聚合酶链反应-变性梯度凝胶电泳分析在毒死蜱胁迫下土壤真菌群落结构演替

为评价毒死蜱施用后对土壤真菌群落结构的影响,将农田土壤用终质量分数5mg/kg毒死蜱处理,同时以不施用毒死蜱为对照,定期采集土样进行毒死蜱残留测定并提取土壤DNA,采用基于染色体内转录间隔区(internaltranscribed spacers,ITS)ITS1f-GC/ITS2和28SrDNA U1-GC/U2引物对进行聚合酶链反应-变性梯度凝胶电泳,获得的指纹图谱利用Quantity One软件进行数字化分析,计算样品的多样性指数(H),并用Matlab软件进行主成分分析.ITS1f-GC/ITS2和U1-GC/U2扩增区域分析结果表明,毒死蜱施用后第7～60天内土壤真菌群落结构与对照相比发生很大改变,且毒死蜱处理样品真菌群落结构保持基本稳定,多样性指数明显提高;主成分分析显示,毒死蜱处理样品与对照明显分在2个不同的区域,充分表明毒死蜱对土壤真菌群落结构影响迅速且持久.

聚合酶链反应—变性梯度凝胶电泳技术研究梯田式人工湿地微生物群落动态变化

采用聚合酶链反应(PCR)—变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术对梯田式人工湿地(TTCW)和复合垂直流式人工湿地(IVCW)生活污水处理系统内的微生物群落结构的动态变化及其对生活污水处理效果的影响进行了对比研究。结果表明:(1)TTCW和IVCW对生活污水均具有较好处理效果,其COD去除率平均分别为76.2%和72.6%、TP去除率平均分别为90.7%和85.6%、NH4+-N去除率平均分别为65.2%和58.8%;TTCW增氧作用明显。(2)2种人工湿地内均存在丰富的微生物群落,并均存在共有的微生物种群;在湿地沿程不同位置均存在一定数量的优势种群。(3)TTCW强化了大气复氧能力,使得湿地内DO较相同深度的IVCW的高。TTCW具有较强的污染物去除能力,特别是具有高效的脱氮除磷能力。这种能力可能主要是TTCW中微生物群落结构的变化所致。

中国人2型糖尿病肾病患者锰超氧化物歧化酶基因的PCR-DGGE分析

目的探讨锰超氧化物歧化酶(MnSOD)基因在中国人糖尿病肾病(DN)遗传背景中的地位.方法运用聚合酶链反应-变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)技术在200例无亲缘关系之中国云南昆明地区汉族人2型糖尿病肾病患者90例;2型糖尿病患者70例;健康对照者40例中对MnSOD基因编码区进行分子扫查.结果在对研究对象MnSOD基因编码区的第1、2、3、4、5个外显子的PCR-DGGE扫查中未发现异常泳动片段.结论 MnSOD基因可能不是中国汉族人DN的主要致病基因.

PCR-DGGE技术及其在食品菌相分析中的应用

传统培养、鉴定的方法研究微生物菌相变化的缺点突出,不易对微生物的变化情况进行实时的分析。近年来,使用聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳技术(PCR-DGGE)分析食品中菌群变化情况的优点逐渐突显。本文介绍了PCR-DGGE技术的原理、优点和缺点,以及在食品菌相研究中的应用,并对该技术在食品微生物研究中的前景进行了展望。

两种不同硝化类型反应器中固定化硝酸菌的群落分析

该试验从亚硝化和全程硝化两种不同硝化类型的好氧流化床反应器的固定化包埋颗粒中提取细菌总基因组DNA,采用聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳技术(PCR-DGGE)对系统中的氨氧化菌(ammonia-oxidizing bacteria,AOB)和亚硝酸盐氧化菌(nitrite-oxidizing bacteria,NOB)群落结构进行了解析,根据序列数据进行同源性分析并建立系统发育树。结果表明:经过较短的驯化时间后,固定化颗粒反应器可形成优势菌,改变运行条件或经过长时间搁置后,颗粒中生态群落结构保持稳定;反应器中AOB较单一,以Nitrosomonas sp.为主,但具备一定抗冲击负荷能力,NOB以Nitrobacter sp.为主,全程硝化反应器中具有亚硝化反应器中所不具备的Nitrobacter sp.219、Nitrobacter sp.263。

普洱茶发酵过程中真菌群落结构的变化分析

该文通过变性剂法提取普洱茶样品中微生物的基因组DNA作为模板,以真菌的通用引物扩增18S rDNA的NS31/Glol区,再将PCR产物用变性梯度凝胶电泳进行分析,通过对DGGE图谱的统计分析和18S rDNA序列分析研究普洱茶发酵过程中真菌群落结构的组成和演变规律。研究结果表明:普洱茶不同发酵阶段的真菌多样性呈现出一定差异和变化趋势,黑曲霉(Aspergillus niger)在整个发酵过程中占有优势地位,此外还包括酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和光孢青霉(Penicillium glabrum)。

芽孢杆菌在肉鸡肠道内的分布及对肠道菌群、消化酶活性的影响

考察枯草芽孢杆菌的芽孢在AA肉鸡肠道内的分布和随粪便的排出规律,及对肠道内细菌群落结构变化和肠道内消化酶活性的影响.试验选取240羽1日龄AA肉鸡,随机分为2组,每组6个重复,采用相同的无抗生素基础日粮饲养3 d后,对照组和试验组分别一次性灌喂无菌水或枯草芽孢杆菌的芽孢(1.5×108CFU?mL-1)各0.5 mL;在不同时间采样进行计数和酶活性测定,同时通过聚合酶链反应-变性梯度凝胶电泳(polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis,PCR-DGGE)技术分析此过程肉鸡粪便中细菌群落的变化.结果表明:灌喂的芽孢在十二指肠内开始萌发,以空肠的营养体数量最高,盲肠内则以芽孢为主;粪便中的芽孢数量在24 h时最高,达到7.9×104CFU?g-1,而后逐渐降低,在72 h后基本无法检出.PCR-DGGE结合主成分分析(PCA)表明:对照组与试验组鸡粪中的细菌群落结构存在较大差异,其中试验组中肠道有益菌——乳杆菌属(Lactobacillussp.)含量较对照组有明显提高;同时,灌喂芽孢12 h后,十二指肠内淀粉酶、胰蛋白酶和总蛋白酶活性,空肠内的脂肪酶活性和盲肠内的总蛋白酶活性均高于对照,差异有统计学意义(P<0.05).试验证实芽孢能在AA肉鸡肠道内萌发并停留超过72 h,并对提高肠道内消化酶活性和改善菌落结构发挥作用.

基于PCR-DGGE研究人参乌梅汤加味对腹泻大鼠肠道菌群构成特征的影响

目的采用多聚酶链反应-变性梯度凝胶电泳(polymerase chain reaction-denaturing gradientgel electrophoresis,PCR-DGGE)技术研究中药复方人参乌梅汤加味对腹泻大鼠肠道菌群构成特征的影响。方法 48只SD大鼠随机抽取12只为空白组,其余36只参照文献方法以复合因素制作腹泻模型。造模成功后随机分为模型组、西药组、中药组,每组12只。造模21d开始给药干预,空白组和模型组予生理盐水,其余各组分别给予妈咪爱、人参乌梅汤加味,均1次/d,连续给药7d。收集各组大鼠粪便排泄物,提取粪便细菌总基因组DNA,PCR扩增细菌16Sr DNA基因V3可变区,DGGE方法检测PCR产物。对优势条带进行回收测序,鉴定菌种。结果药物处理后腹泻模型大鼠肠道微生物相对丰度最高的为厚壁菌门类细菌,其次为拟杆菌门和变形菌门类细菌。人参乌梅汤加味治疗后大鼠肠道厚壁菌门类细菌含量显著增加(P<0.01),而肠道拟杆菌门类细菌含量显著降低(P<0.01),肠道变形菌门类细菌含量无显著变化(P>0.05)。与空白组相比,经人参乌梅汤加味治疗后大鼠菌群较之西药组更接近空白组。结论人参乌梅汤加味较之西药对肠道菌群平衡更具有良性的调控作用,可能通过影响肠道菌群结构,纠正菌群紊乱,进而发挥生津止泻效应。

双生子儿童口腔微生物群组结构分析

目的通过聚合酶链反应-变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)分析双生子儿童中同卵双生子和异卵双生子口腔微生物群组结构的差异。方法选取双生子儿童20对,其中同卵双生子10对,异卵双生子10对;乳牙列10对,混合牙列10对;有龋者17人,无龋者23人。采集唾液样本后,提取细菌DNA,经通用引物扩增16s rRNA基因和PCRDGGE分析后,计算PCR-DGGE条带数及多样性指数。结果同卵双生子与异卵双生子均表现出明显的聚类分布,但同卵双生子与异卵双生子之间无统计学差异(P>0.05)。乳牙列组中,有龋儿童的PCR-DGGE条带数(11.00±1.56)及多样性指数(1.05±0.36)低于无龋儿童(14.00±2.74,1.44±0.37),两者间均具有统计学差异(P<0.05)。混合牙列组中,有龋儿童的PCR-DGGE条带数(11.88±4.05)及多样性指数(1.18±0.36)低于无龋儿童(14.31±5.71,1.28±0.47),但两者间均无统计学差异(P>0.05)。结论亲缘之间口腔微生物组群结构更为相似,环境的影响可能大于遗传的影响。有龋儿童的微生物种类较无龋儿童有所减少。

PCR技术在基因突变分析和定型中的应用

聚合酶链反应 (PCR)技术的应用在基因突变分析和定型领域引起了翻天覆地的变化 。

老年根龋患者唾液菌群多样性初步分析

目的:利用聚合酶链反应(PCR)-变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术对老年根龋患者唾液微生物群落结构进行初步分析。方法:随机选择20名65岁以上老年人分为根龋组(n=10)和健康组(n=10),提取唾液细菌全基因组DNA,扩增后经DGGE指纹图谱分析其微生物多样性。结果:唾液内菌群的组成具有个体差异性;与健康组相比,根龋组唾液微生物群落的Shannon-Wiener’s指数(H’)显著降低(P<0.05);异发酵乳杆菌DSM 5705、颊纤毛菌C-1013-b及真细菌属的某些细菌株在根龋组检出较多。结论:菌群失调是根龋发生发展的重要因素,唾液微生物菌落结构的改变对根龋的发生可以起到提示作用。

内蒙古西部地区土壤真菌的多样性分析

为明确内蒙古西部地区土壤真菌的多样性,从内蒙古西部地区采集土壤样品170份,提取土壤样品的总DNA,通过聚合酶链反应-变性梯度凝胶电泳(polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis PCR-DGGE),对真菌的丰富度和香农指数进行分析,并研究了土壤真菌多样性与土壤类型、土壤利用方式及土壤环境参数的相关性。结果显示,内蒙古西部地区土壤真菌的多样性较为丰富,丰富度指数处于11~25.4,香农指数处于2.33~3.17。在内蒙古西部同一地区的不同类型土壤中的真菌多样性差异显著。其中,棕钙土、栗钙土、石质土的丰富度最高,草甸土最低;同一地区相同类型土壤中草地的真菌数量比耕地丰富,林地土壤真菌数量相对较少,未利用土壤真菌多样性指数最低。真菌多样性与土壤环境参数的相关性分析结果显示二者之间并无显著的相关性。经过18S rRNA基因序列比对共得到了9个属的真菌,Penicillium(青霉属)、Aureobasidium(短柄霉属)、Pyrenochata(棘壳菌属)、Rhodocybella(红盖菇属)、Vanderwaltozyma、Kazachstania、Cystofilobasidium、Saccharomyces(酵母菌属),还有一株未被培养的优势菌。内蒙古西部地区的真菌资源较为丰富,其多样性受土壤类型及利用方式影响较大,作为与人类活动息息相关的一种重要的微生物资源,研究成果为今后该地区真菌资源的开发利用奠定了基础。

冰鲜鸭加工车间的菌相变化分析

应用传统微生物培养和聚合酶链反应-变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)技术,综合分析冰鲜鸭加工中主要工序点的菌相变化。同时对车间环境包括车间空气、工人手面、案板、胴体表面以及预冷水进行污染调查,并通过PCR-DGGE研究车间环境菌种的多样性。结果表明:影响冰鲜鸭产品微生物污染状况的主要来源为净膛间,主要菌种有Aeromonas veronii、Macrococcus caseolyticus、Acinetobacter lwoffii、Shewanella baltica、Enhydrobacter aerosaccus、Rothia mucilaginosa以及Staphylococcus属;直接来源为二阶预冷水,主要菌种为Aeromonas veronii、Enhydrobacter aerosaccus、Pseudomonas fluorescens、Shewanella baltica和Acinetobacter lwoffii,与产品菌种组成相同。前区与后区的隔离对降低后区微生物污染起到关键作用,净膛工序和预冷工序是影响产品微生物指标的关键。

水果酵素自然发酵过程中优势菌群与有机酸变化规律分析

分析3种自然发酵的水果酵素优势菌群与有机酸变化规律。高效液相色谱法测定有机酸含量变化,聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳(polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis,PCR-DGGE)分析菌群变化,并将两部分结果运用冗余分析(redundancy analysis,RDA)方法进行变化规律分析,发现发酵过程中细菌多样性指数呈先减小后增大的趋势。乳酸、柠檬酸、苹果酸和草酸在发酵过程中是水果酵素的主要有机酸。PCR-DGGE共检测出19条特异性条带,包括7株乳酸菌,2株肠杆菌,1株肠球菌,2株假单胞菌,以及3株不可培养微生物等。RDA表明对柠檬酸生成贡献率较大的菌株分别为Lactobacillus plantarum>uncultured Brevundimonas sp.>Enterobacter xiangfangensis>uncultured Lactococcus sp.,对乳酸生成贡献率较大的菌株分别为L.plantarum>Lactococcus lactis subsp.>E.xiangfangensis>L.lactis subsp.>uncultured Lactococcus sp.。

PCR-DGGE蝴性结肠炎大鼠胃肠道中细菌多样性研究

目的探讨溃疡性结肠炎对大鼠胃肠道微生物多样性影响，为治疗溃疡性结肠炎提供可靠依据。方法采用2，4-二硝基氯苯乙酸复合法对健康SD大鼠进行溃疡性结肠炎造模；运用CTAB—SDS法提取肠道微生物总DNA，通过PCR．DGGE分析溃疡性结肠炎大鼠之间胃肠道微生物多样性差异。结果溃疡组、用药组和正常组大鼠的消化道中，不同部位细菌Shannon~数变化较大（1．64-3．05），结肠中Shannon指数最高，其次是胃，小肠最低。在结肠，不同组的细菌多样性Shannon指数变化幅度不大，以用药组最高（3．05），其次溃疡组（2．98），正常组2．95，说明大鼠结肠在健康状态下细菌多样性最低，结肠炎后会发生一定的变化。此外，发现病变后的大鼠胃中拟杆菌属、梭菌属、普氏菌属、紫单胞菌属等厌氧细菌增加，病变后的结肠中乳杆菌属细菌明显减少，紫单胞菌属和梭菌属细菌明显增加；病变后小肠中部分乳杆菌种类消失，同时梭菌属和紫单胞菌属等不常见菌群的出现。结论溃疡性结肠炎大鼠胃、小肠、结肠中有益菌乳杆菌明显减少，普氏菌属、紫单胞菌属、梭菌属等明显增多，这些菌属可作为条件致病菌引起内源性感染，可能是造成溃疡性结肠炎的重要原因。

基于PCR-DGGE技术的浓香型白酒发酵过程中微生物种群变化研究

本文采用聚合酶链反应-变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)技术对浓香型白酒大曲生产过程中细菌和真菌群落的多样性进行了研究。结果表明,16S rDNA的条带数、优势度、多样性和相似性在DGGE模式中明显不同,反映了不同阶段存在的细菌群落的广泛多样性。

O_3—BAC工艺的微生物群落结构解析

利用聚合酶链反应—变性梯度凝胶电泳(PCR—DGGE)对臭氧—生物活性炭(O3—BAC)工艺3个不同运行周期(18、8和4个月)中BAC上的微生物群落结构进行了解析,研究结果表明:对于生物量很少的饮用水处理系统,PCR—DGGE法能够有效地表征BAC上微生物群落结构的变化;随着运行时间的增加,BAC系统中菌群结构的相似程度和种群的多样性(条带数)逐渐增高,最初定植的菌株能在BAC上稳定存在,即生物系统具有良好的稳定性。

氮肥对稻田土壤反硝化细菌群落结构和丰度的影响

以氮肥田间定位试验为研究对象,利用PCR-DGGE(聚合酶链反应变性梯度凝胶电泳)和荧光定量PCR(real-time PCR)技术,通过对反硝化细菌nirS基因的检测,分析了定位试验第2年稻田反硝化细菌群落结构和丰度的变化。DGGE图谱及依据其条带位置和亮度数字化数值进行的主成分分析(PCA)结果均显示:在氮肥定位试验第2年,与不施肥对照(CK)比较,在水稻各个生育期(分蘖期、齐穗期和成熟期)内,施用氮肥[150kg(N)·hm-2]的稻田根层土或表土中的反硝化细菌群落结构均无明显变化;且稻田根层土或表土中的反硝化细菌群落结构在水稻各个生育期间也均无明显差异。荧光定量PCR结果显示,在水稻生长发育过程中,施用氮肥的稻田根层土或表土中的反硝化细菌nirS基因拷贝数始终显著(P<0.05)高于其对应的不施肥对照。此外,无论施用氮肥与否,根层土中的反硝化细菌nirS基因拷贝数在水稻成熟期时都会显著(P<0.05)降低;但表土中的nirS基因拷贝数在水稻各生育期间无明显变化;且水稻成熟期时施用氮肥和不施肥的稻田表土中nirS基因拷贝数都显著(P<0.05)高于根层土。同时,与对照比较施用氮肥可促进水稻增产44%。研究表明,短期定位试验中施用氮肥能够显著提高稻田土壤反硝化细菌的丰度,但对其群落结构没有明显影响。