双创造酶切位点聚合酶链反应-限制性片段长度多态性检测MGMT基因多态性的应用

目的建立简便易行、经济适用的MGMT基因4个单核苷酸多态性位点的检测方法。方法应用碱基错配创造酶切位点原理设计引物,通过聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术判断MGMT基因四个SNP位点多态性。结果设计一对引物PCR扩增含MGMT84多态位点的DNA片段,另一对引物PCR扩增含MGMT基因143、160、178三个多态位点的DNA片段,使用4种限制性内切酶分别酶切判断4个位点多态性,PCR和酶切效果均较好。结论应用创造酶切位点PCR-RFLP原理建立的MGMT四个多态位点的检测方法具备简便、经济、快速的特点。

聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性方法对太白贝母鉴别检验的适用性探讨

目的:探讨聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性方法(PCR-RFLP)对于太白贝母的适用性。方法:采集太白贝母野生及栽培品,收集市场上太白贝母伪品,利用性状、PCR-RFLP鉴别法、DNA序列分析三种方法分析太白贝母与常见伪品的区别。结果:从性状上看,太白贝母栽培品与伪品往往非常相似,较难辨别;通过PCRRFLP方法可以正确、客观的鉴别太白贝母与常见伪品,基于ITS2的DNA条形码方法进一步验证了PCR-RFLP法的准确性。市场上太白贝母的伪品多为伊犁贝母。结论:PCR-RFLP鉴别法可准确鉴别太白贝母与其伪品;市场上太白贝母伪品较多,应加强监管。

60株临床分离犬小孢子菌的聚合酶链反应-限制性片段长度多态性鉴定

目的探索采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法进行犬小孢子菌的快速鉴定。方法采用真菌通用引物第1内转录间隔区(ITS-1)与第4内转录间隔区(ITS-4)对60株犬小孢子菌进行PCR扩增,然后利用限制性内切酶TaqⅠ和HinfⅠ分别对PCR产物进行酶切分析。结果真菌通用引物ITS-1和ITS-4在60株犬小孢子菌中均扩增出1条长约750 bp的DNA条带;2种内切酶HinfⅠ和TaqⅠ各自显示相同的酶切结果,酶切片段稳定而清晰。结论应用PCR-RFLP方法可以快速、敏感、特异地鉴定犬小孢子菌。

聚合酶链反应-限制性片段长度多态性检测肿瘤坏死因子β基因多态性

目的 建立聚合酶链反应限制性片段长度多态性(PCR—RFLP)检测肿瘤坏死因β(TNFβ)多态性的方法。方法 采用PCR方法扩增TNFβ第一外显子到第二外显子包含G→A突变在内的DNA片段,扩增产物用限制性内切酶Nco I酶切后电泳,分析TNFβ的基因型。结果 TNFβ检测到3种基因型,分别为TNFβ*1/1、TNFβ*1/2和TNFβ*2/2。结论PCR—RFLP检测肿瘤坏死因子β多态性方法快速、简便、准确、可靠,适合普通实验室开展及大规模研究。

聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性和芯片生物分析技术用于渤海地区鱼种鉴定

以渤海湾具有重要商业价值的9种海鱼(小黄鱼、花鲈、蓝点马鲛、鲐、钝吻黄盖鲽、棘头梅童鱼、许氏平鲉、高眼鲽和长蛇鲻)为研究对象,利用聚合酶链式反应(PCR)-限制性片段长度多态性(RFLP)和芯片生物分析技术对其进行鱼种鉴定。首先提取其基因组脱氧核糖核酸(DNA),对其细胞色素b的特定片段(464bp)进行扩增,然后选择DdeⅠ、HaeⅢ和NlaⅢ3种限制性内切酶进行酶切,并利用芯片生物分析技术得到酶切产物的特异图谱和确切的片段大小,从而有效区分了9种海鱼。研究结果表明,PCR-RFLP和芯片生物分析技术在鱼种鉴定上具有精确、鉴别和快速三大优势,可为鱼类食品检测提供科学依据。

聚合酶链反应限制性片段长度多态性快速检测模拟尿标本中致病念珠菌的研究

目的研究常见的致病性念珠菌的分子生物学鉴定方法,为深部念珠菌的分子诊断奠定基础。方法用白色念珠菌、热带念珠菌、净平滑念珠菌和克柔念珠菌的标准菌株制备模拟尿标本,对其核糖体DNA内转录间隔区进行聚合酶链反应扩增,对扩增产物进行内切酶MspⅠ的酶切分析。结果4种念珠菌经聚合酶链反应后产生4种不同分子量的条带,扩增产物经酶切后产生4种特异性带型。结论聚合酶链反应—限制性片段长度多态分析方法是一种可靠、稳定、特异的鉴定常见致病念珠菌的方法。

逆转录—聚合酶链反应结合限制性片段长度多态性分析对我国肾综合征出血热病毒分型的研究

建立准确、快速、灵敏的汉坦病毒基因分型方法，可弥补传统血清学方法的不足，对防治该病毒所致的肾综合征出血热（HFRS）具有重要意义。本试验采用逆转录－聚合酶反应（RT－PCR）和限制性片段长度多态性（RFLP）和限制性片段长度多态性（RFLP）方法，对流行于我国的两型汉坦病毒代表株－汉滩型（HTNV）76－118 和汉城型（SEOV）R22株进行基因分析。根据病毒DNA序列的电脑软件分析。不同HFRSV囊膜糖蛋白编码基因M节段1199－1497间核苷酸序列上RsaI,TaqI和HindⅢ的酶切位点存在差异（Fig.I),可用于进行限制性内切酶基因多态性分析，以确定HFRV的型别。首先，以一对引物扩增该片段（Fig.2)。然后，分析用这三种内切酶（Fig.3,4,5)进行酶切分型，共分析了从我国不同地区，不同宿主分离的毒株18株，及国际标准毒株2株，酶切图谱显示，这些毒株可以被分为三组（Table.a)：9株可定为HTNV型，8株可定为SEOV型，3株无法确定其型别（X型），该法分型结构与血清学经典的空斑减数中和试验分型结构基本一致，说明该酶切分型方法具有一定的可行性。

应用错配PCR和限制性片段长度多态性分析技术检测HBV YMDD变异株

目的 建立简便易行的检测乙型肝炎病毒 (HBV)多聚酶基因 (P基因 )上YMDD变异株的方法 ,评价运用拉米夫定治疗慢性乙型肝炎患者对此变异的影响。方法 采用套式 /错配聚合酶链反应 (PCR)结合限制性片段长度多态性 (RFLP)分析技术对 10 8例治疗前HBVDNA(PCR)阳性正在拉米夫定治疗中的慢性乙型肝炎患者的HBVYMDD变异情况进行检测。结果 运用上述技术能有效区分HBVYMDD野生株和变异株 ;上述 10 8例患者经拉米夫定治疗后 ,HBVDNA阴转者 63例 (5 8 3 % ) ,HBVYMDD野生株和变异株分别为 2 3例 (2 1 3 % )和 2 2例 (2 0 4% )。结论 建立的套式 /错配PCR -RFLP分析技术可用于HBVYMDD变异株的临床监测 ;

广西壮族人群载脂蛋白B基因限制性片段长度多态性分析

目的 :探索广西地区壮、汉两族人群ApoB基因多态性的分布特点及其与冠心病、脑梗塞发病之间的关系。方法 :应用聚合酶链反应 (PCR)对广西壮族 17名冠心病患者 (CHD)、14名动脉粥样硬化性脑梗塞患者 (ACI)和 62名健康人的ApoB基因的XbaI、EcoRI位点的限制性片段长度多态性 (RFLP)进行了研究。结果 :无论是广西壮族人群冠心病组、脑梗塞组与正常对照组在XbaI位点以X- X- 为主要基因型 ,少见X+ X+ 、X+ X- 基因型 ;在EcoRI位点以E+ E+ 为主要基因型 ,少见E+ E- 、E- E- 基因型。X+ 等位基因在壮族三组人群中的频率分别为 :0 117、0 0 714、0 0 4 92 ,两两之间没有显著性差异 (P >0 0 5 ) ;E-在广西壮族三组人群中的频率为 :0 0 3 85、0 10 7、0 0 4 84 ,两两之间的差异未达统计学意义 (P >0 0 5 )。结论 :广西壮族人群冠心病、脑梗塞的发病与XbaI。

联合应用表型分析、热休克蛋白65限制性片段长度多态性分析和测序鉴定养鱼水中的非结核分枝杆菌

目的了解养鱼水中非结核分枝杆菌(NTM)的分布情况。方法采集30份市售养鱼水标本,通过分离培养和生化反应初步鉴定,然后从培养菌落中提取DNA,PCR扩增65kD分枝杆菌抗原,扩增产物:(1)分别应用两种限制性内切酶BstEⅡ和HaeⅢ酶切,然后进行琼脂糖凝胶电泳和限制性片段长度多态性分析(PRA);(2)直接测序。结果30份市售养鱼水中29份样本分枝杆菌培养阳性,其中6份样本分别生长出两种形态性状完全不同的菌落,共分离出35株分枝杆菌,表型特征均符合NTM。理化性质、PRA和测序鉴定发现,戈登分枝杆菌8株(23%)、龟-偶然分枝杆菌复合群8株(23%)、日内瓦分枝杆菌9株(26%)、不产色分枝杆菌1株,其余9株未鉴定到种。结论NTM广泛存在于市售养鱼水中,分子生物学方法与常规细菌学鉴定可互相补充,提高鉴定的正确性。

广东省脑膜炎奈瑟氏菌porA基因限制性片段长度多态性分型研究

目的 分析广东省在不同流行时期 ,特别是 80年代后期以来脑膜炎奈瑟氏菌 (Nm)的特点。方法 选择 35株A、B、C群流脑菌株 (196 6～ 2 0 0 0年 )进行porA基因聚合酶链反应 -限制性片段长度多态性 (PCR -RFLP)分型研究 ,采用PCR反应扩增porA基因 ,PCR产物纯化后经限制性内切酶MspI酶切 ;10 %聚丙烯酰胺凝胶 (PAGE)电泳分离酶切产物 ,银染显色。结果 35株被检菌株分为5种RFLP型 ,2 0株A群菌株 (病人 17株 ,带菌者 3株 )分 3型 ,谱型与我国代表谱型相同 (即a1、a2 、a3型 ) ;11株B群菌株分 5型 ,其中 6株病人菌株每两株 1型 ,分为 3型 (即b2 0 、b2 1、b2 1a2 型 ) ,其中b2 0 型与a3 型谱型相同 ;4株C群菌株有 3株与b2 1a2 菌型相同。结论 不同的血清群可有相同的RFLP谱型 ;A群Nm不同的流行周期有自己优势菌型 ,广东省 6 0年代与 80年代后期至今的代表菌型相同 ,为a3 型 ;B群RFLP谱型比A群变异程度大 ,同一时期分离到的菌株可有几种不同的RFLP谱型 ;

ABO位点限制性扩增片段长度多态性的研究

建立了PCR扩增、限制性酶切、8％（T）、5％（C）聚丙烯酸胺凝胶垂直电泳和银染检测ABO位点的限制性片段长度多态性的方法体系。应用Amp-RFLP技术对185名中国人（哈尔滨）ABO位点的基因频率和基因型分布进行了调查和统计分析。ABO位点特异片段长度为140～200bp，基因频率为0．2000～0．5568。6种基因型频率为0．973～0．3135，杂合度0．5838，Dp值0．7146。经H－W平衡吻合度检测，完全符合群体遗传多态分布。通过对11个家庭33名相关个体的分析，证明完全符合孟德尔遗传定律。ABO基因型检验适用于法庭科学的个体识别和亲权鉴定。

中国汉族人群凝血因子Ⅸ基因限制性片段长度多态性的研究

为探讨中国人群中凝血因子Ⅸ ( FⅨ )基因SalⅠ ,NruⅠ和MseⅠ酶切位点的限制性片段长度多态性(RFLP) ,采用聚合酶链反应 (PCR)方法 ,以三代内相互间无亲缘关系的正常汉族人为研究对象 ,对其 FⅨ基因内含子 1第 192位以及 5′端 - 793位核苷酸A和G的频率和 5′端 - 6 98位核苷酸T和C的频率进行了分析 ,其中对FⅨ - 192共分析了 2 14条X染色体 ,对 FⅨ - 793共分析了 2 10条X染色体 ,对 FⅨ - 6 98共分析了 2 0 6条X染色体。结果表明 :FⅨ基因内含子 1第 192位A和G的频率分别为 0 .878和 0 .12 2 ,杂合体频率为 0 .2 13;- 793位核苷酸A和G的频率分别为 0 .5 5 2和 0 .4 4 8,杂合体频率为 0 .4 94 ;FⅨ - 6 98位核苷酸T和C的频率分别为 0 .311和 0 .6 89,杂合体频率为 0 .4 2 9。结论提示 :FⅨ基因SalⅠ。

运用限制性长度多态性和单链构象多态性技术鉴别大肠杆菌血清型

目的 扩增大肠杆菌GroEL基因并通过限制性长度多态性 (RFLP)和单链构象多态性 (SSCP)分析 ,探讨进行大肠杆菌血清型鉴定的可行性。方法 选择大肠杆菌GroEL基因作为鉴别的靶基因 ,通过设计合适的通用引物进行PCR扩增 ,并对 5种不同血清型大肠杆菌扩增产物的酶切片段进行RFLP分析和SSCP分析。结果 运用通用引物可以扩增出 5种不同血清型大肠杆菌的GroEL基因 ,PstI酶切产物的RFLP分析表明 ,不同血清型大肠杆菌表现出不同的RFLP图谱 ,SSCP分析表明 ,图谱变异性更大 ,有利于进行血清型鉴别甚至株间的鉴别。结论 运用PCR RFLP和PCR

强迫症与儿茶酚-邻-甲基转移酶基因多态性的关联分析

目的 探索上海地区汉族人口中儿茶酚 邻 甲基转移酶 (COMT)基因多态同强迫症的关系。方法 采用聚合酶链反应扩增技术与限制性片段长度多态 (PCR RFLP)测定 10 0例强迫症 (OCD)患者和 115例健康对照的基因型。结果 强迫症患者COMT基因型与等位基因分布与健康对照之间显著差异 (P >0 0 5 ) ;OCD患者与健康对照同性别之间COMT基因型与等位基因分布也未见显著差异(P >0 0 5 )。

中国人群醛固酮合成酶基因T-344C位点单核苷酸多态性频率分析

目的研究醛固酮合成酶(CYP11B2)基因T-344C单核苷酸多态性(SNP)在中国人群中的分布。方法采用PCR-RFLP法对中国人群进行醛固酮合成酶(CYP11B2)基因T-344CSNP频率分析比较。结果中国人群的醛固酮合成酶(CYP11B2)基因T-344C基因型频率分布:TT型占64.5%,TC型占30.8%,CC型占4.7%;等位基因频率T占79.9%,C占20.1%。各基因型频率、等位基因频率与西班牙人、德国人、苏格兰人、日本人差异非常显著。结论醛固酮合成酶(CYP11B2)基因T-344CSNP频率的分布有明显的种族差异。

人血红蛋白β-链基因AvaⅡ位点扩增片断长度多态性

目的：为了研究日本人群β-链基因AvaⅡ酶切位点的遗传多态性以及该位点等位基因频率的分布。方法：采用PCR- RFLP技术,对35例无血缘关系的健康日本大学生的70条染色体进行检测,然后用X^2检验进行统计学处理。结果：等位基因B_1频率为0．4715,等位基因B_2频率为0．5287,杂合度H=0．5429,期望杂合度h=0．4986,多态信息量PIC=0．7635；B_1、B_2的传递规律和理论上预计的完全符合,认为日本人群β-链基因AvaⅡ酶切位点也具有遗传多态性,表明β-链基因AvaⅡ酶切位点具有适合信息,并且与国外报道的无显著性差异。结论：这对遗传制图、基因分离、疾病的关联研究,法医学个体识别和双生子的卵性鉴定有一定的价值。

老年脑出血患者对氧磷酯酶1基因192位Gln-Arg多态性的研究

目的 探讨对氧磷酯酶 1(PON1)基因 192位Gln Arg(Q R192 )多态性与老年脑出血的关系。方法 本研究采用病例对照设计 ,对 170例脑出血患者 (脑出血组 )和 2 0 4例健康体检者 (对照组 )进行研究。采用聚合酶链反应 限制性片段长度多态性方法测定PON1Q R192基因多态性。结果 在脑出血组中 ,PON1Q R192 3种基因型频率分别为QQ12 .4 %、QR5 0 .6 %和RR37.1%。PON1Q R192基因型和等位基因频率分布在脑出血组与对照组间差异无显著性意义 ;各基因型之间血脂水平差异无显著性意义。结论 PON1Q R192基因多态性与老年脑出血不存在相关关系。

PCR-RFLP方法检测锰超氧化物歧化酶基因V(16)A多态性的实验条件研究

目的:确定PCR-RFLP技术检测锰超氧化物歧化酶基因(MnSOD)V(16)A多态性的最适实验条件.方法:对影响MnSOD基因PCR反应以及用限制性内切酶BsawI切割主要因素进行了系统研究.结果:最适退火温度为55℃;最适引物浓度为0.25μmol/L;最适Mg2+浓度为1.5 mmol/L;最适dNTP浓度为0.20 mmol/L;以0.6 U为最适Taq酶量.酶切体系为15μL体系中加8μL产物用2 U的酶消化,为后续研究奠定了实验基础.