毛果杨多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白家族PtPGIP的生物信息学分析

植物多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(Polygalacturonase-inhibiting protein,PGIP)可特异性识别病原菌分泌的多聚半乳糖醛酸酶,从而抑制病原菌对植物细胞壁重要成分——果胶的降解,以增强植物病原菌抗性。为探明模式树种杨树PGIP抗病机制,对毛果杨PGIP(PtPGIP)家族成员进行鉴定,以及对蛋白质理化性质和结构、系统进化、基因表达模式进行分析。结果表明,毛果杨基因组中鉴定到4个PtPGIP基因,其中,PtPGIP1和PtPGI2位于6号染色体串联重复,PtPGIP3和PtPGIP4位于16号染色体串联重复;PtPGIP1是假基因,PtPGIP2、PtPGIP3、PtPGIP4具有完整的PGIP蛋白结构域。PtPGIP均为疏水蛋白,具有良好的脂溶性,且具有3~7个N-糖基化位点。亚细胞定位预测表明,其可能定位于细胞外。除PtPGIP1以外,PtPGIP2、PtPGIP3、PtPGIP4蛋白均包含10个LRR片段,LRR中的保守序列xxLxLxx及蛋白质分子对接均表现出差异性。PtPGIP基因的表达具有组织特异性,PtPGIP1基因在各个组织部位的表达水平均较低,PtPGIP2和PtPGIP4基因在根、幼苗、花序中的表达量高于叶片,尤其是PtPGIP2基因在花序中的表达量最高,说明毛果杨PGIP基因家族发生了功能分化,使其在应对多种逆境胁迫中发挥重要作用。

中国HIV-1 B／C重组毒株不同阶段感染者多聚酶蛋白特异性T淋巴细胞反应的研究

目的研究中国主要流行的HIV-1 B／C重组毒株不同时期感染者多聚酶蛋白（Pol）特异性T淋巴细胞反应特征并确定主要识别的免疫优势区域。方法本研究以11例感染时间〈18个月和25例感染时间〉3年的HIV-1 B／C重组毒株感染者为研究对象，以10例HIV-1阴性健康人作为对照，应用酶联免疫斑点检测技术综合测定了针对覆盖HIV-1 pol基因的249条重叠多肽产生IFN-γ的特异性T淋巴细胞免疫反应。结果感染时间〈18个月感染者中有8（72．73％）名检测到了分泌IFN-γ的HIV-1特异性T淋巴细胞免疫反应，主要识别位于逆转录酶区、氨基酸位置为Pol 481～631内的Pol5581、Pol5582、Pol5587、Pol5609、Pol5610和Pol5615六条多肽，分泌IFN-γ的特异性T淋巴细胞反应广度与外周血CD4^＋T细胞数呈现明显负相关（P=0．0212，r=-0．762）；感染时间〉3年感染者中有15（60％）名检测到了分泌IFN-γ的HIV-1特异性T淋巴细胞免疫反应，主要识别位于逆转录酶区、氨基酸位置为Pol 241～295内的Pol 5521、Pol 5525、Pol 5526、Pol 5531四条多肽和Pol 708—722内的Pol 5638多肽，分泌IFN-γ的特异性T淋巴细胞反应强度与病毒载量呈现明显正相关（P=0．00695，r=0．660）；健康人对照组无阳性反应。结论中国HIV-1 B／C重组毒株不同阶段感染者主要识别多聚酶蛋白的不同区域。

桑树多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因MaPGIP1的克隆及功能分析

多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白（PGIP）是一种特异性结合和抑制真菌内切多聚半乳糖醛酸酶（endo-PG）活性的细胞壁结合蛋白。采用RT-PCR从嘉陵40（Morus atropurpurea Roxb.）果实中扩增PGIP基因c DNA,利用生物信息学的方法分析其编码蛋白的结构和功能。结果表明,嘉陵40PGIP开放阅读框全长1017 bp,编码338个氨基酸残基,被命名为MaPGIP1。MaPGIP1蛋白分子量37.9 k D,等电点为为6.65,信号肽为N端26个氨基酸残基,具有4个潜在的N-糖基化位点。MaPGIP1蛋白的核心区域由9个串联的LRRs基序组成。原核表达产物经SDS-PAGE分析,MaPGIP1蛋白以包涵体形式出现,Western blot证实了重组蛋白的特异性,经过Ni-NTA柱纯化和分步透析复性后获得可溶性蛋白,该蛋白能部分抑制果桑肥大性菌核病菌（Ciboria shiraiana）PG（Cs PG）活性,其最适pH值为4.5~5.0,最适温度30℃。抑菌试验结果表明,MaPGIP1蛋白在果桑肥大性菌核病菌菌丝侵染油菜叶片过程中具有一定的抑制效果。

植物多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白研究进展

多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(PGIP)是一种特异性结合并抑制真菌内切多聚半乳糖醛酸酶活性的细胞壁结合蛋白,迄今已在20多种植物体内发现了多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白。综述了国内外近几年有关PGIP基因研究、PGIP在植物抗病中的作用以及在抗病育种中应用的研究成果。

水稻多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因(Ospgip1)原核表达及编码产物生物信息学分析

据GenBank及相关文献提供的序列,从水稻基因组DNA中扩增出930 bp的Ospgip1基因完整开放阅读框。原核表达Ospgip1基因,表达产物能显著抑制水稻纹枯病菌菌丝生长及其多聚半乳糖醛酸酶活性。生物信息学分析表明,OsPGIP1为分子量32.8 kDa、pI 7.26的疏水蛋白,主要位于细胞壁(55.6%),信号肽切点位于第17和18位氨基酸之间。在N端和C端各有4个半胱氨酸残基,形成3个二硫键(第56和63位、第278和298位、第300和308位氨基酸)。以α-螺旋、β-折叠和不规则盘绕等为主要结构原件,具有典型的富含亮氨酸重复(LRR)结构。相比其他植物的PGIP,OsPGIP1缺少第7个LRR。在空间上9个LRR形成类似凹陷或裂隙结构,可能是其与病原菌多聚半乳糖醛酸酶互作的活性位点区。

水稻多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白家族OsPGIP结构及基因表达特征分析

植物多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(polygalacturonase-inhibitingprotein,PGIP)可特异性识别病原菌PG(polygalacturonase),从而提高植物的抗病能力。研究表明水稻中共存在7个OsPGIP基因,为明确OsPGIP家族的蛋白质结构及基因表达特征,从水稻cDNA中扩增各OsPGIP基因序列,经克隆、测序后进行生物信息学分析与蛋白质结构模拟,并测定其在生物逆境与非生物逆境胁迫下的表达量变化。经多序列比较与系统发育进化分析发现,相同或相近物种PGIP往往具有较高的相似性,虽然多数OsPGIP亲缘关系较近,但它们并不能完全聚类在一起。7个OsPGIP蛋白均具有一个信号肽和9~11个LRR片段,各LRR片段中均含有PGIP的特征结构域xxLxLxx。二级结构由α-螺旋、β-折叠和随机卷曲组成,且多以随机卷曲为主,这些二级结构以重复的随机卷曲—α-螺旋—随机卷曲—β-折叠组成线圈状结构,并按右手螺旋规则形成一个特定的凹面,负责OsPGIP与有害生物PG的互作。7个OsPGIP蛋白多较稳定,且均为疏水蛋白、脂溶性好、具有跨膜结构、定位于细胞外、有1到多个N-糖基化位点、在大肠杆菌中原核表达后基本不溶。经生物和非生物逆境处理后,水稻中不同OsPGIP基因的表达量上下调差异较大,但表达量总和明显上调,说明在逆境条件下水稻可通过调节自身OsPGIP基因的表达量,从而提高其抗逆性。

胡萝卜抗冻蛋白失去PGIP家族抑制多聚半乳糖醛酸酶的活性(英文)

含有LRR基序的胡萝卜抗冻蛋白虽然具有抗冻活性,但却属于植物PGIP家族。胡萝卜抗冻蛋白虽然在氨基酸序列上属于PGIP家族,但却失去了抑制外源真菌的PGase活性,并且获得了一个重要的活性——抑制冰晶的生长和重结晶。胡萝卜抗冻蛋白的这种活性的变化一直被认为是由于植物自身长期进化的结果,并认为最初的DcAFP也应当具有抑制PGase的活性。采用酵母双杂交来分析DcAFP是否还拥有PGIP的活性。通过RT-PCR克隆了真菌互格链格孢(Alternariaalternata)的PGase的cDNA,然后分别将PGase与DcAFP的完整编码框构建成酵母双杂交的捕获质粒和诱饵质粒,经过预实验表明两者都不能产生自激活作用,酵母双杂交实验表明两者不能产生相互作用,说明DcAFP完全失去了抑制PGase的活性,这种活性的丢失是由于位于β-螺旋上凹面的LRR基序中非保守的氨基酸残基发生了大量的碱性氨基酸的取代,导致结合的凹面从负电荷富集区变成了正电荷表面,从而不能通过静电作用与PGase的正电荷表面相结合。

西伯利亚蓼多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因的克隆及盐胁迫下的表达

根据西伯利亚蓼茎抑制消减文库(SSH)中获得的多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(polygalacturonase inhibiting proteins,PGIP)的EST序列,采用RACE技术在西伯利亚蓼消减库(SSH)成功克隆了PGIP蛋白基因的cDNA序列.该基因开放读码框为1020bp,编码339个氨基酸,具有1段24个残基的保守亮氨酸结构域.序列分析表明,该基因具有N端信号肽,具有PGIPs家族共有的典型保守区域,属PGIPs家族基因,命名为PsPGIP,GenBank登录号为ACD01043.荧光定量PCR分析表明,PsPGIP在西伯利亚蓼叶、茎、地下茎等器官中均有分布.在3%NaHCO3诱导表达中,该基因在叶中表达明显受盐胁迫的诱导.推测该基因在抵御盐胁迫伤害中起到了重要的作用.

多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(PGIP)的研究进展概述

多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(PGIP)在阻止病原物的侵入、发展,进而激活特定的防卫反应方面具有独特的作用。本文对PGIP的特性、差异表达、功能和检测进行了简单总结,并对今后PGIP研究的方向提出了自己的看法。

2个番木瓜多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因的克隆与分析

采用RT-PCR扩增获得了2个番木瓜果实多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(PGIP)基因cDNA和DNA全长序列,将其命名为CpPGIP1和CpPGIP2。CpPGIP1基因全长为984 bp,编码325个氨基酸;CpPGIP2基因全长为1 025 bp,编码326个氨基酸。2基因均没有内含子序列,核苷酸序列有66.54%的相似性,氨基酸序列有63.53%的相似性。2基因均含有植物PGIP基因编码蛋白特有的亮氨酸重复保守序列LXXLXXLXXLXLXXNXLXGXIPXX。对PGIP基因在不同成熟度番木瓜果实表达量分析发现,2基因4个时期均有表达,而且基本呈现同一表达趋势,绿色期表达量最高,随着果实成熟表达量逐渐降低。

棉花多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因克隆、序列及表达谱分析

植物的多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(PGIPs)在植物的抵抗疾病机制中起着重要作用,能够高效、专一的结合病原体侵染时分泌的多聚半乳糖醛酸酶,抑制其活性。克隆了棉花(苏棉9号)的一段长993bpPGIP基因,命名为GhPGIP1,它能够编码一段长330个氨基酸残基,分子量与等电点分别为37.0kDa与8.30的蛋白质。核酸和蛋白质序列与其他9个物种的同源性分别为65.6%～70.3%和63.4%～68.6%。蛋白GhPGIP1有10个N端、C端半胱氨酸残基,6个可能的N糖基化位点和5个保守的亮氨酸重复结构域(LRR)。在所有的保守LRR域中,L是高度保守的。半定量RT-PCR试验结果显示,GhPGIP1在棉花的根、茎、叶中均表达,其中以叶中表达量最多。

多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白抗血清的制备及鉴定

用电泳纯的小麦多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白免疫新西兰雄兔,获得了特异性强,效价较高的小麦.多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白抗血清.用此抗血清采用Dot—immunobinding assay,对流免疫电泳二种方法测定PGIP的检出限量,由此建立了多聚半糖醛酸酶抑制蛋白的Dot—immunobinding检测方法,并对制备该抗血清的意义予以讨论.

苹果多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白的分离纯化

以膨大期的富士苹果果皮为材料,通过匀浆、硫酸铵沉淀、透析、聚乙二醇6000浓缩、CM-SephadexC-50离子交换柱和Sephadex G-100分子筛凝胶过滤层析分离纯化出苹果多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白。用还原糖法测定其具有抑制多聚半乳糖醛酸酶活性,bradford法进行定量,经非连续SDS-PAGE分析为电泳纯,根据标准蛋白鉴定其亚基的分子量为41 kD。为苹果PGIP的纯化建立了一种有效的方法。

小麦多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白的部分结构

为了弄清小麦多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白 (polygalacturonase inhibitingprotein ,PGIP)的作用机制 ,并为其在基因工程中的应用提供依据 ,对其结构进行了研究 .用Edman降解法测得小麦PGIP的N端序列为Lys Pro Leu Leu Thr Lys Ile Thr Lys Gly Ala Ala Ser Thr .用CD谱研究其二级结构 ,发现小麦PGIP天然态含有 4 3 7%的 β折叠和 13 1%的α螺旋 .酸碱和温度变性引起了二级结构改变 .不完全变性阶段 ,二级结构的变化表现为α螺旋无明显变化 ,β折叠遭到破坏 ;活性完全丧失阶段 ,β折叠变化很小 ,α螺旋含量明显减少 .用NR R(非还原 还原 )双向对角线SDS PAGE鉴定出小麦PGIP含有链内二硫键 .用去糖基化法确证了小麦PGIP的糖含量为 2 2 %.小麦PGIP与双子叶植物PGIP相比 ,一级结构差异较大 ,同源性由 36 %变为 9%;二级结构相似 ,都是高 β 折叠的蛋白 ;均具有链内二硫键 ;在糖含量上也相似 .研究结果为进一步弄清小麦PGIP作用机理打下了基础 ,同时对于植物抗赤霉病基因工程具有重要意义 .

小麦内切多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白N端序列测定及分析

单子叶植物小麦内切多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白 (PGIP)经分离纯化和电印迹后 ,进行了N端序列的测定 ,结果为 :Lys Pro Leu Leu Thr Lys Ⅰle Thr Lys Gly Ala Ala Ser Thr。已知的PGIP均属于双子叶植物 ,这些双子叶植物PGIPN端氨基酸序列同源性为 36% ,包括小麦PGIP的所有单、双子叶植物PGIPN端氨基酸序列同源性降低到 9%。

不同香蕉品种多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白活性的比较

植物多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(PGIP)是一种富含亮氨酸重复区域的蛋白质,能够非竞争性地抑制真菌的多聚半乳糖醛酸酶(PG)的活性。以目前生产上几个主要抗枯萎病的香蕉品种为材料,参照Gross的PGIP活性测定方法,通过测定了Musa AAA、Musa ABB、Musa ABB、Musa AA和Musa AAAB等不同细胞基因型的香蕉品种的PGIP活性,发现东莞大蕉(Musa ABB)的活性最高。通过对东莞大蕉根、假茎、叶不同部位的PGIP活性比较,发现假茎的活性最高。用香蕉枯萎病菌4号生理小种接种诱导东莞大蕉能明显提高PGIP活性,观察还发现东莞大蕉苗期PGIP的活性明显高于后期。

5种瓜类植物多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白的诱导表达及活性测定

多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(PGIP)是一种富含亮氨酸重复单位的糖蛋白,能非竞争性地抑制真菌多聚半乳糖醛酸酶(PG)的活性,从而提高植物的抗病性。以黄瓜、苦瓜、冬瓜、节瓜和甜瓜幼苗为材料,研究PGIP的诱导表达特性及在不同组织中的含量差异。通过比较经孢子诱导、SA诱导和黑暗诱导的黄瓜幼苗中的PGIP的相对含量,发现经病原菌孢子悬浮液处理48 h时PGIP的表达量最高。对经孢子诱导48 h的黄瓜幼苗的根、茎、叶中的PGIP含量进行比较,发现茎中PGIP的相对含量最高。测定这5种瓜类的PGIP对6种尖孢镰刀菌粗PG的抑制作用,发现苦瓜PGIP的相对活性较高,并证实了不同的PGIP能够特异性地识别不同的PG,PGIP对不同PG存在着选择性抑制。

抗病蛋白CkPGIP1关键氨基酸突变增强对大丽轮枝菌的抑制作用

牛心朴子草多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(CkPGIP1)能有效抑制大丽轮枝菌多聚半乳糖醛酸酶(VdPG1)的活性,为了进一步提高CkPGIP1的抗病性,本研究从CkPGIP1定点突变入手,研究其突变增强对大丽轮枝菌的抑制作用。通过重叠延伸聚合酶链式反应(PCR)成功构建了CkPGIP1蛋白突变体T152VCkPGIP1、D202SCkPGIP1和I250KCkPGIP1,构建原核表达载体对CkPGIP1及其突变体进行体外诱导表达和纯化,用3,5-二硝基水杨酸(DNS)法和琼脂糖径向扩散法测定突变蛋白对大丽轮枝菌VdPG1的抑制作用。DNS法测定结果表明:突变蛋白能有效抑制VdPG1活性,且呈剂量依赖性,其中,D202SCkPGIP1对VdPG1的抑制效果显著,T152VCkPGIP1抑制效果次之,I250KCkPGIP1抑制作用不明显。琼脂糖径向扩散结果与DNS法的一致,其中经D202SCkPGIP1处理的VdPG1扩散直径缩小最多,表明其抑制活性最为显著。进一步研究发现,突变蛋白可以抑制大丽轮枝菌在棉花叶片上的扩展,进一步证实CkPGIP1关键氨基酸突变增强了对大丽轮枝菌的抑制作用。

岷江百合多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因及其启动子的克隆与分析

多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(PGIPs)在植物抵御病原菌侵染的过程中具有重要的作用。从尖孢镰刀菌抗性百合野生种岷江百合中分离得到一个PGIP基因及其启动子。LrPGIP的开放阅读框长度为1008 bp,编码一个含有335个氨基酸残基的蛋白质,并具有7个富含亮氨酸重复结构域。LrPGIP与油棕、椰子、林烟草的PGIP同源性较高,分别为91%,94%,86%,且与单子叶植物海枣、粗柄象腿蕉、油棕、椰子的PGIP蛋白亲缘关系更近。LrPGIP在根、茎、叶、花、鳞片中均有表达,在根中的表达量最高,在鳞片中的表达量最低。LrPGIP的表达水平受尖孢镰刀菌的诱导,在接种尖孢镰刀菌后72 h表达量最高。植物信号分子水杨酸、茉莉酸甲酯、乙烯利、过氧化氢均诱导LrPGIP表达。LrPGIP受乙烯利诱导后的表达量最高,茉莉酸甲酯次之。LrPGIP启动子片段的长度为706 bp,具有激素以及胁迫响应等多个顺式作用元件。将LrPGIP启动子驱动β-葡萄糖苷酸酶(GUS)基因的表达框转入烟草表达,G US活性明显受尖孢镰刀菌、交链格孢侵染以及氯化汞、氯化钠胁迫的诱导,同时还响应茉莉酸、水杨酸等防卫相关植物激素。氯化汞处理后的GUS活性上调幅度最大,其次是交链格孢和乙烯利。可见,LrPGIP启动子活性受植物激素、生物及非生物胁迫的诱导。上述结果表明,LrPGIP可能是岷江百合抵御尖孢镰刀菌侵染的重要抗病基因。

两个烟草多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因的克隆和表达分析

为了研究多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(PGIP)在烟草中的生物学功能,运用生物信息学方法,结合RT-PCR和SMART RACE技术,从烟草中克隆到2个多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(PGIP)基因c DNA和DNA全长序列,分别命名为Nt PGIP1(Gen Bank登录号:KF317203)和Nt PGIP2(Gen Bank登录号:KF317204)。Nt PGIP1基因全长为1 413 bp,编码338个氨基酸;Nt PGIP2基因全长为1 185 bp,编码329个氨基酸;两基因均没有内含子序列,核苷酸序列有50%的一致性,编码的氨基酸序列有54%的一致性。两基因编码蛋白均含有植物PGIP蛋白特有的重复保守序列LXXLXXLXXLXLXXNXLXGXIPXX。对PGIP基因在烟草不同组织表达量分析发现,两基因在根、茎、叶和芽中均有表达,其中均在茎中表达量最高,其次是根,叶中表达量很低。