斑马鱼叶酸多聚谷氨酸合成酶基因的生物信息学特征及胚胎发育表达

目的探索斑马鱼叶酸多聚谷氨酸合成酶(FPGS)的生物信息学特征及在胚胎发育中的表达模式。方法利用Ensemble数据库及ClustalW程序进行序列比对,分析斑马鱼与哺乳动物FPGS蛋白之间的氨基酸同源性;利用系统发育树分析不同物种间fpgs基因的保守性;运用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)分析fpgs基因在斑马鱼重要器官及胚胎早期发育中的表达;运用整胚原位杂交技术检测野生型斑马鱼fpgsmRNA的表达。结果生物信息学分析显示,斑马鱼FPGS蛋白在进化上与哺乳动物同源物高度保守。RT-PCR结果显示,斑马鱼fpgs基因不仅在胚胎的各个发育阶段均有表达,且在成鱼的脑、肝和胃组织中高表达。原位杂交结果显示,fpgs基因在斑马鱼胚胎4细胞期广泛表达,而在尾芽期开始仅在卵黄合体细胞层中表达;在斑马鱼胚胎20体节期,fpgs在产生初级造血祖细胞的中间细胞团、眼睛和后脑区域呈现特异性表达;从斑马鱼胚胎受精后48~96 h,fpgs基因在其肝脏及端脑与后脑的交界处特异性表达。结论斑马鱼的FPGS蛋白与哺乳动物同源物高度保守,且fpgs基因在斑马鱼发育中的初级造血区、肝脏、后脑区及眼睛特异性表达,提示该基因在这些组织的发育中可能发挥着重要作用。

超高效液相串联质谱测定四棱豆中总叶酸和多聚谷氨酸叶酸的含量

本文建立了超高液相色谱串联三重四级杆质谱(UPLC-MS/MS)定量测定四棱豆中总叶酸的含量和多聚谷氨酸叶酸分布的方法。四棱豆在缓冲液中蒸煮灭活内源多聚谷氨酸水解酶和破坏叶酸结合蛋白,使结合态叶酸变成游离态,过滤得提取液。将提取的各种形式叶酸转化为5-甲基四氢蝶酰多聚谷氨酸(5MTHFGlun),并经C18萃取小柱除盐后,采用UPLC分离不同形态的5MTHFGlun,电喷雾正离子电离模式(ESI+)和多反应监控扫描模式(MRM)测定不同形态的5MTHFGlun含量。方法采用Pte Glu(1-6)作为内标,5MTHFGlu(1-6)外标进行定量。该方法灵敏度高,最低检测限(LOD)为40~1133 fmol,最低定量限(LOQ)为120~3400 fmol,精密度为0.5%~6.8%,平均回收率为43%。研究发现四棱豆中多聚谷氨酸叶酸的主要形式是蝶酰五谷氨酸,占叶酸总量的65%;其次是蝶酰五谷氨酸占30%;其它形式只占5%;总叶酸含量为1.1μmol/100 g,其含量显著高于菠菜和西兰花等蔬菜。该方法快捷、灵敏、精确,适用于蔬菜中叶酸的分析。