生物芯片多聚-L-赖氨酸玻璃片基的制备及各种因素对片基活化性能的影响

介绍了生物芯片多聚 L 赖氨酸玻璃片基的制备方法 ,探讨了NaOH或HCl预处理载玻片和热处理载玻片等因素对片基活化性能的影响。运用红外光谱、紫外光谱对活化后的样品进行了分析。结果表明 ,经 5 80℃热处理 ,再经 1 5 %的HCl溶液对载玻片预处理 1 2h 。

用多聚-L-赖氨酸活化生物芯片玻璃片基的研究

采用红外光谱、紫外光谱和扫描电镜等多种分析手段研究了以多聚-L-赖氨酸(P-L-L)为活化试剂时载玻片的活化过程,讨论了NaOH溶液预处理以及P-L-L浓度和浸泡时间等因素对玻璃片基活化效果的影响。结果表明,多聚-L-赖氨酸与载玻片表面发生联接,其联接量与NaOH预处理条件以及P-L-L的浓度和浸泡时间等因素有关。在本实验条件下,先经24h的NaOH(25％)预处理,再于10％的多聚-L-赖氨酸溶液中浸泡2h,可得到较为理想的活化效果。

表面改性聚合物左旋聚乳酸-多聚赖氨酸可促进骨髓基质细胞的初始黏附

背景:通过增加表面活性基团对生物支架材料进行表面改性,可提高材料对细胞的亲和力,有效提高材料的细胞相容性。目的:合成表面改性聚合膜左旋聚乳酸-多聚赖氨酸(PLLA-PLL),并观察其对骨髓基质细胞黏附、增殖的影响。方法:通过开环聚合反应合成不同组分高分子聚合膜PLLA139-PLL131,PLLA77-PLL72,PLLA45-PLL246,将人骨髓基质细胞接种至不同组分聚合膜PLLA-PLL表面、左旋聚乳酸及商品化的细胞培养板,寻找最佳PLLA-PLL组分。结果与结论:与左旋聚乳酸比较,不同组分PLLA-PLL聚合膜细胞黏附量均升高,以PLLA77-PLL72聚合膜组增高显著(P<0.05),所以最佳组分为PLLA77-PLL72,连续培养结果显示PLLA77-PLL72聚合膜表面骨髓基质细胞骨架蛋白表达丰富,清晰有序,增殖实验也证实了PLLA77-PLL72聚合膜可促进骨髓基质细胞增殖。

菲立磁-多聚赖氨酸复合物体外标记兔骨髓基质细胞

背景:为明确细胞移植后症状改善是否由移植所致,既往多采用侵袭性方法,但是这种方法不适用于动态追踪及人体研究。如果能够在合适示踪剂的帮助下,采用无创伤性影像学技术在活体识别、跟踪移植后细胞的存活状态,将显著提高细胞移植疗法的学术价值。目的:初步探讨菲立磁-多聚赖氨酸复合物体外磁性标记兔骨髓基质细胞的可行性。设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2008-03/08在珠江医院神经外科实验室完成。材料:2月龄新西兰大白兔8只,由广州中医药大学实验动物中心提供。菲立磁为AdvancedMagnetic公司产品,多聚赖氨酸为sigma公司产品。方法:无菌条件下穿刺抽取兔股骨骨髓,梯度密度离心法分离获取骨髓基质细胞,收集第2代细胞,加入含白血病抑制因子、碱性成纤维细胞生长因子及胎牛血清的神经干细胞培养基诱导5d。将50mg/L菲立磁和1.5mg/L多聚赖氨酸混合,振荡30min后,将复合物加入到细胞培养基中进行标记,孵育细胞24h。主要观察指标:骨髓基质细胞向神经干细胞诱导分化情况,细胞内铁的鉴定,菲立磁-多聚赖氨酸复合物标记对细胞增殖或分化的影响。结果:骨髓基质细胞诱导后可见少量细胞的胞体变圆变大,突起缩短,随时间延长,圆形细胞逐渐增多,部分聚集成簇、成球,FITC荧光染色示巢蛋白呈阳性表达。普鲁士蓝染色结果显示99%以上骨髓基质细胞的胞质内出现细小的蓝色铁颗粒。在含菲立磁-多聚赖氨酸复合物的培养基中,骨髓基质细胞可继续增殖和分化,但增殖分裂后细胞质内铁颗粒数量较增殖前有所减少,经鉴定部分为神经元特异性烯醇化酶阳性细胞。结论:菲立磁-多聚赖氨酸复合物可在体外高效标记骨髓基质细胞,且标记后细胞的活性、增殖和分化能力不受影响。

骨组织工程经多聚赖氨酸修饰的脱钙骨基质富集材料的细胞毒性研究

目的:评价多聚赖氨酸修饰的脱钙骨基质富集材料的细胞毒性,为该材料应用于临床提供实验依据。方法:参照GB/T16886.5-2003-ISO 10993-5:1999标准,将不同浓度的材料浸提液分别与人间充质干细胞(MSCs),成骨细胞(OS)体外复合培养。倒置相差显微镜行细胞形态学观察;MTT比色法测定1、3、5、7d的MSCs增殖活性;金氏比色法检测OS碱性磷酸酶活性。结果:不同时间点、不同浓度材料浸提液培养的MSCs均良好增殖,毒性0~1级;5d后浸提液培养组细胞增殖率优于阴性对照组(P<0.05),随材料浸提液浓度增加而增加;浸提液培养组OS碱性磷酸酶活性与阴性对照组相比差异无显著性(P>0.05)。结论:经多聚赖氨酸修饰的脱钙骨基质富集支架材料无细胞毒性,实验浓度范围内利于MSCs增殖,不影响OS的成骨活性。

改良多聚-L-赖氨酸法防脱片载玻片的制备

目的:探索一种经济实用效果良好的防脱片载玻片的制备方法。方法:将市售普通载玻片进行改良多聚-L-赖氨酸防脱片载玻片的制备处理和传统重铬酸钾洗涤法及防脱片制备处理后,与市售防脱片载玻片成品进行相同的临床病理组织学切片制备。结果:改良防脱制备法效果稳定可靠,明显优于传统防脱片处理法,并可与市售防脱片处理的成品载玻片媲美。结论:改良多聚-L-赖氨酸防脱片载波片的制备法方便可靠,经济实用。

多聚赖氨酸修饰的山羊脱钙骨富集骨髓干细胞的性能评价

目的研究经多聚左旋赖氨酸修饰的山羊脱钙骨基质(demineralized bone matrix decorated with poly-L-lysine,PLL-DBM)的性能,为选择性细胞滞留技术(selective cell retention,SCR)提供一种对骨髓干细胞黏附性能良好的富集基质材料。方法将取材于山羊股骨近端的松质骨去皮质理化处理制成脱钙骨基质(demineralized bonem atrix,DBM),用多聚左旋赖氨酸(poly-L-lysine,PLL)对其进行修饰。扫描电镜分析其显微结构;氨基酸成分分析检测PLL与DBM的复合情况;通过纤维母细胞集落形成单位(CFU-F)计数,检测山羊PLL-DBM对骨髓干细胞的富集效果;在山羊横突间融合模型中,通过X线片及组织学评价其成骨能力。结果PLL-DBM具有天然网状孔隙结构系统,空隙内修饰有PLL形成的蜘蛛网样结构;PLL与DBM能较好地复合;山羊PLL-DBM对骨髓干细胞富集效果明显优于空白DBM(P<0.01)。PLL-DBM的成骨能力与自体髂骨相当。结论山羊PLL-DBM对骨髓干细胞有较好的富集效果,成骨能力强,是一种理想的富集基质材料。

用多聚赖氨酸作载体制备IVM人工抗原的研究

采用N-羟基琥珀酰亚胺活性酯法和混合酸酐法,将伊维菌素(IVM)分别与多聚-L-赖氨酸(PLL)和卵清蛋白(OVA)连接制备人工免疫原5-O-(单)琥珀酰IVM-PLL和包被原5-O-(单)琥珀酰IVM-OVA,经非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析证实人工抗原合成成功。

Ni~Ⅱ-NTA修饰的银纳米粒/多孔硅芯片在线分离组氨酸标记蛋白和MALDI-TOF质谱检测(英文)

本文通过沉积在多孔硅表面的银纳米粒吸附对氨基苯硫酚和氨基的化学转化得到终端为NiII-Nα,Nα-二(羧甲基)-L-赖氨酸水合物-即NiⅡ-NTA体系的芯片。NiⅡ-NTA修饰的芯片被用于从高浓度的盐和助溶剂的缓冲体系中亲和捕获组氨酸标记的融合蛋白:thioredoxin-urodilatin和SUMO-hu-aprotinin,并进行在线的MALDI-TOF质谱检测,克服了MALDI-TOF质谱中直接点样污染物妨碍样品与基质共结晶的问题,避免了繁琐的离线样品预处理。芯片在线分离、纯化和MALDI-TOF质谱分析体系有望在复杂或原始体液的溶液中分析目标分子。

多聚赖氨酸表面修饰的脱钙骨基质富集材料的细胞相容性研究

目的探讨多聚赖氨酸表面修饰的脱钙骨基质（PLL-DBM）富集材料的细胞相容性。方法将PLL—DBM材料及其浸提液分别与人骨髓基质干细胞（BMSCs）体外共培养，于培养20h、3d、7d行细胞形态学观察，四甲基偶氮唑盐（MTT）法测定培养1、3、5、7d的细胞增殖活性，流式细胞仪检测人BMSCs的表型和细胞周期。浸提液作用3、5、7d检测成骨诱导后BMSCs的碱性磷酸酶（ALP）活性，14d行钙结节四环素荧光染色、茜素红染色、Ⅰ型胶原免疫组织化学染色。应用分光光度法进行溶血试验。结果与PLL-DBM及其浸提液共培养的人BMSCs表现出更好的黏附与增殖特性，培养5d后浸提液组细胞增殖率高于阴性对照组（P〈0．05）；且细胞增殖率随浸提液浓度增加而增高，细胞毒性为0。1级。浸提液组与对照组人BMSCs均未见有DNA倍体异常细胞，且浸提液组增殖期（S＋G2．M）细胞比例显著升高，差异有统计学意义（P〈0．05）。100％浸提液组与对照组之间成骨诱导后BMSCs的细胞形态与成骨活性比较差异均无统计学意义（P〉0．05）。实验组溶血指数为2．6％，达到标准要求。结论PLL-DBM富集材料可促进人BMSCs的黏附、增殖与基质分泌等，且不影响人BMSCs的表型和成骨诱导后BMSCs的成骨活性，具有良好的细胞相容性，是一种可供临床选择的骨髓干细胞富集材料。

多聚赖氨酸修饰的脱钙骨基质支架材料的组织相容性研究

[目的]评价多聚赖氨酸修饰的脱钙骨基质支架材料(PLL-DBM)的组织相容性。[方法]采用标准的毒理学方法进行溶血实验、全身急性毒性实验、致癌实验和皮下植入实验验证多聚赖氨酸修饰的脱钙骨基质支架材料(PLL-DBM)的组织相容性。[结果]溶血实验测得溶血指数为2.617%,符合生物材料的国家标准(<5%);全身急性毒性实验:各组裸鼠活动正常,体重正常增长,未见中毒表现或不良反应,72 h内PLL-DBM材料浸提液组与生理盐水组裸鼠体重增长无明显差异(P>0.05),且4周内裸鼠无死亡;致癌实验显示实验组裸鼠正常存活,8个月内未见肿块形成,心、肝、脑、肺、肾、胰、脾组织学观察未见肿瘤细胞;皮下植入实验显示实验动物伤口未见感染、红肿及裂开等不良反应,置入材料无排异现象,取材时见材料周围肌肉颜色及质地正常。[结论]多聚赖氨酸修饰的脱钙骨基质支架材料(PLL-DBM)具有良好的组织相容性。

SPIO标记大鼠骨髓基质干细胞及体外磁共振成像研究

目的探讨以多聚赖氨酸(poly-L-lysine,PLL)为转染介质介导超顺磁性氧化铁微粒(superparamgnetic iron oxides,SPIO)标记大鼠骨髓基质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)的合适条件,通过标记细胞的体外磁共振成像(magnetic resonance imaging,MRI)获取最佳的磁共振扫描序列。方法分离、纯化、培养大鼠BMSCs,SPIO和PLL以1∶0.0012混合配制氧化铁-多聚赖氨酸(F-PLL)混合液,用铁浓度分别为0、4.2、8.4、21、42、84μg/ml的FE-PLL复合物标记BMSCs。计算细胞标记阳性率,测量并绘制未标记细胞和不同浓度铁标记细胞的MTT生长曲线;对不同浓度铁标记的细胞进行磁共振成像。分别用浓度为0、0.05、0.25、0.5、1.0、5.0μg/ml的PLL同BMSCs共同培养,了解各种浓度PLL对细胞的生存是否有影响。结果细胞的标记率分别为0%、(44.40±11.33)%、(71.97±8.01)%、(88.86±9.10)%、(98.24±2.94)%、100%,随着SPIO浓度的增加而增加。MTT显示在铁浓度<42μg/ml时FE-PLL复合物对细胞的生长活性无明显影响,而铁浓度为84μg/ml时,细胞的生长活性受到抑制。PLL在浓度≤1.0μg/ml时对细胞的活力无明显影响;当PLL浓度为5.0μg/ml时,细胞生长明显受抑。MRI信号随FE-PLL复合物浓度的增加而增加(P<0.05),标记细胞的信号在T1WI的改变不及在T2WI及T2*WI明显,而以T2*WI信号改变最明显(P<0.05)。结论以PLL为转染介质,SPIO能够高效的标记BMSCs,并且在合适的浓度范围内不会影响干细胞的生长活性。

制备蛋白质微阵列的玻璃表面修饰方法比较

目的探讨用于制备蛋白质微阵列的5种不同修饰方法的玻片对蛋白质的固定能力,通过对荧光信号强度的大小以及蛋白芯片检测的灵敏度的比较确定一种蛋白质固定效果好、信噪比高的玻片。方法将系列稀释的人IgG分别点在5种不同修饰方法[包括氨基、多聚赖氨酸、3-氨丙基三乙氧基硅烷(APES)、醛基-磷酸盐缓冲液、醛基-H2O]修饰的玻片上制备蛋白质微阵列,比较不同玻片修饰方法荧光信号强度的大小以及蛋白芯片检测的灵敏度。结果5种玻片中APES修饰的玻片蛋白质固定效果最好,信噪比最高。结论APES修饰的玻片比较适合制备蛋白质微阵列。

菲立磁细胞内标记兔骨髓基质细胞的初步观察

目的:探讨利用菲立磁(Feridex)和转染试剂体外标记兔骨髓基质细胞的可行性,为临床上应用磁共振成像(MRI)追踪标记细胞奠定基础。方法:9只2月龄新西兰大白兔无菌条件下行股骨穿刺取骨髓,梯度密度离心法分离获取兔骨髓基质细胞,用菲立磁-多聚赖氨酸复合物(FE-PLL)标记骨髓基质细胞,采用普鲁士蓝染色和台盼蓝拒染实验等方法鉴定FE-PLL标记兔骨髓基质细胞的效率和细胞的活力,并在增殖条件下用改良SABC法进行抗单克隆神经元特异性烯醇化酶(NSE)免疫组织化学染色(DAB-H2O2棕色法呈色)和普鲁士蓝(Prussian blue)染色,对FE-PLL标记骨髓基质细胞的增殖和分化能力进行评估。结果:菲立磁可以高效率地标记兔骨髓基质细胞,标记效率在99%左右。普鲁士蓝染色显示FE-PLL标记骨髓基质细胞胞质内出现细小的蓝色铁颗粒。标记的骨髓基质细胞与正常未标记细胞相比较,细胞的活力、增殖和分化等能力没有明显的差异。结论:菲立磁可以用来体外标记骨髓基质细胞,标记后对骨髓基质细胞活力、增殖和分化能力无明显影响。

多聚赖氨酸的合成及其微结构对pH的响应

以L-赖氨酸为起始原料,通过4步反应合成了多聚赖氨酸(Polylysine,PLL),采用红外、核磁对其结构进行了表征,并对关键合成环节进行了优化.在此基础上,通过扫描电镜和圆二色光谱研究了多聚赖氨酸分子在不同pH条件下的聚集行为,并对机制进行了阐述.研究结果表明,多聚赖氨酸结构对环境酸碱度有不同的响应,不同的pH条件下会导致不同的分子组装和形貌,在酸性条件下PLL呈现一种特定的线圈形态;碱性条件下呈现有序的松针状.

赖诺普利关键中间体的合成研究

以3-苯甲酰丙烯酸乙酯(BZ)和三氟乙酰赖氨酸(LA1)为原料,在三氟甲磺酸三正丁胺盐催化作用下,经迈克尔加成反应、氢化还原反应合成赖诺普利关键中间体N2-(1-乙氧羰基-3-苯丙基)-N6-三氟乙酰基-L-赖氨酸(LA2),总收率为38.8%。LA2加成物立体选择性可达到84:16。该方法具有操作简单,收率高,是一条适合工业化生产的合成路线。

体外培养的兔骨髓基质细胞在牛松质骨载体上的生长与分化

目的体外培养兔骨髓基质细胞(M arrow Strom al Cells,MSCs),研究其生物学特性,为骨组织工程应用提供基础。方法抽取新西兰白兔骨髓,进行体外培养并传代,观察细胞生长情况,然后将细胞与牛松质骨(bovine cancellous bone,BCB)载体复合。通过用倒置显微镜和扫描电镜观察细胞粘附和生长情况,同时测定碱性磷酸酶活性和细胞增殖分化情况。结果骨髓基质细胞在体外培养生长良好,细胞与支架复合后可以在支架表面粘附伸展。结论骨髓基质细胞在体外生长良好,可以作为种子细胞在组织工程中应用。

新型骨髓干细胞富集材料的制备及其表征研究

目的制备一种新型骨髓干细胞富集材料,并观察其表征。方法用预先制备的人脱钙骨基质(DBM)与多聚左旋赖氨酸(PLL)复合制备富集材料。参照Zhang氏液体置换法测定其密度与孔隙率;三维视频显微镜、扫描电镜观察其孔径、表面及横断面超微结构;拉曼光谱分析鉴定材料成分,并进行组织学观察。结果经PLL修饰的DBM富集材料(PLL-DBM)密度为(0.27±0.02)g/ml,孔隙率为(73±11)%,孔径为(412.73±160.29)μm。孔隙内部有大量孔隙相互连通,PLL在材料内外表面形成均匀的乳白色涂层,并在天然孔隙内形成更小、孔径较均匀的网孔结构。结论制备的PLL-DBM具有自体骨三维空间结构和促进细胞粘附的PLL,是一种较理想的骨髓干细胞富集材料。

新型骨髓干细胞富集材料富集骨髓细胞的效果

背景:骨髓干细胞富集材料是目前研究热点,制备并筛选一种新型骨髓干细胞富集材料对于组织工程学发展及临床应用至关重要。目的:制备并筛选一种骨组织工程新型骨髓干细胞富集材料,应用选择性细胞滞留技术观察其富集骨髓细胞的效果。方法:用预先制备的人脱钙骨基质与不同体积分数(0.01%,0.05%,0.1%,0.5%,1%)的多聚左旋赖氨酸复合制备多聚左旋赖氨酸-脱钙骨基质材料,应用选择性细胞滞留技术富集骨髓干细胞进行实验。激光显微共聚焦拉曼光谱分析、红外光谱分析鉴定材料成分;三维视频显微镜、扫描电镜观察富集材料孔径、孔隙率、表面及横断面超微结构;对富集前后骨髓有核细胞、纤维母细胞集落形成单位和血小板进行计数分析。结果与结论:多聚左旋赖氨酸-脱钙骨基质富集材料孔隙率高,孔隙内部有大量孔隙相互连通,材料内外表面有乳白色均匀致密的多聚左旋赖氨酸涂层覆盖,并在天然孔隙内形成更小、孔径较均匀的网孔结构。体积分数0.1%多聚左旋赖氨酸制备的富集材料对人骨髓有核细胞、纤维母细胞集落形成单位和血小板的浓度富集倍数分别为(3.18±0.31)、(5.25±1.40)和(3.88±0.68)倍,相应的黏附率分别达(53±12)%,(73±13)%和(34±10)%,对纤维母细胞集落形成单位的选择率为1.41±0.34。结果证实,实验制备并筛选的经多聚左旋赖氨酸修饰的脱钙骨基质具有天然骨海绵状支架网孔结构,对骨髓细胞的选择性滞留率高,是一种较理想的骨髓干细胞富集材料。