Fonsecaea monophora多聚酮合酶基因的扩增及敲除载体的构建

目的扩增Fonsecaea monophora中控制黑素合成的多聚酮合酶(polyketide synthases,PKS)基因并测序,构建PKS基因敲除载体。方法扩增PKS基因,根据测序结果设计引物,从Fonsecaea monophora基因组DNA扩增PKS基因5’-同源臂和3’-同源臂,从质粒pBHt1中扩增潮霉素B抗性标记基因(hyg),最后将各片段插入载体PDHt/sk中。结果测序得到5 389bp大小的PKS基因序列,构建了PKS基因的敲除载体,用酶切及测序等方法鉴定载体构建成功。结论成功构建Fonsecaea monophora PKS基因敲除载体,为研究PKS基因及黑素的生物学功能奠定了良好的基础。

紫菜外生细菌抑菌活性及其多聚酮合酶(PKSI)基因筛选

【目的】基于紫菜外生细菌抑菌活性的研究,本文对具有广谱抑菌活性的菌株进行了多聚酮合酶(Polyketide synthase I,PKSI)基因的筛选,以期获得PKSI阳性菌株及探讨紫菜藻际微生物区系细菌的拮抗机制与PKSI途径的关系。【方法】利用琼脂柱法筛选出具广谱抑菌活性的菌株31株,以其基因组DNA为模板,设计引物扩增酮基合成酶(Ketosynthase,KS)片段基因并将其克隆到pMD19-T Vector,筛选出PKS I阳性菌,进行16S rDNA测序分析。【结果】紫菜外生细菌表现出广谱抑菌性。从温州病烂紫菜外生菌中筛选出3株具强抑菌活性的PKS I阳性菌,BLAST比对结果显示:菌株WPhG3、WPySw1和WPySw2扩增得到PKSI的KS结构域核苷酸序列所对应的氨基酸序列与Bacillus subtilis subsp.subtilis str.168(NP-389602)、Bacillus subtilis(ABR19776)和Aspergillus carbonarius(AAZ99721)的PKS I的KS结构域的同源性分别达到98%、99%和98%;16S rDNA系统发生学分析显示它们均与Bacillus的同源性最高。【结论】紫菜藻际微生物群落组成复杂,通过多条途径调节藻际微生物区系的平衡。PKS I途径可能是温州病烂紫菜外生菌Bacillus表现抑菌活性的一种方式。

非无菌培养的微小卡罗藻次生代谢产物的细胞毒及其宏基因组酮基合成酶基因的筛选

目的:检测微小卡罗藻(Karlodinium micrum)粗提物的细胞毒活性,筛选其KS基因。方法:非无菌条件培养微小卡罗藻,用乙酸乙酯提取其粗产物,以脐静脉内皮细胞(HUVEC)为目标细胞,测定粗提取物的细胞毒活性;运用分子生物学方法对多聚酮合酶(PKS)基因的酮基合成酶(KS)基因进行筛选,运用BLAST进行比对和系统发生树进行分析。结果:微小卡罗藻培养液粗产物具有细胞毒活性,IC50值为70.8μg/mL。KS基因筛选获得680 bp的片段,并经测序推导出其氨基酸序列,该氨基酸序列与纤维多囊菌和点型念珠蓝细菌KS域的氨基酸序列同源性分别为60%和57%。结论:首次从非无菌培养的微小卡罗藻中筛选到PKS中KS域基因片段,为从中分离聚酮类化合物提供了基因学的依据。

埃博霉素(Epothilones)的PKS/NRPS杂合基因簇

埃博霉素是由粘细菌纤维堆囊菌产生的一类具有促微管聚合活性的大环内酯类化合物。埃博霉素生物合成的多酶复合体是一个由多个功能模块组成 ,同时含有多聚酮合酶 (PKS)和非核糖体肽合成酶 (NRPS)的大操纵子。根据同位素标记试验结果和合成酶全基因簇功能的推测 ,埃博霉素的生物合成包括聚酮链的引发、链合成的起始和噻唑环的形成、链的延伸和转移、链合成的终止释放和环化、及产物的后修饰 5个阶段。埃博霉素的PKS NRPS杂合基因簇是开展组合生物合成研究的良好材料。

抗菌和细胞毒活性海洋细菌的筛选及其次生代谢基因证据

从不同海域的海水、海泥和海洋生物中分离海洋细菌,利用琼脂扩散法和MTT法对细菌培养液的乙酸乙酯提取物进行了抗菌和细胞毒活性筛选,并对具有细胞毒活性的细菌菌株进行了16SrRNA系统发生学分析和多聚酮合酶(PKSⅠ型)、非核糖体肽合成酶(NRPS)的筛选。结果显示,在分离到的346株海洋细菌中,42株细菌具有抗菌活性,12株具有细胞毒活性。对12株具有细胞毒活性的细菌菌株进行了16SrRNA系统发生学分析,它们分别属于Agrobacterium,Pseudoalteromons,Bacillus,Paracoccus,Rheinheimera,Aerococcus,Exiguobacterium和Alteromonas8个属。对这12株具有细胞毒活性的细菌菌株进行进一步的PKS和NRPS筛选,得到了4株含有PKSⅠ型的KS结构域或NPRS的A结构域的海洋细菌,为从聚酮和非核糖体肽等生物合成途径去深入研究其次生代谢产物提供了基因学的证据。

极地抗植物病原真菌活性菌株PKS和NRPS基因的克隆与分析

植物常见病原真菌尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)为指示菌,采用平板扩散法对实验室保藏的38株极地细菌进行了抑菌活性验证,并对其中活性较强的菌株进行了分子鉴定与系统发育分析及次级代谢产物合成功能基因(PKS和NRPS)的克隆与分析。结果表明,38株极地细菌中,13株具有明显的抗病原真菌活性;分子鉴定与系统发育分析表明,11株活性菌株属于Pseudomonas,1株属于Psychrobacter,1株属于Arthrobacter;对活性菌株PKS和NRPS基因的克隆与分析表明,从10株活性菌株克隆到12条NRPS A结构域基因片段,其中5株活性菌株同时含有PKS I型KS结构域基因片段。据此为从聚酮和非核糖体肽等生物合成途径深入研究活性菌株的次级代谢产物提供了基因学证据。