乙型肝炎病毒多聚酶基因YMDD变异与临床治疗反应

目的 了解深圳地区慢性乙型肝炎患者在长期拉米夫定治疗中HBV多聚酶基因YMDD变异的情况及其对治疗反应的影响。方法 对 10 0例拉米夫定治疗中 2 8例出现血清病毒核酸 (HBVDNA)阳性的患者 ,采用限制性片段长度多态性分析法 (PCR -RFLP)检测YMDD变异 ,并观察其血清HBVDNA及丙氨酸转氨酶 (ALT)水平。结果 10 0例中有 17例YMDD变异阳性 ,其中以YVDD(M5 5 0V)变异为主 ,占 64 7% (11/17) ,YIDD(M5 5 0I)变异为 3 5 3 % (6/17)。发生YMDD变异的患者均伴有HBVDNA及ALT水平反跳 ,1例住院患者停用拉米夫定后出现病情加重。结论 深圳地区慢性乙型肝炎患者在长期拉米夫定治疗中 (疗程 1年 ,10 0mg/d)HBV多聚酶基因YMDD变异率为 17 0 % (17/10 0 ) ,发生变异者较无变异者疗效降低 ,检测YMDD变异有助于监测疗效。

T7 RNA多聚酶基因的克隆、序列测定及其在E.coli中的表达

从 BL 2 1(DE3) E.coli菌株中以 PCR的方法扩增得到了与 T7RNA多聚酶 (T7RNA polymerase,T7pol)基因大小一致的 DNA片断。将 PCR产物纯化后直接克隆到 p GEM- T载体中 ,经酶切鉴定和 DNA序列分析表明克隆得到了正确的 T7pol基因。将 T7pol基因亚克隆入 p ET- 2 8b(+)中 ,构建得到原核表达质粒 p ET2 8T7。该质粒的 BL 2 1(DE3) p L ys S转化菌在 IPTG的诱导下可表达约 9880 0的蛋白 ,这与 T7pol的相对分子质量一致。将该质粒转化DH5 α、JM10 9、HB10 1、BL2 1(DE3)和 BL2 1(DE3) p L ys S等 5种不同的宿主菌 ,仅有转化 T7pol酶活性受到抑制的宿主菌 BL2 1(DE3) p L ys S才能得到转化子 ,而其余 4种 T7T7pol酶活性不受抑制的 E.coli宿主菌不能得到转化子。p ET2 8T7原核表达质粒这种仅能在 T7pol酶活性受到抑制的宿主菌中才能存活的现象说明本试验所克隆的 T7pol基因能正确表达出具有

多重半巢式聚合酶链反应检测巨细胞病毒DNA多聚酶基因

目的 :探讨多重半巢式聚合酶链反应 ( msn PCR)在研究巨细胞病毒 ( CMV) DNA多聚酶基因 ( UL -54)中的应用价值。方法 :从 8例心肺移植患者血标本中提取 DNA,以 CMV-UL 54为模板 ,自行设计 6条特异性引物 ,建立 msn PCR扩增系统。扩增产物在 DNA测序仪上自动测序。结果 :msn PCR能扩增出 42 7bp和 1 0 52 bp两条目的片段 ,扩增产物测序表明存在导致氨基酸改变的碱基有义突变。结论 :msn PCR扩增结合测序 ,可检测 CMV-UL 54的 7个功能区目片段中的碱基突变 ,msn PCR比普通 PCR更加省时和经济。

抗病毒治疗后CHB患者HBV多聚酶基因P区突变检测及分析

目的观察慢性乙型肝炎（CHB）患者多聚酶基因逆转录保守区（P区）突变情况，分析其相关因素。方法选择220例行核苷（酸）类似物抗病毒治疗的CHB患者，采用套式PCR方法扩增HBV多聚酶基因P区特异性片段，焦磷酸测序法检测相关位点突变情况，并分析性别、年龄与突变率的关系及联合位点突变情况。结果HBV基因P区突变位点包括173、180、181、184、202、204、236和250，其突变率依次为1．81％、22．72％、13．63％、5．90％、0．45％、34．09％、5．00％、1．36％；204位点突变率在男性显著高于女性（P〈0．01），180、181、236位点突变率无显著性别差异；180位点突变率在不同年龄组之间比较均有显著差异，204位点突变率在〈30岁者与41—50岁、51—60岁者间比较有显著差异（P〈0．05或0．01）；204位点联合180位点突变率为66．67％，181位点联合236位点突变率为36．67％。结论抗病毒治疗后CHB患者的HBV多聚酶基因P区突变主要集中在204、180位点，对抗病毒治疗耐药的HBV患者进行相关位点突变检测有利于指导临床治疗。

HBV耐拉米夫定多聚酶基因变异检测方法的建立

目的 建立一种简便、准确、实用的乙型肝炎病毒 (HBV)耐拉米夫定多聚酶基因变异检测方法。 方法 根据已公布的HBVDNA序列 ,在HBV多聚酶基因区设计并合成了两对寡核苷酸引物 ,其中一只为错配引物 ;应用巢式错配聚合酶链反应 (PCR)特异性扩增含有HBV多聚酶基因YMDD基序的片段 ,扩增产物用限制性内切酶 (NdeⅠ )酶切 ,琼脂糖凝胶电泳 ,观察酶切后目的片段的限制性片段长度多态性 (RFLP)图谱。部分标本进行DNA测序。 结果 (1)所建立的巢式错配PCR RFLP法 ,从DNA提取到酶切后电泳分析仅需要 11小时 ;灵敏度高 ,可以检测到 10 3 copies/ml的HBVDNA ;特异性强 ,结果准确 ,经DNA测序证实。 (2 )检测 2 0例长期服用拉米夫定的慢性乙型肝炎患者的系列血清 ,发现YMDD变异者 (45 % ) 9例 ,YMDD野毒株者 (5 5 % ) 11例 ,表明该法可有效地鉴别HBVYMDD野毒株与变异株。 结论 本实验所建立的用于检测HBV耐拉米夫定多聚酶基因变异的巢式错配PCR RFLP方法简单、敏感、特异 ,适用于一般实验室及大规模的人群调查。

未接受抗病毒治疗的慢性乙型肝炎患者多聚酶P基因YMDD变异检测

目的 了解未经拉米夫定及干扰素抗病毒治疗的慢性乙型肝炎患者中HBV多聚酶YMDD变异情况。方法 应用错配PCR扩增方法检测病人血清HBV的YMDD位点 ,选择 65例病史超过半年以上、肝功能异常、HBVDNA阳性的慢性乙型肝炎患者。结果 在 65例患者中 ,YMDD变异阳性 6例 ( 9.0 7%) ,阴性 5 9例 ,6例变异中 2例为YIDD阳性 ,其中 1例为YMDD野毒株和变异株混合存在 ,4例为YVDD阳性 ,其中 1例为YMDD野毒株和变异株混合存在。结论 本检测方法简便、实用 ,在未经抗病毒治疗的慢性乙型肝炎患者中可存在YMDD变异株 ,其与野生株一样是自然存在的。

核苷类似物干预下慢性乙型病毒性肝炎患者HBV多聚酶区基因突变检测分析

目的研究重庆地区慢性乙型病毒性肝炎(慢乙肝)患者核苷类似物治疗过程中HBV多聚酶区(P)基因变异情况。方法选取350例接受核苷类似物治疗后出现病毒学突破的慢乙肝患者作为研究对象,采用PCR产物直接测序法,分析HBV P区基因变异发生情况。结果 350例患者中有124例检测出基因型耐药,C基因型在基因型耐药患者中所占比例显著高于无基因型耐药患者的比例(P<0.001)。突变类型共计23种,其中以rtM204I突变最多见(41,33.1%),其次为rtL180M/rtM204V联合突变(25,20.1%)。主要核苷类似物耐药所占比例最高为拉米夫定(60.5%),其次为阿德福韦(21.8%)及替比夫定(16.1%)。结论 HBV P区基因耐药的氨基酸突变复杂多变,rtM204V/I突变最为常见。基因C型患者更易出现基因型耐药。

烟草靶斑病菌内切多聚半乳糖醛酸酶基因endoPGs的克隆及表达特征分析

【目的】内切多聚半乳糖醛酸酶(endo polygalacturonases,endoPGs)是重要的致病因子之一。论文从烟草靶斑病菌(Rhizoctonia solani)强致病力菌株YC-9和弱致病菌株LF-2中克隆该致病基因,分析比较该基因的序列特征、进化关系和表达特性,研究其在与烟草互作过程的致病作用。【方法】通过比较GenBank中不同植物病原真菌的endoPGs序列设计简并引物,首先获得菌株YC-9及LF-2的endoPGs基因片段,再采用RACE技术克隆获得其cDNA全长序列;生物信息学分析比较其保守结构域及序列特征;采用MEGA 4.0软件构建endoPGs的系统进化树;通过real-time RT-PCR技术对强致病力菌株YC-9及弱致病力菌株LF-2的endoPGs与烟草K326互作的表达特性进行研究。【结果】克隆获得了烟草靶斑病菌强致病力菌株YC-9和弱致病力菌株LF-2的endoPGs的cDNA全长序列,分别命名为endoPG1和endoPG2,开放阅读框(ORF)长度均为1 086 bp,编码361个氨基酸;比较分析表明endoPG1和endoPG2的推测蛋白均具有PLNO3003基因家族保守结构域,其跨膜结构间存在差异;成功构建了该基因系统进化树,结果表明来自烟草靶斑病菌的endoPGs构成独立分支,且烟草靶斑病菌endoPG1及endoPG2同源关系最近;real-time RT-PCR表达特性分析结果显示,靶斑病菌endoPG1和endoPG2与烟草互作(接种)之后该基因的表达与未互作(不接种)的对照样品相比均呈明显上调趋势,同时endoPG1表达迅速且高于endoPG2。【结论】烟草靶斑病菌强致病力菌株YC-9及弱致病力菌株LF-2的内切多聚半乳糖醛酸酶基因均具有PLNO3003基因家族的保守结构域,其推测蛋白的跨膜结构间存在差异,该推测蛋白与烟草靶斑病菌同源关系最近,且endoPG1和endoPG2的推测蛋白的同源性最高;内切多聚半乳糖醛酸酶基因的表达受与烟草互作的诱导,在不同致病力菌株中存在明显差异。

甜瓜多聚半乳糖醛酸酶基因cDNA的克隆和序列分析

以甜瓜品种河套蜜瓜成熟果实mRNA为模板,经反转录合成和PCR扩增得到编码多聚半乳糖醛酸酶(Polygalacturonase,PG)基因全长cDNA,将其克隆于pUC19质粒中获得重组质粒pCMPG.此cDNA长1183bp,包括一个393个氨基酸残基组成的开放阅读框架.与已报道的甜瓜PG基因cDNA核苷酸序列比较同源性为99.3%,相应的氨基酸的同源性为98.5%.

草莓多聚半乳糖醛酸酶基因RNAi植物表达载体的构建及表达鉴定

从草莓叶片中克隆到多聚半乳糖醛酸酶基因的1个281bp片断,构建含该正、反向互补重复序列DNA片段的中间载体,经测序证实连接正确后,克隆到植物表达载体p2300121中的GUS基因位置并经双酶切证实,得到RNAi表达载体。采用直接转化法将PG2300121导入根癌农杆菌菌株EHA105,并用新构建的工程菌对普通烟草进行了遗传转化研究。在Kanamycin选择压力下获得的烟草转化不定芽和完整植株,经PCR方法鉴定,证实了该基因已导入烟草基因组中。

Fonsecaea monophora多聚酮合酶基因的扩增及敲除载体的构建

目的扩增Fonsecaea monophora中控制黑素合成的多聚酮合酶(polyketide synthases,PKS)基因并测序,构建PKS基因敲除载体。方法扩增PKS基因,根据测序结果设计引物,从Fonsecaea monophora基因组DNA扩增PKS基因5’-同源臂和3’-同源臂,从质粒pBHt1中扩增潮霉素B抗性标记基因(hyg),最后将各片段插入载体PDHt/sk中。结果测序得到5 389bp大小的PKS基因序列,构建了PKS基因的敲除载体,用酶切及测序等方法鉴定载体构建成功。结论成功构建Fonsecaea monophora PKS基因敲除载体,为研究PKS基因及黑素的生物学功能奠定了良好的基础。

核盘菌多聚半乳糖醛酸酶基因克隆及诱饵蛋白表达载体构建

真菌多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(PG IP)能够特异性识别真菌分泌的降解植物细胞壁的主要物质多聚半乳糖醛酸酶(PG)并抑制其活性。目前,酵母双杂交技术是快速、有效获取植物PG IP的主要途径,而其前提是要获得真菌PG的酵母诱饵载体。本研究以核盘菌的PG cDNA为模板,经PCR扩增获得1 125 bp片断,进一步将其克隆到pEASY-T1载体上。以克隆了目的基因的pEASY-T1质粒为模板,用含NdeⅠ和SalⅠ位点的引物对PG-F2/PG-R2扩增获得1 125 bp大小的目的片段,将其连接到pEASY-T1上生成pEASY-PG。用NdeⅠ和SalⅠ双酶切pEASY-PG,回收1 125 bp片段并连接到诱饵载体pGBKT7相应的酶切位点上,转化大肠杆菌菌株DH5α。在含有卡那青霉素的LB平板上筛选获得重组质粒。经NdeⅠ和SalⅠ双酶切后获得预期的1 125 bp DNA片段,表明诱饵蛋白载体pGBKT7-PG6构建成功。应用醋酸锂介导法将pGBKT7-PG6转化酵母菌株Y187,经激活培养基上培养检测,未发现蓝色菌落,表明酵母转化子自身不具有自激活功能,可用于大规模筛选经核盘菌诱导的cDNA表达文库。

果实成熟与多聚半乳糖醛酸酶基因的研究进展

对与果实成熟相关基因多聚半乳糖醛酸酶 (PG)基因的筛选、鉴定。

利用多聚半乳糖醛酸酶反义基因转化选育耐贮中国樱桃

目的:利用多聚半乳糖醛酸酶(PG)反义基因转化选育耐贮中国樱桃。方法:以2个中国樱桃品种为实验材料,研究了激素浓度、叶片生理状态、光照条件等因素对叶片再生的影响,建立了中国樱桃叶片培养高频再生体系。以继代生长40d左右的组培苗顶部充分展开的叶片为外植体,整片放在含6-BA1.5mg/L、IBA0.5mg/L、KT0.5mg/L和腺嘌呤30mg/L的MS分化培养基上,在适宜的光照和处理条件下,芽分化率高达80%以上。以上述叶片为受体,用含有PG反义基因的农杆菌进行侵染。结果:经PCR和PCR-Southern检测证明PG反义基因已整合进樱桃核基因组中。结论:以培养的叶片为受体,用农杆菌介导法进行转基因在中国樱桃上是可行的。

苯中毒与多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶假基因多态等的相关性研究

目的探讨慢性苯中毒与微核率、姊妹染色单体互换(SCE)、多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶(PARP)假基因多态的关系,为寻找苯中毒的易感者提供依据.方法对33例苯中毒病例与83例对照组进行微核率、SCE、PARP假基因多态的测定,并对其分布进行统计学分析.结果苯中毒病人外周血淋巴细胞微核率为0‰～6‰、中位数为2‰,对照组0‰～3‰,中位数为1‰;苯中毒病人SCE率为(6.31±1.26)次/细胞,对照组(5.59±0.18)次/细胞;苯中毒组与对照组微核率、SCE率差异有显著性(P＜0.05);苯中毒组和对照组的PARP假基因中B基因频率分别为0.104和0.116,苯中毒组与对照组PARP假基因多态分布一致(P＞0.05).结论慢性苯中毒可引起微核率、SCE的增高,未发现PARP假基因多态与慢性苯中毒有关联.

阿德福韦酯耐药株感染者乙型肝炎病毒基因型和多聚酶区基因变异分析

目的了解阿德福韦酯耐药株感染者HBV基因型、多聚酶区基因变异位点和变异类型,并分析HBV基因型和多聚酶区基因变异的关系。方法应用PCR扩增和直接测序法检测73例阿德福韦酯耐药患者HBV基因型、多聚酶基因区变异位点、病毒载量。结果 73例阿德福韦酯耐药株感染者中,HBV B基因型占35.6%,C型占64.4%;HBV多聚酶基因区基因突变位点主要以rtA181V/T(39.8%)、rtN236T(31.5%)为多见,rtA181V/T+rtN236T(20.5%),其他(8.2%);其中rtA181V/T位点变异中B型占10.3%,C型占89.7%;rtN236T位点变异中B型占78.3%,C型占21.7%。rtA181V/T+rtN236T位点变异B型占26.7%,C型占73.3%;基因型B和C的病毒载量分别为(6.38±1.24)lg和(6.27±1.10)lg拷贝/毫升。结论阿德福韦酯耐药株感染者HBV基因型主要为B型和C型;HBV多聚酶区基因突变位点主要为rtA181V/T和rtN236T,基因型与多聚酶区基因突变位点之间有一定相关性。C基因型易发生rtA181V/T变异,B基因型多出现rtN236T变异。C基因型比B基因型更易出现rtA181V/T+rtN236T双突变,可能与C基因型容易导致的严重的肝脏疾病有关,基因型与病毒载量之间无相关性。

龙眼多聚半乳糖醛酸酶基因DlPG1表达模式与幼果脱落关系研究

从龙眼中分离获得1个多聚半乳糖醛酸酶(PG)基因,命名为DlPG1。DlPG1基因与多种物种PG基因氨基酸序列有较高的同源性,其中与同属于无患子科的荔枝同源性最高,为95%,且与荔枝的亲缘关系最近。DlPG1基因包含PG基因特有4个保守区中的3个,DlPG1属于E进化支PG基因家族成员。环剥摘叶处理可以显著促进龙眼幼果脱落,对照累积落果率为6.12%,处理为89.85%,相对落果率高峰出现在处理后第5天。处理的离区DlPG1基因表达量始终高于对照,且表达量高峰出现在处理后第4天。基因表达量的高峰早于相对落果率高峰出现,据此推测,DlPG1基因可能是调控龙眼幼果脱落的关键基因。截至目前,DlPG1基因是首例在龙眼中发现的属于E进化支的可能与器官脱落相关的PG基因。

甜瓜多聚半乳糖醛酸酶(PG)基因反义表达载体的构建

本实验用设计好的两条 75bp的长引物进行PCR反应 ,扩增出甜瓜PG1基因的 12 8bp的片段 ,将其克隆到pMD18-T载体中 ,筛选反向克隆 ,然后将其反向构建到植物表达载体 pUC38-ACC的CaMV35S启动子和TMV增强子“Ω”的下游 ,构建成反义表达载体 pUC38-PG。用PCR鉴定重组子 ,并经序列分析证明获得含有反向插入PG基因片段的植物表达载体 ,为用花粉管法将其导入河套蜜瓜 。

耐拉米夫定乙型肝炎病毒变异株全基因组克隆及鉴定

目的:扩增并克隆耐拉米夫定乙型肝炎病毒(HBV)变异株全基因组DNA,为构建含双体HBV YMDDDNA质粒和HBV YMDD变异株细胞模型及研究药物筛选奠定基础。方法:从一名耐拉米夫定的慢性乙型肝炎病人血清中提取HBV病毒DNA,用错配PCR结合限制性片段长度多态性(RFLP)进行变异分析,然后采用PCR方法在HBV负链开环缺口处及基因组中单一酶切点(SpeⅠ)处,设计两对引物从两个方向分别扩增1.15 kb和2.05 kb的单链及双链DNA区,利用基因重组技术,将两片连接后克隆至质粒pcDNA3.1-中,再进行DNA序列测定。结果:错配PCR结合RFLP分析证实该病毒存在YVDD变异,通过两段法克隆出HBV全基因组,经序列分析所得为HBV YMDD变异株全基因组。结论:成功克隆出HBV YMDD变异株全基因组。