<0.05);细胞中Caspase-3、PARP-1平均荧光强度和Caspase-3、PARP-1、MMP-13蛋白及mRNA相对表达量均明显升高(P均<0.05),细胞中Aggrecan蛋白及mRNA相对表达量均明显降低(P均<0.05)。与模型组比较,龟鹿组、龟板组及鹿角组软骨细胞活性均明显升高(P均<0.05),软骨细胞凋亡率均明显降低(P均<0.05);细胞中Caspase-3、PARP-1平均荧光强度和Caspase-3、PARP-1、MMP-13蛋白及mRNA相对表达量均明显降低(P均<0.05),细胞中Aggrecan蛋白及mRNA相对表达量均明显升高(P均<0.05)。与龟板组、鹿角组比较,龟鹿组软骨细胞活性更高(P均<0.05),软骨细胞凋亡率更低(P均<0.05);细胞中Caspase-3、PARP-1平均荧光强度和Caspase-3、PARP-1、MMP-13蛋白及mRNA相对表达量均更低(P均<0.05),细胞中Aggrecan蛋白及mRNA相对表达量均更高(P均<0.05)。与龟板组比较,鹿角组软骨细胞活性,软骨细胞凋亡率,细胞中Caspase-3、PARP-1平均荧光强度,细胞中Caspase-3、PARP-1、MMP-13、Aggrecan蛋白及mRNA相对表达量高均更高(P均<0.05)。结论 龟板胶可抑制软骨细胞凋亡及ECM降解,鹿角胶可促进软骨细胞增殖和ECM合成代谢,龟鹿二仙胶作用效果优于龟板胶及鹿角胶,作用机制可能与激活Caspase-3/PARP信号通路有关。

多聚腺苷酸二磷酸核糖聚合酶抑制剂对重症急性胰腺炎肾损伤的作用

目的探讨多聚腺苷酸二磷酸核糖聚合酶（PARP）抑制剂3-氨基苯甲酰胺（3-AB）对重症急性胰腺炎（SAP）肾损伤的作用。方法雄性Wistar大鼠56只，分为7组：假手术组（简称SO组），SAP（3、6、12h）组，3-AB＋SAP（3、6、12h）组，每组8只。采用5％牛磺胆酸钠逆行胰胆管注射法制备SAP模型，3-AB＋SAP组在SAP造模前30rain经股静脉注射3-AB（20μg／g）。检测血清淀粉酶、肾功能、肾髓过氧化物酶（MPO）水平，光镜观察胰腺和肾脏病理变化，Westemblot检测肾组织PARP活化程度（PAR蛋白表达水平代表PARP活性程度）、细胞内黏附分子-1（ICAM-1）和P-选择素蛋白表达。多个样本均数比较采用单因素方差分析，两组间比较采用￡检验。肾损伤分级采用Kmskal-Wallis法秩和检验。结果SAP（3、6、12h）组血清淀粉酶分别为（3806±229）U／L、（4898±295）U／L和（5726±372）U／L，高于3-AB＋SAP相应时点组的（2785±160）U／L、（3241±198）U／L和（3953±249）U／L，差异有统计学意义（t=3．652，4．672，4．407，P〈0．05）；SAP（3、6、12h）组尿素氮分别为（11．6±0．8）mmo/L、（19．3±1．3）mmo/L和（29．6±2．1）mmo/L，均高于3-AB＋SAP相应时点组的（7．5±0．5）mmo/L、（10．5±0．7）mmo/L和（21．6±1．5）mmo/L，其中6、12h时相点两组比较，差异有统计学意义（t=3．836，6．849，P〈0．05）；SAP（3、6、12h）组肌酐分别为（48．7±3．1）μmol／L、（58．3±3．7）μmol／L和（75．9±5．4）μmol／L，均高于3-AB＋SAP相应时点组的（40．7±2．6）μmol／L、（43．2±2．6）μmol／L和（53．4±3．2）μmol／L，其中6、12h时相点两组比较，差异有统计学意义（t=3．279，3．073，P〈0．05）；SAP（3、6、12h）组肾脏MPO值分别为（0．69±0．06）U／g、（1．07±0．09）U／g和（1．42±0．13）U／g，均高于3-AB＋SAP相应时点组的（0．57±0．05）U／g、（0．75±0．06）U／g和（0．89±0．07）U／g，其中6、12h时相点两组比较，差异有统计学意义（t=3．066，4．012，P〈0．05）。SAP（3、6、12h）组胰腺病理评分分别为（6．50±0．53）分、（9．06±0．66）分和（11．75±0．89）分，显著高于3-AB＋SAP相应时点组的（4．25±0．31）分、（6．06±0．51）分和（7．57±0．59）分，差异有统计学意义（t=3．631，3．598，5．147，P〈0．05）。SO组肾脏结构正常，SAP（12h）组可见肾小球淤血性改变，细胞界限模糊，肾小管上皮细胞坏死脱落，间质出血、管腔变窄或闭塞，炎症细胞浸润，而3-AB＋SAP（12h）组上述病理改变均减轻，病理分级降低（P〈0．05）。SO组肾组织PAR、ICAM-1和P-选择素蛋白的相对表达量分别为1．00±0．21、1．00±0．18和1．00±0．16，显著低于SAP（12h）组的3．83±0．63、5．42±0．83和3．71±0．48，差异有统计学意义（t=6．955，23．107，10．352，P〈0．05），而3-AB＋SAP（12h）组肾组织PAR、ICAM-1和P-选择素蛋白相对表达量分别为1．94±0．36、2．35±0．35和2．11±0．29，较SAP（12h）组显著下降，差异有统计学意义（t=3．977，12．115，5．012，P〈0．05）。结论PARP抑制剂3-AB对SAP肾损伤有保护作用。其作用可能与抑制肾组织ICAM-1和P-选择索蛋白表达以及减缓中性粒细胞浸润程度有关。

子痫前期血浆多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶及脂蛋白相关磷脂酶A2活性变化研究

目的探讨多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)及脂蛋白相关磷脂酶A2(Lp-PLA2)在子痫前期发病中可能的致病机制。方法选择2013年9月至2014年5月在中国医科大学附属盛京医院行剖宫产终止妊娠的妊娠晚期女性60例,根据是否存在子痫前期,将研究对象分为:子痫前期组32例(A组)以及正常孕妇组28例(B组)。采集孕妇肘前静脉血浆2 m L并应用酶联免疫分析法进行PARP及Lp-PLA2活性测量。结果 A组PARP、Lp-PLA2活性表达均显著高于B组(P<0.01)。PARP与Lp-PLA2活性呈正相关(r=0.234,P<0.01)。PARP活性与新生儿1 min Apgar评分、新生儿5 min Apgar评分存在相关性(r值分别为-0.243、-0.318,均P<0.05)。Lp-PLA2活性与孕妇收缩压、舒张压、脉压差、平均动脉压及新生儿5 min Apgar评分存在相关性(r值分别为0.342、0.335、0.245、0.351、-0.267,均P<0.05)。结论子痫前期患者体内存在PARP、Lp-PLA2的高活性表达,血浆PARP、Lp-PLA2可能参与了子痫前期的致病过程,且PARP及Lp-PLA2的高活性有可能对新生儿不良妊娠结局有一定预测作用。

西红花苷通过过氧化物酶体增殖物激活受体γ-半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3-聚腺苷酸二磷酸核糖基聚合酶通路保护大鼠心肌缺血再灌注损伤

目的探讨西红花苷通过过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)-半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3)-聚腺苷酸二磷酸核糖基聚合酶(PARP)通路对心肌缺血再灌注(MIR)大鼠的保护作用。方法将72只大鼠随机分为假手术组、模型组、西红花苷低、中、高剂量[20、40、80 mg/(kg·d),灌胃]组、西红花苷+PPARγ抑制剂T0070907组[西红花苷80 mg/(kg·d)+T00709071.5 mg/(kg·d)]。结扎冠状动脉前降支法构建MIR大鼠模型。建模成功后,测定大鼠血流动力学参数左心室舒张压(LVDP)、左心室舒张末压(LVEDP)、左心室内压最大上升和下降速率(±dp/dt_(max));试剂盒检测大鼠血清和心肌组织中乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、丙二醛水平;苏木精-伊红(HE)染色法检测大鼠心肌组织病理学变化;原位末端标记(TUNEL)法检测大鼠心肌细胞凋亡情况;蛋白免疫印迹(Western-blot)法检测大鼠心肌组织中PPARγ-caspase-3-PARP通路蛋白表达。结果假手术组大鼠心肌纤维排列整齐,间质无炎症细胞浸润;模型组大鼠心肌纤维排列紊乱,间质伴有大量炎症细胞浸润;与模型组比较,西红花苷低、中、高剂量组大鼠心肌组织病变得到改善,西红花苷中、高剂量组心肌纤维排列较整齐,存在少量炎症细胞浸润;与西红花苷高剂量组比较,西红花苷+T0070907组大鼠心肌组织病变严重。模型组大鼠血流动力学参数LVDP、+dp/dt_(max)、-dp/dt_(max)、PPARγ、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)表达较假手术组降低,LVEDP、血清和心肌组织中LDH[血清LDH(2762.74±317.69)比(1105.68±286.45)U/L,q=18.605,P<0.001;心肌组织LDH(4852.34±244.82)比(2456.84±315.63)U/mg,q=29.820,P<0.001]、CK-MB、丙二醛水平,心肌细胞凋亡数目、Bcl-2相关X基因(Bax)、活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Cleaved caspase-3)、活化的PARP(Cleaved PARP)蛋白表达较假手术组升高(P<0.05);与模型组比较,西红花苷低、中、高剂量组LVDP、+dp/dt_(max)、-dp/dt_(max)及PPARγ、Bcl-2蛋白表达升高,LVEDP、LDH、CK-MB、丙二醛水平、心肌细胞凋亡数目及Bax、Cleaved caspase-3、Cleaved PARP蛋白表达降低,且随着西红花苷剂量的增加,呈一定的剂量依赖性变化(P<0.05);T0070907可逆转西红花苷对心肌缺血再灌注大鼠的保护作用。结论西红花苷可能通过激活PPARγ-caspase-3-PARP通路预防MIR大鼠心肌损伤。

白细胞介素2受体α亚基参与Jurkat细胞凋亡的调节

T淋巴细胞表面的高亲和力白细胞介素 2受体 (IL 2R)由α ,β及γ三种亚基组成 ,其中只有IL 2Rα亚基具有特异结合IL 2的活性 ,目前对IL 2Rα亚基的确切的功能尚不清楚。我们将IL 2RαcDNA反意表达质粒转染Jurkat细胞后 ,经Western印迹 ECL分析发现 ,细胞内出现了细胞凋亡早期特异的多聚二磷酸腺核糖聚合酶 [Poly(ADP ribose)polymerase ,PARP]的 89kD断裂片段 ,此结果提示 ,IL

PARP-2在大鼠心肌肥大中的作用

目的:在细胞和整体水平研究多聚腺苷酸二磷酸核糖基聚合酶2(PARP-2)在心肌肥大过程中表达的变化规律以及PARP-2对心肌肥大的调控作用。方法:健康雄性SD大鼠采用腹主动脉缩窄法(AAC)建立心肌肥大动物模型,采用real-time PCR和Western blot检测PARP-2的mRNA和蛋白表达变化;使用PARP-2特异性的siRNA干扰序列来处理细胞后,通过检测心肌细胞表面积及ANF、BNP和β-MHC的mRNA表达变化来作为评判心肌细胞肥大状况。结果:AAC大鼠心脏组织中PARP-2的蛋白和mRNA表达均显著上调;在AngⅡ诱导的心肌细胞肥大模型中,AngⅡ能时间和剂量依赖性地上调PARP-2的mRNA和蛋白表达;用siRNA干扰序列沉默PARP-2能够逆转AngⅡ所诱导心肌细胞的肥大。结论:在AngⅡ诱导的心肌细胞肥大的体外模型和腹主动脉缩窄诱导的心肌肥大动物的体内模型中,PARP-2的mRNA和蛋白水平均显著上调;特异性沉默PARP-2能够抑制AngⅡ诱导的心肌细胞肥大。

Taqman巢式real-time PCR法检测不同月龄小鼠成熟卵母细胞PARP-2 mRNA的表达

目的了解聚(腺苷酸二磷酸核糖)聚合酶-2(PARP-2)在不同月龄小鼠成熟卵母细胞的表达及其与年龄的关系。方法用Taqman巢式real-time PCR方法检测不同月龄(3、6、18和36周)小鼠成熟卵母细胞PARP-2基因的mRNA的表达。结果在3周小鼠成熟卵母细胞中未见PARP-2mRNA的表达。在6、18和36周龄组小鼠成熟卵母细胞中均有PARP-2 mRNA的表达,其中PARP-2基因的mRNA水平在6周龄成熟小鼠卵母细胞中表达最低,到18周龄小鼠卵母细胞中表达最高,在36周龄下降。结论小鼠成熟卵母细胞中PARP-2基因的mRNA表达随着小鼠月龄的变化而变化,与小鼠的生育能力具有相关性。

RNAi构建parp-1基因低表达的石英恶性转化细胞模型

目的构建多聚腺苷酸二磷酸核糖聚合酶-1〔poly(ADP-ribose)polymerase-1,PARP-1〕基因低表达的石英恶性转化人支气管上皮细胞(M-16HBE)模型。方法利用RNA干扰(RNA interferencing,RNAi)技术建立parp-1基因低表达的M-16HBE模型;采用反转录PCR(reverse transcription-PCR,RT-PCR)法检测不同组别(空白对照组、阴性对照组和质粒转染组)M-16HBE的parp-1基因mRNA表达情况;应用MTT方法检测细胞的增生活性;应用流式细胞术检测细胞周期的变化情况。结果质粒转染组M-16HBE的parp-1基因mRNA表达水平较空白对照组及阴性对照组降低,差异有统计学意义(P<0.05),表达量约为正常细胞的45%;阴性对照组与空白对照组M-16HBE的parp-1基因mRNA表达量相比,差异无统计学意义(P>0.05)。与空白对照组相比,质粒转染细胞的增生能力显著增强,S期细胞比例升高了7.8%,G2期细胞比例下降了5.8%,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 Parp-1基因低表达M-16HBE模型构建成功。

二苯乙烯苷对氧化诱导内皮细胞凋亡及Caspase-3和PARP表达的影响

为研究二苯乙烯苷对过氧化氢(H2O2)诱导人脐静脉内皮细胞凋亡的影响并初步探讨二苯乙烯苷抗凋亡的可能机制,采用不同浓度H2O2和二苯乙烯苷处理内皮细胞24 h,以MTT法检测细胞生长活力、Hoechst33258染色观察细胞形态、流式细胞仪检测凋亡率等方法筛选造模内皮细胞凋亡的H2O2浓度和二苯乙烯苷最佳的抗内皮细胞凋亡作用浓度.RT-PCR、Western-blot分别检测Caspase-3、PARP mRNA及蛋白质的表达.结果发现,与空白对照组相比,300μmol/L H2O2作用后,内皮细胞增殖明显受到抑制,Hoechst33258染色可见大量凋亡细胞,细胞凋亡率显著增加,流式细胞仪检测出明显的凋亡峰,Caspase-3和多聚腺苷酸二磷酸核糖基聚合酶(PARP)的表达量显著增加.经二苯乙烯苷处理后,随着二苯乙烯苷浓度增加,细胞的增殖率随之增加,凋亡细胞数减少,凋亡率逐渐降低,与H2O2组比较,10μmol/L的二苯乙烯苷能够显著提高细胞增殖率,降低细胞凋亡率,并显著减少Caspase-3和PARP表达.以上结果表明,二苯乙烯苷能够抑制由H2O2诱导的人脐静脉内皮细胞凋亡,增加细胞生长活性,降低细胞凋亡率,其作用机制可能与下调Caspase-3和多聚腺苷酸二磷酸核糖基聚合酶(PARP)的表达有关.

PARP的生物学与病理学功能

PARP是真核细胞内具有多聚腺苷酸二磷酸核糖基(PAR)催化活性的蛋白酶,目前发现18个具有该活性的蛋白.多聚腺苷酸二磷酸核糖基化反应是细胞内进行的翻译后修饰,该修饰作用于许多蛋白,涉及到染色体的稳定,DNA损伤修复,基因转录,细胞的增长,死亡和凋亡等方面.在生理病理方面与炎症,肿瘤,衰老等疾病相关联.本文针对以上方面进行了总结和讨论.

消栓肠溶胶囊对大脑中动脉栓塞大鼠远隔脑区星形胶质细胞活化及凋亡蛋白表达的影响

目的观察消栓肠溶胶囊对大脑中动脉栓塞大鼠远隔脑区星形胶质细胞活化及凋亡蛋白半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(cystein-aspartate protease 3,Caspase-3)及其底物多聚腺苷酸二磷酸核糖聚合酶(poly ADP-ribose polymerase,PARP)表达的影响。方法线栓法建立大脑中动脉栓塞模型,雄性SD大鼠90只随机分成假手术组、模型组、消栓肠溶胶囊(420 mg/kg、140 mg/kg、47 mg/kg)组、阳性对照药脑心通胶囊(600 mg/kg)组,每组15只,连续灌胃给药15 d,每天给药1次。分别在术后3 d、7 d、12 d、15 d检测前肢抓握力量;术后15 d采用免疫荧光染色结合图像分析技术检测海马胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)和Caspase-3、PARP的表达。结果大鼠大脑中动脉栓塞第3天、第7天、第12天、第15天前肢抓握力量均较同时间段假手术组大鼠减小,差异具有显著性(P<0.01);大脑中动脉栓塞第15天,大鼠远隔脑区海马GFAP、PARP表达增强,Caspase-3阳性细胞增多,差异均较假手术组明显(P<0.05)。消栓肠溶胶囊420 mg/kg治疗后,大脑中动脉栓塞第7天大鼠前肢抓握力量增加;消栓肠溶胶囊140 mg/kg组大鼠大脑中动脉栓塞第12天前肢抓握力量增强;大脑中动脉栓塞第15天,消栓肠溶胶囊420 mg/kg、140 mg/kg、47 mg/kg组和脑心通胶囊组大鼠前肢抓握力量均提高,差异均较模型组显著(P<0.05)。和模型组相比,消栓肠溶胶囊(420 mg/kg、140 mg/kg、47mg/kg)组大鼠海马GFAP、PARP阳性表达强度降低(P<0.01),Caspase-3阳性细胞数减少,差异均较模型组明显(P<0.05或P<0.01)。脑心通胶囊也可明显下调大鼠海马GFAP、PARP表达,和模型组比较差异具有显著性(P<0.01)。结论消栓肠溶胶囊可通过抑制星形胶质细胞异常活化,抑制Caspase-3、PARP凋亡信号分子激活,保护缺血远隔脑区。

DIDS对SIN-1诱导大鼠海马神经元凋亡及PARP-1/AIF表达的影响

目的观察氯通道阻断剂4,4'-二异硫氰基芪-2,2'-二磺酸(DIDS)对NO诱导的大鼠离体海马神经元凋亡的保护作用。方法离体培养12 d的SD大鼠海马神经元,随机分为正常对照组、3-吗啡斯德酮亚胺(3-morpholinosyndnomine,SIN-1)处理组、SIN-1+DIDS组。对各组神经元分别在相应的时间点用MTT法测定细胞生存率、Hoechst 33258测定凋亡百分数、免疫化学荧光分析检测凋亡信号蛋白PARP-1/AIF的变化、Western blot分析凋亡蛋白Caspase-3的变化。结果 DIDS呈剂量依赖性地抑制SIN-1诱导的神经元损伤,减少凋亡发生数目,并能抑制损伤所引起的Caspase-3的激活、削弱PARP-1/AIF的表达。结论氯通道可能参与了NO诱导的海马神经元损伤,氯通道阻断剂DIDS的保护作用可能与削弱PARP-1/AIF的表达有关。

PARP-1体外活性测定方法的建立及其应用

建立PARP-1的体外活性测定方法并对84个具有潜在PARP抑制活性的化合物进行筛选。从Sf9昆虫细胞中提取酶液,以NAD+为底物,DNA为激活剂,建立PARP-1的活性测定方法;以高通量技术参数评价此方法,用已知PARP抑制剂进行验证,并以此方法进行PARP抑制剂的筛选。结果显示,确定的酶促反应体系为:12.5 nmol/L NAD+,15μg/m L DNA,6.25×10-4U PARP-1。评价Z'因子为0.76,S/B值为3.58。基于此模型筛出47个化合物在浓度7.4μmol/L时对PARP-1的抑制率达到60%以上。表明所建立的PARP-1活性测定方法,适用于PARP-1抑制剂的高通量筛选。

白藜芦醇通过激活Caspase-3和PARP-1影响前列腺癌细胞侵袭和凋亡

目的探究白藜芦醇对前列腺癌细胞侵袭和凋亡的影响及其分子机制。方法将前列腺癌细胞分为5组,命名为对照组、Z-DEVD-FMK组、Res低剂量组、Res中剂量组、Res高剂量组,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测PC-3细胞中Caspase-3和PARP-1 mRNA表达情况,分别采用Transwell小室和流式细胞仪检测PC-3细胞侵袭和凋亡情况,蛋白免疫印迹(Western blot)检测PC-3细胞中MMP-9表达情况。结果 Res组PC-3细胞中Caspase-3和PARP-1 mRNA表达水平显著高于对照组和Z-DEVD-FMK组(P<0.05),呈剂量依赖性;Res组PC-3细胞侵袭能力显著低于对照组和Z-DEVD-FMK组(P<0.05),呈剂量依赖性;Res组PC-3细胞凋亡率显著高于对照组和Z-DEVD-FMK组(P<0.05),呈剂量依赖性;Res组PC-3细胞中MMP-9表达水平显著低于对照组和Z-DEVD-FMK组(P<0.05),呈剂量依赖性。结论白藜芦醇能够上调Caspase-3和PARP的表达,进而诱导前列腺癌细胞凋亡,为前列腺癌的临床治疗提供一定的理论依据。