多肽固相合成法中的3个关键点

多肽固相合成(SPPS)已成为多肽研究的一种常用手段,近年来多肽固相合成发展迅速,利用SPPS法几乎能够高收率地制备多肽。综述了固相合成中3个关键点:合成中常用的树脂载体、保护策略和缩合剂。

2-氯三苯甲基氯树脂的制备及其在多肽固相合成中的应用

以2-氯二苯甲酮为原料,与PCl5在130～140℃下加热合成1-氯-2-二氯苯甲基苯作为前体,与粒径小于30μm的1.5%二乙烯苯交联聚苯乙烯树脂进行Friedel-Crafts烷基化反应,所得2-氯三苯甲基醇用亚硫酰氯进行氯化处理,得到2-氯三苯甲基氯树脂.该制备方法简便易行且无需使用有机金属试剂,所得2-氯三苯甲基氯树脂首位氨基酸上载率和溶胀性质均优于同类树脂商品,使用该树脂合成的困难序列酰基载体蛋白65-74的固相合成收率为72%,产物纯度达到76.5%.

Fmoc多肽固相合成中氨基酸的保护

本文主要介绍Fmoc多肽固相合成中保护氨基酸的选择。

疏水载体辅助液相法与固相法合成芋螺毒素的工艺对比

目的对芋螺毒素μ-CnIIIC的三种二硫键异构体进行合成工艺研究及表征鉴定。方法通过可溶性疏水载体辅助液相合成法(LPPS)和固相多肽合成法(SPPS)人工合成μ-CnIIIC的三种二硫键异构体的线性肽,采用三步氧化法对线性肽进行氧化折叠,获得三种折叠肽异构体(μ-CnIIIC-Ⅰ、μ-CnIIIC-Ⅱ和μ-CnIIIC-Ⅲ),并对两种合成工艺进行物料消耗量、“三废”产生量、收率进行对比。结果成功合成芋螺毒素异构体并进行了质谱表征;采用SPPS法和LPPS法合成μ-CnIIIC-Ⅰ、μ-CnIIIC-Ⅱ、μ-CnIIIC-Ⅲ平均收率为15.64%、13.27%、10.56%和18.45%、17.62%、15.37%;采用SPPS法和LPPS法合成1 gμ-CnIIIC-Ⅰ、μ-CnIIIC-Ⅱ、μ-CnIIIC-Ⅲ物料平均消耗量为20.65、21.62、24.78 g和61.19、72.17、90.75 g,平均废液产生量分别为1.49、1.57、1.78 L和12.72、15.00、19.16 L。SPPS法和LPPS法比较差异均有统计学意义(P<0.05)。结论通过对芋螺毒素μ-CnIIIC异构体的合成研究,表明LPPS法的总体收率比SPPS法收率高且物料消耗量及“三废”产生量少,因此LPPS法具有重大的研究意义和商业价值。

六胜肽的固相合成

采用多肽同相合成方法,全程在无水环境中,以Fmoc-保护基保护的氨基酸和氨基树脂为原料,经N-二异丙基乙胺(DIEA)、六氟磷酸苯骈三唑-1-基-氟基三吡咯烷基(PyBoP)、I-氧-3-双二甲胺羰基苯骈三氮唑四氟化硼盐(TBTU)缩合,再用切割试剂把粗品从氨基树脂上切下来,得到目标粗肽,最后经纯化分离得到纯度在95%以上的目标肽。

脑啡肽的固相合成与LC-MS/MS分离鉴定

多肽在生命过程中扮演着重要的角色,对其生理生化功能的研究与应用,离不开对单一多肽物质的需求,而化学合成法是获取目标多肽的最有效方法之一。对合成产物的分离与鉴定,是优化合成条件,以得到高产率的重要保证。以两种内源性神经肽亮氨酸脑啡肽和甲硫氨酸脑啡肽为模型,利用Fmoc固相多肽合成策略对其进行合成,并建立了HPLC-ESI-MS/MS新方法用于所制备的亮氨酸脑啡肽和甲硫氨酸脑啡肽的分离与结构鉴定。研究结果显示,主要合成产物均为目标多肽,副产物主要包括C端丢失1个氨基酸所形成的四肽,以及由于甲硫氨酸残基氧化而形成的含甲硫氨酸亚砜的多肽。该研究为高效合成含敏感氨基酸的生理活性多肽提供了新信息。

多肽药物固相合成中的水解杂质和非对映异构体杂质的研究

对多肽固相合成中水解杂质和非对映异构体杂质进行研究。介绍了多肽合成中氨基酸水解机制和消旋机制,从合成原料、质量控制、工艺过程控制和检测方法选择等方面为多肽合成研究者提供参考。结果表明:某些氨基酸水解产生的水解杂质和消旋产生的非对映异构体杂质是多肽药物的重要有关物质之一,因此应加强对水解杂质和非对映异构体杂质的研究与控制。

微波促进催产素和赖氨加压素环肽的固相合成

以RinkAmide-MBHA树脂为载体,采用Fmoc/tBu正交保护固相合成策略,运用微波照射促进,先快速高效地合成得到载有催产素或赖氨加压素还原型多肽的树脂,再将连接在树脂上的各还原型多肽分别在微波促进条件下和常温条件下环合形成二硫键制得环肽,最后用ReagentK试剂将环肽从树脂上裂解下来得到目标多肽的粗品.利用HPLC法测定不同固相环合条件下得到的多肽粗品纯度,结果显示经微波促进固相环合得到的多肽粗品纯度明显高于常温条件下得到的多肽粗品纯度.粗品最后经过反相制备高效液相系统纯化并冻干得到目标多肽纯品,通过电喷雾质谱法测定了制得的还原型多肽及相应环肽的分子量,验证了它们的结构.

固相合成胸腺五肽(TP5)

采用Fmoc固相多肽合成中的活化酯方法和2,6-二氯苯甲酰氯(DCB)混合酸酐法,对Fmoc-Tyr(t-Bu)-OH与Wang树脂反应中的反应级数和表观活化能进行了研究,并采用常规方法和微波强化方法分别进行了胸腺五肽的合成.实验结果表明,活化酯方法的反应级数为1.855,表观活化能15.24kJ/mol,混合酸酐法的表观活化能为35.14kJ/mol.与传统方法相比,微波将缩合反应速率提高了30倍以上,氨基酸过量倍数也从传统的三倍降低到两倍.

微波强化固相合成伐普肽

以伐普肽为研究对象,用固相合成方法,并对偶合反应进行微波强化.利用正交实验研究了微波强化对偶合反应的促进作用.正交实验结果用多元非线性回归分析和响应面法优化,确定优化条件为:反应时间5 min,包括1 min升温、4 min维持,最高反应温度60 ℃.与常规偶合反应相比,提高反应效率12～36倍.常规接肽反应保护氨基酸用量与固相合成树脂摩尔数之比为3倍,在优化的微波强化反应条件下,保护氨基酸用量减少为过量1倍;保护氨基酸与树脂的偶合效率明显提高,伐普肽得率从常规合成的48%提高到76%.其结构经质谱、高分辨质谱、红外光谱、核磁共振氢谱证实,与目标化合物的结构一致.

穿膜肽TAT的固相合成及体外活性研究

目的以固相合成法合成穿膜肽TAT,并对合成产物进行活性评价。方法采用Nа-芴甲氧羰基(fluorenyl-methyloxyloxycarbonyl,FMOC)作为α-氨基的保护基,以逐个延伸的固相合成法合成穿膜肽TAT。应用高效液相色谱和质谱仪测定其纯度及相对分子质量;荧光显微镜观察穿膜肽TAT介导增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,pEGFP)质粒在体外培养人脐静脉内皮细胞中的转染效果以评价穿膜肽TAT的生物活性;MTT法检测穿膜肽TAT与质粒DNA复合物对人脐静脉内皮细胞生长活性的影响。结果高效液相色谱和质谱鉴定所制备穿膜肽TAT的纯度为96.6%,相对分子质量1880。它能够携带质粒DNA穿过细胞膜进行基因转染,并对细胞活性无明显影响。结论采用Fmoc固相肽合成法可以成功地合成有生物活性的穿膜肽TAT。

人胸腺肽α_1的固相合成及体外活性研究

目的对胸腺肽α1的固相合成工艺进行研究 ,并对合成产物进行活性评价。方法采用对碱敏感的Nα 芴甲氧羰基 (Fmoc)作为α 氨基的保护基 ,以Fmoc Asn(Trt) WangResin为起点 ,逐个延伸固相合成法合成胸腺肽α1。与Nα Fmoc 基团配套的保护策略还有 :叔丁氧羰基 (Boc)保护Lys的侧链氨基 ,叔丁酯基 (OtBu)保护Asp、Glu的侧链羧基 ,叔丁氧基 (tBu)保护Ser、Thr的侧链羟基 ,三苯甲基 (Trt)保护Asn的侧链酰胺基。采用DCC HOBt缩合剂法进行接肽反应 ,茚三酮定性显色法和水杨醛定量自由氨基检测法控制反应进程 ,肽段最后用TFA DCM(V∶V=1∶1 )定量地从树脂上切除。结果胸腺肽α1总产率为 3 3 2 %。纯化后的产物 ,经SDS PAGE和RP HPLC鉴定 ,纯度为98 8%以上 ,活性与日达仙对照品相当。结论Nα 芴甲氧羰基保护策略的固相合成方法操作简便、条件温和、副反应少 ,产品纯度高、收率高。

西仑吉肽的固相合成

采用Fmoc固相合成法,选用2-氯三苯甲基氯树脂作为固相载,HBTU/HOBt和HATU/HOBt为缩合剂,合成全保护线性肽。以V(DCM)∶V(THF)=1∶1为溶剂,HATU/HOBt为缩合剂,合成全保护环肽。最后脱除保护基得终产物西仑吉肽。

固相多肽合成中氨基酸保护的研究进展

介绍了多肽固相合成反应原料———保护氨基酸的制备、应用进展,详细讨论了氨基酸的α-氨基、α-羟基以及侧链活性基团的各种新型保护基团,概括了新型保护氨基酸的结构特点和应用条件,并对保护氨基酸今后的发展方向进行了展望。

场强化——微波、超声波技术在固相多肽合成中的应用

综述了两种场强化技术——微波和超声波在固相多肽合成中的研究进展,重点介绍了它们的作用机理、在强化多肽合成中的应用及反应器设计进展情况。

固相合成法制备环肽Hymenistatin-1及其含statine的类似物

目的研究固相合成法制备Hymenistatin-1[HS-1,序列为cyclo-(-Pro-Pro-Tyr-Val-Pro-Leu-Ile-Ile-)]及其statine类似物的工艺步骤和影响因素。方法采用Fmoc或Boc保护α-氨基,以HBTU/NMM为缩合剂进行直链肽接肽反应、以BOP/HOBt/DIEA为缩合剂进行环化固相合成HS-1及其类似物。用色谱仪和质谱仪对合成的环肽及其杂聚肽类似物进行纯化鉴定。结果多肽合成收率可达65%,经反相高效液相色谱(RP-HPLC)柱对合成的多肽进行纯化后纯度均达到90%以上,通过基质辅助激光解吸附电离飞行质谱仪(MALDI-MS)检测所合成的环肽及环肽类似物的分子质量与理论分子质量相符。结论成功合成出了较高纯度的目标多肽化合物。

抗鹅膏肽直链的固相合成分析

抗鹅膏肽直链由10个氨基酸组成.采用Fmoc固相合成法,以王氏树脂为固相载体,HBTU-HOBT为缩合试剂,50%哌啶的二氯甲烷溶液为脱保护试剂,50%醋酐的吡啶溶液为酰化试剂;配制三氟乙酸∶乙二硫醇∶水体积比为95.0∶2.5∶2.5,用其作为脱除试剂,将肽链从树脂上切割下来以后,用反相高效液相色谱(RP-HPLC)进行分析,纯度为64.22%,质谱(MS)进行鉴定,分子量为1 165.结果表明:上述实验方法适合于抗鹅膏肽直链的合成.

降糖药利拉鲁肽的固相合成及鉴定

目的探讨多肽类降糖药利拉鲁肽的合成路线及纯化方法。方法采用固相合成法、Fmoc(9-芴甲氧羰基)合成策略合成利拉鲁肽,粗品利用制备型高效液相色谱进行纯化,分析型高效液相和质谱共同鉴定产品。结果产物利拉鲁肽经鉴定,纯度为93.5%,此路线产率为10.5%。结论该方法和路线操作简单可行,可以用于实验室合成利拉鲁肽。

Fmoc固相直接法合成Aβ_(1-15)肽疫苗及其免疫活性

【目的】探讨实验室合成Aβ1-15肽疫苗的方法,并对其进行鉴定。【方法】选取Aβ42主要包含B细胞抗原决定簇的片段Aβ1-15,采用8分支多重抗原肽系统,以Fmoc固相直接法合成MAPAβ1-15;用MAPAβ1-15疫苗免疫接种C57BL/6小鼠,ELISA检测血清特异性抗Aβ抗体。【结果】用Fmoc法直接合成方法成功制备MAPAβ1-15疫苗,质谱检测其主要离子峰的相对分子质量为15458,与理论相对分子质量15451十分接近,但还有其它不同分子质量的离子峰存在。以合成的MAPAβ1-15免疫C57BL/6小鼠后,可产生高滴度的特异性抗Aβ42抗体,第3次接种后抗体平均滴度为1:467±196,第5次免疫接种后,平均滴度为1∶4367±1120。对照组的血清抗体检测基本无明显变化。【结论】Fmoc固相直接法可成功合成出MAPAβ1-15,合成出的MAPAβ1-15具有很好免疫活性。

微波作用下的多肽固相缩合反应及动力学研究

分别在微波作用以及传统加热两种方式下,研究了Fmoc-Val-OH与NH2-Tyr(t-Bu)-Wang树脂的固相缩合反应及其动力学.测定了温度变化对反应速率的影响,并获得了两种方式下的缩合反应的宏观动力学参数:300W微波作用下表观缩合反应级数为2.3,活化能为104.7kJ/mol;传统方法中表观反应级数为2.9,活化能为142.4kJ/mol.微波作用将常规条件下的连接率由68%提高到95%,而所需时间降为常规条件的1/14.