HSP70多肽复合物修饰DCs疫苗抗胰腺癌荷瘤小鼠的实验研究

目的:探讨负载热休克蛋白70多肽复合物(HSP70-PC)抗原的树突状细胞(DCs)疫苗对胰腺癌荷瘤小鼠的免疫治疗作用。方法:采用低渗裂解、ConA-Sepharose亲和层析及ADP-Agarose亲和层析法,从小鼠胰腺癌(MPC83)肿瘤组织中纯化HSP70-PC,修饰小鼠骨髓来源的树突状细胞(DCs),制备树突状细胞HSP70多肽肿瘤疫苗,用MTT法检测混合淋巴细胞反应(MLR)中HSP70-PC致敏DC对CTL的增殖及活化效果;建立MPC83荷瘤小鼠模型,观察树突状细胞HSP70多肽肿瘤疫苗对荷瘤小鼠治疗的效果和小鼠存活期。结果:经上述方法分离、纯化获得了较高纯度的HSP70-PC蛋白质;HSP70-PC在1.5～2.0μg/ml范围内可达到刺激树突状细胞最强效果,用HSP70-PC修饰的DCs能增强T细胞的增殖和活化能力;应用树突状细胞HSP70多肽肿瘤疫苗治疗荷瘤小鼠能显著抑制荷瘤小鼠肿瘤的生长,延长荷瘤小鼠存活期。结论:采用低压亲和层析柱可从胰腺癌瘤块中获得较高纯度HSP70多肽复合物,其修饰的DCs疫苗用于荷瘤小鼠免疫治疗有显著疗效,为临床胰腺癌生物免疫治疗奠定基础。

5-FC/CD自杀基因疗法结合热休克蛋白-多肽复合物瘤苗治疗小鼠黑色素瘤的研究

目的 研究 5 -氟尿嘧啶 /胞嘧啶脱氨酶 (5 FC/ CD)基因疗法与热休克蛋白 -多肽复合物 (HSP- PC)瘤苗免疫疗法联合抗肿瘤效果。方法 将携带 CD基因的重组腺病毒注射到小鼠黑色素瘤体内 ,腹腔注射 5 - FC,同时皮下接种 HSP70 - PC。结果 经联合治疗后 ,70 %荷瘤小鼠肿瘤体积缩小、消退 ,小鼠存活期延长 ,肿瘤组织明显坏死 ,炎症细胞、CD+4 及 CD+8T细胞浸润明显。结论5 - FC/ CD基因疗法结合 HSP- PC瘤苗免疫疗法抗小鼠黑色素瘤作用显著 ,具有临床应用前景。

一种适于多肽复合物分析的血红素测定方法

目的建立测定多肽复合物血红素含量的方法。方法将血红素转变为氯化血红素,用紫外分光光度法测定,检测波长399 nm。结果供试品取样量在2～10μg/mL范围内呈良好的线性关系(r=0.999 9),平均回收率(n=6)99.40%,RSD=4.00%。结论该方法简便、灵敏、准确,可作为控制血红素多肽产品质量的方法。

HSP70多肽复合物修饰树突细胞抗胰腺癌研究

目的:研究肿瘤热休克蛋白70(HSP70)多肽复合物修饰树突状细胞激活淋巴细胞治疗胰腺癌的策略和方法。方法:采用低渗裂解,ConA-Sepharose亲和层析柱及ADP-Agarose亲和层析柱,从小鼠胰腺癌(MPC83)瘤块中纯化HSP70多肽复合物;纯化出的70KD蛋白修饰小鼠骨髓来源诱导树突细胞(DC)并制备树突细胞HSP70多肽肿瘤疫苗,MTT法检测修饰后DC增殖活性;用修饰后DC激活小鼠脾淋巴细胞,MTT法检测激活淋巴细胞在不同效靶比下对MPC83的体外杀伤活性。结果:获得较高纯度分子量为70kD左右的蛋白质;50～100ngHSP70多肽复合物可修饰104树突细胞,每克瘤块能获取HSP70多肽复合物约100μg;来自MPC83细胞瘤块HSP70多肽复合物激活的淋巴细胞能特异性杀伤MPC83细胞。结论:采用低压亲和层析柱可从胰腺癌瘤块中获得较高纯度HSP70多肽复合物,HSP多肽复合物DC疫苗用于胰腺癌细胞免疫治疗能获得体外杀伤效果,为临床胰腺癌生物免疫治疗奠定基础。

二磷酸腺苷琼脂糖亲和层析法纯化HSP70多肽复合物

采用二磷酸腺苷 (ADP)琼脂糖亲和层析的方法 ,从小鼠肝脏或肿瘤组织中纯化热休克蛋白 (HSP) 70多肽复合物。用 Western blot和硝酸银染色对所纯化的蛋白质进行鉴定 ,表明纯化的蛋白质为均一的 HSP70。为了证实纯化的 HSP70是否为 HSP70多肽复合物 ,将此纯化物与 10 mmol/ L ATP,3mm ol/ L Mg Cl2 ,0 .5 mmol/ L Ca Cl2 孵育后 ,用centricon 10滤过并收集小分子片段 ,经反向高压液相色谱分析 ,发现在 2 15 nm和 2 2 0 nm有很多吸收峰 ,证明此 HSP70为 HSP70多肽复合物。一般情况下 ,采用 ADP琼脂糖亲和层析方法 1g组织可以获得 12 0μg

人肺腺癌GLC-82细胞热休克蛋白70多肽复合物的提取及对细胞毒性T淋巴细胞作用的实验研究

摘 要:目的 探讨GLC -82细胞中HAC 70的提纯方法及其诱导的CTL表型变化和CTL及其上清液抗瘤效应。方法 GLC- 82 细胞热休克诱导 HSP 表达,离子交换层析提纯 HAC 70, SDS -PAGE 和ELISA法进行定量和定性检测,活化PBMC,T淋巴细胞亚群试剂盒测定 HAC- 70 诱导 CTL细胞表型变化情况,MTT法测定CTL及上清液杀瘤活性。结果 热休克处理能使 GLC- 82 细胞 HAC- 70 表达增加,离子交换层析可提纯 GLC-82 细胞中 HAC- 70。经热休克处理的 HAC -70 诱导 T淋巴细胞,其CD3+、CD^(4+)、CD^(8+)细胞与对照组的CTL细胞阳性率明显提高,其诱导的 CTL杀瘤活性显著提高,且其CTL培养上清液肿瘤杀伤活性最高。结论 离子交换层析可提纯 GLC -82 的 HAC -70;HAC- 70 可使CTL细胞CD^(4+)/CD^(8+)倒置,活化的CTL及上清液有较高的杀瘤活性,为肺癌肿瘤疫苗的制备和临床应用提供了实验依据。

氟胞嘧啶/胞嘧啶脱氨酶自杀基因疗法结合热休克蛋白多肽复合物治疗小鼠胃癌

目的 :研究氟胞嘧啶 /胞嘧啶脱氨酶 (5 FC/CD)基因疗法与热休克蛋白 多肽复合物 (HSP70 PC)免疫疗法联合抗肿瘤效果。方法 :将携带CD基因的重组腺病毒注射到小鼠MFC瘤体内 ,腹腔注射 5 FC ,同时皮下接种HSP70 PC。结果 :经联合治疗后 ,70 %荷瘤小鼠肿瘤体积缩小 ,消退 ,小鼠存活期延长 ,细胞毒T淋巴细胞(CTL)杀伤活性增高 ,CD+ 4及CD+ 8T细胞浸润明显。结论 :5 FC/CD基因疗法结合HSP PC免疫疗法抗小鼠MFC瘤作用显著 ,具有临床应用前景。

肺癌gp96-多肽复合物/DC疫苗体外诱导CTL反应的实验研究

目的 研究热休克蛋白gp96 多肽复合物负载树突状细胞 (dendriticcell,DC)后 ,能否诱导出gp96 多肽复合物特异性的细胞毒性T细胞 (cytotoxicTlymphocyte ,CTL)反应。方法 从一例肺癌患者肿瘤组织中提取gp96 多肽复合物和自体肿瘤细胞溶解物 ,分别负载从该患者骨髓血中培养的DC。以不同形式的抗原 /DC疫苗分别刺激由患者外周血中分离的淋巴细胞。采用ELISA法检测淋巴细胞所释放的IFN γ量作为CTL反应的指标 ;以Cr51 释放实验分析致敏后的淋巴细胞对不同靶细胞的裂解和杀伤作用。结果 所有肿瘤抗原致敏淋巴细胞后均可以诱导产生CTL反应 ,其中以gp96 多肽复合物 /DC疫苗诱导释放的IFN γ量最高。肿瘤抗原致敏淋巴细胞后对原代培养的肿瘤细胞的杀伤作用高于PG细胞和K5 62细胞。结论 自体肿瘤组织中提取的gp96 多肽复合物能诱导出肿瘤特异性CTL反应 ,而负载DC后能激发起更强的CTL。

胃癌gp96多肽复合物树突状细胞疫苗对Th1/Th2平衡的影响

目的探讨gp96多肽复合物树突状细胞(dendriticcells,DCs)疫苗对Th1/Th2平衡的影响。方法从胃癌组织中提取gp96多肽复合物负载从外周血单个核细胞诱导培养的DCs,用gp96多肽复合物DC疫苗诱导同一患者Th0淋巴细胞,ELISA检测培养上清中IFNγ和IL10的水平;以胃癌细胞裂解物负载的DC疫苗作对照。结果gp96多肽复合物DC疫苗诱导的T细胞分泌IFNγ的量为(2875±177.66)pg/ml,显著高于对照组(1765±289.07)pg/ml(P<0.01);分泌IL10的量为(36±6.72)pg/ml,显著低于对照组(90±11.26)pg/ml(P<0.05),二者之间存在显著的负相关(r=-0.915,P<0.01)。结论gp96多肽复合物DC疫苗可诱导Th1/Th2平衡向Th1漂移,显示了gp96多肽复合物DC疫苗可显著提高机体的免疫能力,为临床免疫干预治疗奠定基础。

大豆纤维中的多糖—─多肽复合物

利用１ｍｏｌ／ＬＮａＯＨ溶液从大豆细胞壁物质（膳食纤维）中提出ＲＦ５，经柱层析进一步分级成ＰＲＦ５－１和ＰＲＦ５－２两种纯组分，它们均是多糖—多酚—多肽复合物。由β（１→４）糖苷键连的木聚糖构成多糖部分的主链结构，主链分别通过Ｃ３和Ｃ２分支点连有Ａｒａ和ＧｌｃＡ作为测链，ＰＲＦ５－２组分中在Ｃ３位还连有［Ａｒａ（１→４）Ｇｌｃ（１→］侧链。多酚类物质鉴定出其中主要的５种，分别是水杨酸、阿魏酸、香豆酸、香草酸和２，５－二羟基苯甲酸等。多糖与多肽之间是通过多酚（主要是阿魏酸和香豆酸）活泼羟基团的共价作用联系在一起。ＲＦ５对面团的粉质与拉伸特性有明显的改良作用。

海洋多糖多肽复合物对2型糖尿病大鼠糖耐量的影响

目的探讨海洋多糖多肽复合物对2型糖尿病大鼠糖耐量的影响。方法选取健康雄性SD大鼠10只作为正常组,另取65只采用高糖高脂饲料结合链脲佐菌素制备2型糖尿病大鼠模型。将造模成功的2型糖尿病大鼠随机分为模型组,罗格列酮组[2 mg/(kg·d)],海洋多糖多肽复合物低[2.5 m L/(kg·d)]、中[5.0 m L/(kg·d)]、高剂量组[10.0 m L/(kg·d)],每组10只。给药4周后,观察各组大鼠体质量、肝指数、肾指数以及糖耐量水平。结果与正常组相比,模型组大鼠体质量从高糖高脂饲料造模第2周开始显著升高(P<0.05),与模型组相比,给药3周后,海洋多糖多肽复合物低剂量组体质量显著增加(P<0.05);给药4周后,海洋多糖多肽复合物低、中剂量组体质量显著增加(P均<0.05),海洋多糖多肽复合物各剂量组肝指数均显著降低(P均<0.05),低剂量、中剂量组肾指数显著降低(P均<0.05);在糖耐量实验中,海洋多糖多肽复合物各剂量组各时间点血糖值及AUC均显著降低(P均<0.05)。结论海洋多糖多肽复合物可明显改善2型糖尿病大鼠的糖耐量异常。

人消化道癌组织HSP70的检测及其多肽复合物的分离研究

目的分析人消化道癌组织蛋白表达谱的差异并分离纯化食管癌组织中HSP70-多肽复合物。方法提取人食管、胃及大肠的癌组织、癌旁组织和正常组织的蛋白质,采用聚丙烯酰胺凝胶电泳方法进行电泳分析;同时以食管癌组织为材料,通过层析柱分离纯化HSP70-多肽复合物。结果相同器官的不同组织中不同分子量蛋白的种类基本一致,但丰度则表现出差异;同时分离到食管癌细胞的HSP70-多肽复合物。结论不同分子量的蛋白质在不同组织中表达的丰度不同,可能与组织细胞生命活动状态相关。HSP70-多肽复合物的分离为提取肿瘤HSP70-多肽复合物提供了具体方法,为深入研究和利用HSP70蛋白奠定了基础。

肺癌热休克蛋白70-多肽复合物的抗肿瘤免疫效应研究及其与热证的相关性

目的:观察不同证候患者肺癌组织热休克蛋白70-多肽复合物(HSP70-PC)对人类肺癌A-549细胞的抗肿瘤免疫效应,探讨其抗瘤效应是否存在证候相关性。方法:运用ADP亲和层析、DEAE离子交换层析、SDS-PAGE、Westem-blot、细胞培养、MTT检测等方法从人体肺癌组织及远端正常肺组织分离纯化HSP70-PC,观察不同证候患者肿瘤来源HSP70-PC对人外周血单个核细胞(PBMC)的激活增殖效应及致敏淋巴细胞对人肺癌A-549细胞的肿瘤细胞毒杀伤效应。结果:①热证癌PC组和非热证癌PC组促淋巴细胞增殖效应较空白对照组显著升高;所致敏淋巴细胞对人肺癌细胞均有很强的杀伤效应,与空白对照组相比,有显著性差异。②热证癌PC组较非热证癌PC组促淋巴细胞增殖效应及肿瘤细胞毒杀伤效应均有明显增高趋势。③肺癌患者远端正常肺组织HSP70-PC未见显著刺激淋巴细胞增殖作用,杀伤效应也未见明显升高。结论:人类肺癌组织HSP70-PC能够诱导针对人肺癌细胞的抗肿瘤免疫效应,其抗瘤效应很有可能与热证存在相关性。

gp96多肽复合物对树突状细胞成熟及功能的影响

目的探讨gp96多肽复合物对树突状细胞(dendriticcells,DCs)成熟及功能的影响。方法应用液相层析技术从胃癌组织中提取gp96多肽复合物,用SDSPAGE和Westernblot进行性质鉴定,将提取的gp96多肽复合物加入外周血来源的单个核细胞诱导培养DCs,采用流式细胞技术检测DCs的表型变化,用3HTdR掺入法检测DCs诱导的混合淋巴细胞反应(mixedlymphocytereaction,MLR)。结果从1g湿重的胃癌组织中可提取gp96多肽复合物30～50μg,用gp96多肽复合物诱导培养的DCs其表面分子的表达明显增高,并具有更强的刺激T淋巴细胞增殖的能力。结论从胃癌组织中可以提取出gp96多肽复合物,gp96多肽复合物可促进DCs分化成熟,使其具有更强的抗原提呈能力。

食管癌组织中HSP70的基因表达及其多肽复合物的分离

目的研究食管癌组织中HSP70的表达情况,探索HSP70-多肽复合物分离的可行性途径。方法采用人HSP70基因探针P17与人食管癌组织中提取的RNA进行Northern杂交;用亲和柱层析法分离HSP70-多肽复合物。结果癌组织提取物出现了比正常组织较强的杂交信号,从食管癌组织中提取蛋白质,经一系列层析柱(Con-Asepharose、ADP-agarose、MonoQ及HSP70抗体亲和层析柱),分离到HSP70-多肽复合物。结论HSP70基因在食管癌组织中的高表达,为提取肿瘤HSP70-多肽复合物提供了可行性方法。

食管癌细胞中热休克蛋白70-多肽复合物的分离

目的分离纯化癌细胞中热休克蛋白70(HSP70)-多肽复合物。方法以食管癌组织为材料,通过一系列的层析柱(ConA-Sepharose、ADP-Agarose、MonoQ及HSP70抗体亲和层析柱)进行分离及纯化。结果所分离纯化的HSP70-多肽复合物相对分子质量与预期相符。结论为提取肿瘤HSP70-多肽复合物提供了具体方法,并为研制多肽疫苗奠定了基础。

热休克蛋白-多肽复合物诱导肿瘤特异性免疫的机理

近年研究发现，肿瘤组织的热休克蛋白－多肽复合物具有肿瘤疫苗的免疫作用，可诱导动物产生特异性的抗肿瘤免疫应答。在诱导免疫应答中，巨噬细胞和Ｂ细胞作为抗原提呈细胞而发挥作用。

非液相等电聚焦蛋白质分离技术获取人热休克蛋白-多肽复合物

目的:利用非液相等电聚焦蛋白质分离技术(FS-IEF)从肝细胞癌(HCC)患者的癌组织的裂解液内提纯热休克蛋白多肽复合物(HSP-PCs)。制备热休克蛋白(HSP)肿瘤疫苗。方法:制备HCC细胞蛋白,经等电聚焦蛋白质分离获得目的蛋白,SDS-PAGE电泳和Western-Blot鉴定为热休克蛋白多肽复合物。利用紫外吸收法测定其浓度。结果:利用FS-IEF从HCC肿瘤细胞裂解液中成功分离提纯出HSP-PCs,分离的富含分子伴侣的细胞裂解物(CRCL)经鉴定为CRT、HSgpP96、HSP90和HSP70。这些分子伴侣蛋白沿pH梯度集中分布于4～7号收集管中,pH跨度为4.4～5.2。1g肝癌组织经液相等电聚焦分离后可产生1000μg的热休克蛋白疫苗。结论:通过非液相等电聚焦蛋白质分离技术可获得纯化的所需量的HSP-PCs。