生物纳米孔道单分子多肽磷酸化识别与测量的创新综合实验

生物纳米孔道技术是一种具有革命性意义的单分子电化学分析方法,经过近三十年的发展,已经能够实现单分子DNA测序并广泛应用于多肽、蛋白质等单个生物分子的检测研究。本文探讨了将纳米孔道单分子测量方法引入大学实验教学的必要性与重要性,介绍了生物纳米孔道单分子实验的教学意义、目的、内容及其组织实施方式。本实验采用“科教融合”的教学模式,针对具有一定化学、生物化学基础知识并对科研感兴趣的二、三年级本科生,精心设计并不断优化教学方案,将纳米孔道单分子电化学及相关交叉领域的最新研究成果融入课堂教学,拓展学生的科研视野、激发学生的科研兴趣。此外,通过教师引导,鼓励学生大胆提出问题,自主探索,合作完成实验内容,培养学生的学术思维和综合创新能力。

纳米氧化锆沉积棉花纤维的制备及其在磷酸化多肽快速富集中的应用

采用液相沉积法在棉花纤维的表面成功沉积了纳米氧化锆颗粒,并将其装填在移液枪的吸头内,通过移液枪的抽吸实现对磷酸化多肽的萃取,萃取过程只需要2 min,方法简单、快速。该材料不仅可以从β-酪蛋白酶解物这种简单的体系中萃取出9个磷酸化多肽,还可以从物质的量比为1∶100的β-酪蛋白酶解物和牛血清白蛋白(BSA)酶解物混合物这类含有大量非磷酸化多肽的复杂样品中萃取出4种磷酸化多肽,且没有非磷酸化多肽被检出,表现出较好的萃取选择性。将该材料应用于人血清和脱脂牛奶这两种复杂实际样品的酶解物中磷酸化多肽的快速富集萃取,分别检测出5种和9种磷酸化多肽,均表现出较好的选择性。

响应面法优化磷酸化改性花生分离蛋白-多肽膜的制备工艺

为了优化磷酸化改性花生分离蛋白-多肽膜制备工艺条件,在单因素基础上,通过响应面Box-Benhnken进行实验设计。结果表明,最优工艺参数:蛋白浓度8%、p H值8. 2、甘油百分含量(占蛋白) 13. 4%、黄原胶百分含量(占蛋白) 1%、时间60min、温度69℃、超声波功率270W、超声波频率28kHz、多肽溶液的浓度61mg/mL;此工艺条件下,膜厚度、吸水率和透光率理论预测值分别为86μm、41. 9%和53. 6%,验证实验值分别为88±2μm、43. 1±1. 2%和52. 4±1. 5%,两者的差值分别为2. 33%、2. 86%和2. 24%,说明响应面二次模型的拟合良好;磷酸化改性花生分离蛋白-多肽膜的抗拉强度9. 62MPa、断裂延伸率101. 68%、溶解性47. 69%、水蒸气透过率6. 95g·m-2·h-1等功能性质和DPPH自由基清除活性IC50值7. 70mg·mL^(-1)、羟自由基清除活性IC50值5. 98mg·mL^(-1)、超氧阴离子自由基清除活性IC50值4. 20mg·mL^(-1)、铁离子螯合力活性IC50值3. 79mg·mL^(-1)、铜离子螯合力活性IC50值13. 61mg·mL^(-1)、脂质过氧化抑制活性IC50值8. 62mg·mL^(-1)、铁还原力IC50值13. 93mg·mL^(-1)、钼还原力IC50值5. 49mg·mL^(-1)等抗氧化活性较磷酸化改性花生分离蛋白膜有所改善。本研究结果为磷酸化改性花生分离蛋白在蛋白膜方面的应用提供一种新途径。

聚多巴胺修饰棉花固定金属离子用于磷酸化多肽的富集

本文通过多巴胺自聚合在天然的棉花纤维表面,构建了仿生聚多巴胺(PDA)膜层,然后利用儿茶酚羟基固定Ti^(4+),设计并合成了一种固定金属亲合色谱(Immobilized Metal Ion Affinity Chromatography,IMAC)材料Cotton@PDA-Ti^(4+),并将其用于磷酸化多肽的富集。该材料机械性能好,化学性能稳定和生物相容性好,且制备过程简单,通过简易的In-pipet-tip固相萃取(SPE)装置使整个富集操作过程简便快速。实验结果表明,Cotton@PDA-Ti^(4+)不仅可以从简单的蛋白酶解物(β-casein)中富集磷酸化多肽,并且在含有大量非磷酸化多肽的复杂体系样品中对磷酸化多肽也表现出良好的选择性。另外,利用Cotton@PDA-Ti^(4+)对磷酸化多肽进行富集也有较高的效率。我们将该材料应用于实际样品,如人体血清以及脱脂牛奶酶解物中磷酸化多肽的富集,均表现出了较好的选择性。说明该方法有可能用于磷酸化蛋白质组的全分析。

固化金属离子亲和层析富集磷酸化多肽方法的选择及优化

在磷酸化蛋白质组学研究中,根据是否需要对待富集样品进行甲酯化处理,可将固化金属离子亲和层析(IMAC)方法分为两类,即需要甲酯化处理的IMAC方法(ME-IMAC)和不需要甲酯化处理的IMAC方法(Non-ME-IMAC)。要实现对磷酸化多肽的有效富集和鉴定,就必须对富集方法进行选择和优化。利用基质辅助激光解析离子化串联飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)对两种方法富集的磷酸化多肽进行了比较研究。结果表明,ME-IMAC方法容易发生样品丢失,质谱结果的分析也比较复杂,而Non-ME-IMAC方法则不仅操作简单而且富集效果理想。另外,优化了Non-ME-IMAC方法的实验条件,指出最佳的结合溶液是8%ACN/0.3%TFA,最佳的洗脱溶液是0.1mol/L EDTA(pH值8.0),从而建立了一套完整而简单有效的磷酸化多肽富集方法。

SH2域与磷酸化多肽相互作用的连续溶剂模型研究

使用连续溶剂模型方法研究了SH2结构域与磷酸化多肽pYXXX(X为20种常见氨基酸残基中的任意一种)之间的相互作用.首先计算了已知的SH2域-磷酸化酪氨酸多肽复合物之间的结合能,理论计算的结果与实验测得的亲合能之间的相关系数为0.91,验证了理论模型的正确性.然后,用该模型方法计算了SH2域与pYXXX之间的结合能,分析了磷酸化酪氨酸多肽pYXXX中+1,+2,+3位置上残基对结合能的影响.结果表明+2,+3位置上残基的变化对结合能影响较大,+2位置上带负电的残基和+3位置上的疏水性残基有利于SH2域与pYXXX之间的相互作用,这与实验结果一致.

基于Fmoc策略的O-磷酸化多肽化学合成研究

以Fmoc-策略固相合成方法为基础,以亚磷酰胺为磷酸化试剂,分别以总体磷酸化法和单体磷酸化法合成了多种磷肽、修饰磷肽及其对应的非磷酸化多肽,并以乙腈/水/0.06%三氟乙酸为洗脱体系,用HPLC对磷肽和多肽进行分离.肽链的长度增加,总体法的磷酸化效率降低;这种基于Fmoc-策略的单体磷酸化法目前只适用于含酪氨酸磷肽的合成.

磷酸化多肽的富集原理及相关富集方法的研究进展

磷酸化是生物体内广泛存在的一类蛋白质翻译后修饰,其参与了绝大多数生命活动的调控。鉴于磷酸化修饰有着重要的生物学意义,相关研究一直是不少科研工作者们关注的焦点。然而,因磷酸化蛋白具有分布广泛、相对丰度低、持续动态变化等特征,导致其分析过程存在复杂性高、效率低、难度大等问题。开发高效且稳定的样品前处理方法是实现高通量磷酸化修饰分析的关键因素之一。除基于金属氧化物亲和色谱法、固定化金属亲和色谱法的经典富集材料之外,近十年来,一些通过离子交换、氢键、配体交换、疏水作用等方式分离磷酸化多肽的新型材料也逐渐得到应用。本文简述了这些新兴富集方法的原理及研究进展。

运用生物质谱分析磷酸化多肽合成中的主产物

蛋白质磷酸化是生物体内非常重要的翻译后修饰,磷酸化多肽及其类似物对研究和阐明蛋白质磷酸化修饰对生命活动的调节机制具有十分重要的作用,采用4-磺酸苯异硫腈酸酯修饰,源后衰减基质辅助激光解吸／电离飞行时间质谱(PSD-MALDI)模式分析合成磷酸化多肽,建立了一种简便易行的磷酸化多肽鉴定及定位方法。

磷酸化蛋白质分析

蛋白质的磷酸化过程是人体内翻译后修饰的重要一步,非正常的磷酸化会导致人体产生各种疾病。近年来,通过分析化学的手段研究磷酸化的过程取得了很大的进展。该文就蛋白激酶分析、磷酸化多肽的富集方面的国内外的研究进展进行了综述。

植物磷酸化蛋白质组研究进展

在介绍磷酸化蛋白富集技术和质谱技术的基础上,综述了近年来磷酸化蛋白质组的研究进展,并对其研究前景进行了展望。

磷酸化蛋白质（多肽）组学分析与筛查急性白血病特异性分子标志

目的筛查与分析急性白血病特异性的磷酸化蛋白质或多肽。方法对16例初治急性淋巴细胞白血病（ALL）和20例急性髓系白血病（AML）患者骨髓单个核细胞行蛋白多肽抽提及纯化，采用免疫沉淀及结合高效液相质谱-串联质谱分析，筛查特异性分子标志物。结果①非受体型酪氨酸蛋白激酶家族的Fyn、Yes和Src等在急性白血病中广泛表达；②非受体型酪氨酸蛋白激酶家族的Abl／isol、Abl，非受体型丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶家族的Bcr、JNK2、JNK2is02，结合器／支架类的Cas—L、Cbl、CrkLCENTD1（Centaurin deltal）ZO2，转录调节因子GFR—1及磷酸酯酶SHIP-2，这些磷酸化的蛋白见于Ph染色体阳性ALL，基本不表达于其他ALL；③Hck、Lyn和Fgr选择性地与AML相关（M3除外）。结论ALL和AML存在相对特异的磷酸化多肽，为急性白血病的诊断及治疗提供了潜在的分子靶位。

电化学检测磷酸化多肽的研究

建立了一种非探针标记型磷酸化多肽的电化学检测方法,该方法以N,N-二(羧甲基)-L-赖氨酸(Lys-NTA)和Fe3+修饰的金电极作为磷酸化多肽的捕获和传感界面,利用磷酸化多肽能够与之形成金属离子螯合物而发生特异性结合并引起电极表面修饰层通透性改变等特点,采用铁氰化钾作为电化学指示剂,用循环伏安法和交流阻抗法对磷酸化多肽的结合进行表征和检测。磷酸化多肽浓度在5～75μmol/L时,循环伏安图中峰电流随着磷酸化多肽浓度的增大而增大,而非磷酸化多肽不能引起峰电流变化,表明该电极体系能够特异识别磷酸化多肽,并实现灵敏快速的检测。