多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶2(Polypeptide:N-Acetylgalactosaminyltransferases,pp-GalNAc-T2,E.C.2.4.1.41)的mRNA表达谱研究

多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶2是O-糖链合成第一步的糖基转移酶,而O-糖基化与血管内皮细胞的功能密切相关。随着近年来人类基因组计划的迅速发展,人们对糖基转移酶的功能也开始有了新的认识。本文采用RT—PCR法观察了六种不同组织中PP-CallNAC-T2的表达水平,发现PP—GalNAc—T2在胃肠道粘膜等呈高表达,在脑组织中也有一定的表达,提示它在不同组织中的分布与组织功能存在相关性,值得进一步研究。

多肽-N乙酰氨基半乳糖转移酶10在肺癌中的表达及意义

目的探讨检测多肽-N乙酰氨基半乳糖转移酶10(ppGalNAc-T10)单细胞技术与应用蛋白在肺癌、乳腺癌和结肠癌中的表达。方法采用免疫组织化学检测ppGalNAc-T10在110例肺癌组织、100例乳腺癌组织和110例结肠癌组织中的表达;不同的肿瘤均有10例相对应的正常组织作为对照。结果同正常肺组织相比较,ppGalNAc-T10在肺癌组织中表达较低;且ppGalNAc-T10的表达与肿瘤侵袭深度相关(P<0.01)。PpGalNAc-T10蛋白在乳腺癌和结肠癌及其相对应的正常组织的表达差异无显著性。结论PpGalNAc-T10在肺癌中,有可能成为的1个有效标记蛋白。

多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶-2在不同肿瘤组织中mRNA的表达差异

目的 :观察三种不同肿瘤组织中ppGalNAc T2的表达差异 ;方法 :本文采用RT PCR方法从mRNA水平上研究其表达 ,同时在同一反应管中进行内对照 β 微球蛋白的扩增以进行半定量分析 ;结果 :ppGalNAc T2在不同肿瘤组织中 ,其在肿瘤部分、癌旁部分与正常部分的表达水平不具有一致性 ;结论 :ppGalNAc T2具有组织特异性 ;不同肿瘤组织的糖基转移酶作为肿瘤标志基因有待进一步的研究。

冬凌草甲素下调N-乙酰氨基半乳糖转移酶14(pp-GalNAc-T14)表达对肾癌细胞的体外抑制作用

目的探讨冬凌草甲素下调N-乙酰氨基半乳糖转移酶14(polypeptide N-acetylgalactosaminy-transferase 14,pp-GalNAc-T14)表达对人肾癌细胞的体外抑制作用。方法收集20例根治性肾癌切除标本的肾癌组织和相对应的癌旁正常组织,用RT-PCR法检测肾癌组织和癌旁正常肾组织中pp-GalNAc-T14mRNA的表达情况;用单四唑(MTT)法观察冬凌草甲素对该细胞系(786-0人肾透明细胞癌细胞系)的抑制杀伤效果,并运用RT-PCR法检测用药前后pp-GalNAc-T14mRNA的表达情况。结果 (1)肾癌组织和正常肾组织中pp-GalNAc-T-14mRNA均有表达,扫描定量显示pp-GalNAc-T14mRNA的表达在肾癌组织中较正常肾组织高34.91%(P<0.05)。(2)冬凌草甲素作用于786-0细胞后,细胞中pp-GalNAc-T14表达较空白对照组24h下降15.98%、48h下降44.30%、72h下降58.61%,差异均有统计学意义(P<0.05)。(3)冬凌草甲素可以抑制肾癌细胞的增殖,随着冬凌草甲素剂量的增加和作用时间的延长,其抑制细胞增殖作用逐渐增强,呈明显的时间剂量依赖性。16μmol/L的冬凌草甲素引起的生长抑制明显高于8μmol/L的抑制率(P<0.05),最高可达90%以上。结论 pp-GalNAc-T14通路与肾癌的发生可能有关;冬凌草甲素可以下调O-糖链的起始糖基化转移酶pp-GalNAc-T14的表达,产生抑制肾癌细胞的作用;冬凌草甲素可能成为RCC治疗的新策略。

人多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶2(ppGalNAc-T2)RNA干扰载体的构建及鉴定

目的:构建稳定的转染人多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶2(ppGalNAc-T2)基因的RNA i载体。方法:遵循RNA干扰目标序列的选取原则,对ppGalNAc-T2基因mRNA序列设计五条可能的小干扰RNA(siRNA),PCR方法扩增得到siRNA内源表达系统,转染至人胃癌细胞株SGC7901,运用RT-PCR方法检测筛选得到其中能高效引起ppGal-NAc-T2基因表达沉默的siRNA;化学合成带荧光标记的该段RNA O ligo,转染细胞并用荧光显微镜观察转染情况,进一步鉴定该siRNA对ppGalNAc-T2的抑制作用;构建ppGalNAc-T2的RNA干扰真核表达载体,酶切及测序鉴定后转染SGC7901细胞并经G418筛选得到稳定的ppGalNAc-T2基因敲减细胞株,RT-PCR方法检测该转染细胞株ppGalNAc-T2表达水平。结果:采用RNA i技术,将高表达ppGalNAc-T2的SGC7901细胞的T2表达水平明显降低。结论:成功构建稳定的ppGalNAc-T2基因敲减细胞株,为今后进一步深入研究ppGalNAc-T2的生物学功能奠定了基础。

多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶2真核表达载体的构建及在SHG-44细胞的表达

目的 :为探讨O 糖基化在肿瘤发生发展及转移中的作用和功能 ,构建pcDNA3/ppGalNAc T2真核表达质粒并转染人神经胶质瘤细胞SHG 4 4。方法 :采用PCR技术从pDONR2 0 1 T2得到ppGalNAc T2全长编码序列 ,亚克隆至真核表达载体pcDNA 3 1,脂质体介导基因转染人神经胶质瘤细胞SHG 4 4细胞 ,采用RT PCR法检测重组质粒的表达。结果 :酶切图谱分析和基因测序证实pcDNA3 1 T2真核表达质粒构建成功。RT PCR显示转染细胞有T2的表达。结论 :成功构建了真核表达载体pcDNA3 1 T2 ,并成功转染入SHG 4 4细胞 ,为进一步研究ppGalNAcT2的功能奠定了基础。

人多肽N-乙酰氨基半乳糖转移酶2基因反义RNA表达质粒的构建及其功能的初步研究

反义封闭人多肽N-乙酰氨基半乳糖转移酶2(pp-GalNAc-T2)的基因表达,对胃癌细胞SGC7901中转化生长因子-β1(TGF-β1)与基质金属蛋白酶2(MMP2)基因表达及细胞增殖有影响.在对几株肿瘤细胞的pp-GalNAc-T2基因表达水平进行分析后,以高表达pp-GalNAc-T2的人胃癌细胞株SGC7901的总RNA为模板,利用RT-PCR方法扩增两段不同长度pp-GalNAc-T2基因片段,构建反义表达载体转染胃癌细胞SGC7901,通过G418筛选,建立一系列旨在封闭胃癌细胞SGC7901ppGalNAc-T2基因表达的亚细胞克隆.通过流式细胞术、荧光显微镜、RT-PCR及Western印迹检测反义封闭pp-GalNAc-T2基因RNA表达后胃癌细胞SGC7901增殖以及TGF-β1、MMP2表达水平的变化.反义封闭pp-GalNAc-T2基因表达后,胃癌细胞SGC7901 pp-GalNAc-T2的表达水平明显降低,细胞分裂增殖减慢,表明反义封闭pp-GalNAc-T2基因表达对胃癌细胞SGC7901的生长增殖有影响.结果还显示,反义封闭pp-GalNAc-T2基因表达可使TGF-β1、MMP2基因在mRNA与蛋白质表达水平均增加,提示pp-GalNAc-T2基因表达可能对胃癌细胞SGC7901浸润转移产生影响.以上结果表明,pp-GalNAc-T2基因在肿瘤细胞中广泛表达,并可能与肿瘤的增殖及浸润转移相关.

多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶2的原核表达、纯化及酶活检测

目的:以人类多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶2(ppGalNAc-T2)为研究对象,利用载体pGEX-5X-3在大肠杆菌(E.Coli)BL21中原核表达其编码序列,并对表达产物进行纯化、复性及酶活检测。方法:首先利用PCR技术从克隆载体pDONR201-T2得到ppGalNAc-T2全长编码序列,将其亚克隆至原核表达载体pGEX-5X-3,形成重组表达质粒pGEX-5X-3/T2。重组质粒转化大肠杆菌DH5α,测序鉴定后转化BL21,异丙基硫代半乳糖(IPTG)诱导后,表达产物为主要以包涵体形式存在的融合蛋白。对其复性后用谷胱甘肽-琼脂糖(G lutath ione-Sepharose)4B亲和层析柱进行纯化。然后根据ppGalNAc-T2的催化功能,设计底物,建立酶促反应体系,利用高效液相色谱(HPLC)进行酶活分析。结果:成功构建了原核表达重组载体pGEX-5X-3/T2,通过蛋白质电泳检测到分子量约为90 kD的融合蛋白的表达,利用亲和层析得到纯化的酶蛋白,并经W estern印迹得以验证。反应后体系上柱洗脱后出现酶促反应的产物洗脱峰。结论:成功构建了重组表达载体pGEX-5X-3/T2,ppGalNAc-T2全长编码序列被成功表达、纯化及复性,检测到具有酶活性。

采用TOPO-TA克隆法建立多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶基因家族cDNA文库

目的:通过实验方法建立多肽N-乙酰氨基半乳糖转移酶基因家族cDNA文库,欲以此为基础对人体不同肿瘤细胞中的该基因家族进行表达谱分析。方法:主要为PCR和TOPO-TA克隆技术。结果:通过电泳图谱初步证实了这一家族的不同成员均已得到有效的扩增,并获得了相应的片段库。结论:多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶基因家族cDNA被成功扩增,并建立了该基因家族的cDNA文库。

人类多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶家族分子进化的初步研究

目的:探讨人类多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶家族成员间的同源性,揭示其进化规律。方法:采用生物信息学软件和网上数据库对核酸蛋白质序列进行同源比较,结构域分析和进化树绘制。结果:人类多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶家族一级结构、二级结构均有较高的同源性,系统进化树显示各成员来源于同一祖先并在不同时期分野。结论:各成员来自于同一祖先的同一家族,其进化方式属于趋异性进化。

茯苓多糖对受照射白血病K562细胞N-乙酰氨基半乳糖转移酶-9和自由基等的影响

目的用化学方法提取茯苓多糖,并观察其对肿瘤细胞的作用。方法利用乙酸沉淀法、DEAE-纤维素层析法提取并分离茯苓多糖,并运用RT-PCR方法和流式细胞技术,检测其对受照射后肿瘤细胞的多肽：N-乙酰氨基半乳糖转移酶-9(ppGalNAc-T9)mRNA表达、自由基活力以及细胞周期的影响。结果茯苓多糖可使经γ射线照射后的K562细胞中的自由基增多、ppFalNAc-T9表达增高、G_1期受阻明显。结论茯苓多糖对肿瘤细胞中自由基具有一定的清除作用,同时还可以增加ppGalNAc-T9在mRNA水平的表达。

多肽：N-乙酰氨基半乳糖转移酶-2与共刺激分子B7-H3相互作用的结构信息学初步探讨

目的 研究多肽：N-乙酰氨基半乳糖转移酶-2（ppGalNAc-T2）与共刺激分子B7-H3的相互关系.方法 通过同源模拟,得到共刺激分子B7-H3两种不同剪接体（2IgB7-H3,4IgB7-H3）的分子结构,寻找PDB数据库中的ppGalNAc-T2的蛋白质晶体结构,利用软件GRAMM（http：//vakser.bioinformatics.ku.edu/main/resources_gramm.php）,与同源模拟得到的两种不同剪接体的B7-H3分子结构相结合,寻找两者之间是否存在直接结合的可能.结果 成功地模拟了共刺激分子B7-H3两种剪接体的分子结构,发现ppGalNA-T2与共刺激分子B7-H3有相互结合的可能性.结论 结构生物信息学的研究发现ppGalNAc-T2分子与B7-H3具有潜在相互作用位点,ppGalNAc-T2可能参与B7-H3蛋白质的O-糖链合成反应,并且很有可能是通过直接接触来催化控制B7-H3分子的O-糖链合成.

小鼠多肽：N一乙酰氨基半乳糖转移酶家族分子进化的初步研究

目的探讨小鼠多肽：N-乙酰氨基半乳糖转移酶家族成员间的同源性，揭示其进化规律。为多肽：N-乙酰氨基半乳糖转移酶家族各成员间结构相似但功能不同的特征提供一定的依据。方法采用生物信息学软件和网上数据库对核酸、蛋白质序列进行同源比较，结构域分析和进化树绘制。结果小鼠多肽：N-乙酰氨基半乳糖转移酶家族一级结构、二级结构均有较高的同源性，系统进化树显示各成员来源于同一祖先并在不同时期分野。结论各成员来自于同一祖先的同一家族，结构相似，但其进化方式属于趋异性进化。

食管鳞状细胞癌组织pp-GalNac-T10高表达与淋巴结转移有关

目的研究多肽N-乙酰氨基半乳糖转移酶10(pp-GalNac-T10)在食管鳞状细胞癌(ESCC)组织中的表达水平及其与临床指标的关系。方法对120例ESCC患者的组织芯片,采用免疫组织化学法检测pp-GalNac-T10在ESCC中的表达,并分析其表达与临床病理参数之间的关系。结果 ESCC组织中pp-GalNac-T10表达与癌旁组织类似,但pp-GalNac-T10表达的阳性率与ESCC淋巴结受累、TNM分期情况相关,pp-GalNac-T10在发生转移患者的癌组织表达强度明显高于未发生转移患者的癌组织。结论 pp-GalNac-T10的表达与ESCC的淋巴结转移有关。

siRNA下调Smad3基因后对多肽N-乙酰氨基半乳糖转移酶表达的影响

目的以Smad3基因为研究对象,筛选出该基因的有效siRNA干扰载体,并探讨下调表达Smad3基因对多肽N-乙酰氨基半乳糖转移酶(ppGalNAcTs)家族mRNA水平表达的影响。方法将事先构建的3个带有荧光标记的干扰载体分别转染人肝星状细胞株(HSC)中,通过RT-PCR、Western blot方法分别从mRNA水平及蛋白水平检测干扰效率。并通过转染有效的Smad3基因的siRNA表达载体,检测下调Smad3以后对糖基转移酶ppGalNAcTs家族mRNA表达的影响情况。结果成功筛选到Smad3基因的有效siRNA干扰载体,检测出转染了Smad3的siRNA表达载体的肝星状细胞中Smad3的mRNA和蛋白表达都受到了抑制,而糖基转移酶ppGalNAcTs的mRNA表达也随之发生了一些变化。结论成功筛选到一个Smad3基因的siRNA干扰载体,继而可转染人肝星状细胞,并抑制其中Smad3蛋白的表达,为研究siRNA方法在肝纤维化中的治疗作用提供了实验基础和理论支持。

疾病及发育中多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶ppGalNAc-T的重要性

蛋白质的O-GalNAc糖基化是生物体内广泛存在的一种重要的蛋白质翻译后修饰,参与了众多生命活动过程。多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶(ppGalNAc-T酶)是调控蛋白质O-GalNAc糖基化修饰的起始糖基转移酶,它催化N-乙酰氨基半乳糖(GalNAc)共价结合到蛋白质丝氨酸或苏氨酸的侧链羟基上,形成Tn糖链抗原结构。人体内ppGalNAc-T酶家族共有20个成员,各成员在不同的组织和细胞中的表达具有时空特异性,同时对其修饰的底物蛋白存在选择性。ppGalNAc-T酶的异常表达与组织器官发育,以及肿瘤、家族性钙质沉积、冠心病、阿尔兹海默症、先天性心脏病等复杂性疾病的发生发展密切相关。该文总结了近年来关于ppGalNAc-T酶在组织器官发育过程以及复杂性疾病发生发展中的研究概况,为深入理解ppGalNAc-T酶和O-糖基化的功能及其生物学意义提供参考。

ppGalNac-T10对人结直肠癌细胞株LoVo的生物学特性的影响

探讨多肽N-乙酰氨基半乳糖转移酶10(ppGalNAc-T10)对人结直肠癌细胞株LoVo细胞特性的影响.ppGalNAc-T10正义真核表达载体pcDNA3.1-T10(+)、反义真核表达载体pcDNA3.1-T10(-)与空载体pcDNA3.1分别转染LoVo细胞,Western blot检测ppGalNAc-T10蛋白水平表达的变化,确定转染效果.CCK8法检测转染后各实验组细胞增殖的变化,细胞划痕实验检测细胞迁移能力的变化,穿膜实验检测细胞侵袭能力的变化.Western blot证明各实验组经转染不同ppGalNAc-T10载体后,ppGalNAc-T10蛋白表达量发生变化,转染pp-GalNAc-T10正义真核表达载体的LoVo细胞,ppGalNAc-T10的蛋白表达量增加,同时细胞的增殖受到抑制,迁移能力和侵袭能力降低;而转染ppGalNAc-T10反义真核表达载体的LoVo细胞,ppGalNAc-T10的蛋白表达量降低,细胞生长加快,迁移能力和侵袭能力增强.ppGalNAc-T10可能影响人结直肠癌细胞株LoVo细胞的增殖、迁移能力和侵袭能力.

壳聚糖对白血病细胞糖基转移酶表达的影响及对细胞的抑制作用

目的:观察壳聚糖对白血病细胞(K562,SHI-1)的作用。方法:以不同浓度的壳聚糖处理白血病细胞K562后,运用RT-PCR方法检测实验组K562细胞中多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶-2(ppGalNAc-T2)mRNA表达差异。另用不同浓度的壳聚糖分别作用于白血病K562细胞和SHI-1细胞,MTT法检测壳聚糖对两种细胞的相对抑制率。结果:与阴性对照组比较,实验组K562细胞的ppGalNAc-T2表达降低,且随壳聚糖浓度升高,表达量进一步减少;MTT实验显示不同浓度的壳聚糖对K562细胞和SHI-1细胞均有抑制作用,并呈浓度依赖性。结论:壳聚糖对肿瘤细胞有一定的抑制作用,同时还可以减少ppGalNAc-T2在mRNA水平的表达。

黏蛋白型O-聚糖在人类肿瘤中的结构异常及生物学功能

黏蛋白是细胞表面的或分泌的、具有高度O-糖基化修饰的糖蛋白.在黏蛋白中,O-聚糖(O-glycan)是通过N-乙酰氨基半乳糖与丝氨酸或苏氨酸之间形成α连接,该结构即被称为黏蛋白型O-聚糖.黏蛋白型O-聚糖是由多肽∶N-乙酰氨基半乳糖转移酶(ppGalNAc-T)家族催化起始合成的,近年来,该酶的催化机制及结构特点已成为糖基转移酶研究的热点.在肿瘤中常常伴随着黏蛋白型O-聚糖结构上和数量上的改变,形成肿瘤特异聚糖结构(cancer-associated glycans),如肿瘤Tn和T抗原等.肿瘤特异聚糖使肿瘤细胞的抗原性和黏附能力发生改变,促进肿瘤细胞的恶性增生与转移.而这些肿瘤特异聚糖结构,也为肿瘤的诊断与抗肿瘤药物或疫苗开发提供了理论基础.

ppGalNAcT2反义RNA对胃癌细胞SGC7901生物学特性的影响

目的:研究人胃癌细胞SGC7901中多肽N-乙酰氨基半乳糖转移酶2(pp-GalNAc-T2)基因表达与肿瘤转移相关基因MMP2,TGF-β1表达的相关性,以及对细胞增殖和形态生物学特性的影响。方法:用两个已构建好的反义表达载体转染胃癌细胞SGC7901,通过G418筛选,建立一系列旨在封闭胃癌细胞SGC7901ppGalNAc-T2基因表达的亚细胞克隆。通过共聚焦显微镜,RT-PCR检测反义封闭pp-GalNAc-T2基因RNA表达后,胃癌细胞SGC7901中TGF-β1,MMP2表达水平,细胞增殖以及形态的变化。结果:反义封闭pp-GalNAc-T2基因表达后,胃癌细胞SGC7901pp-GalNAc-T2的表达水平明显降低,细胞的形态发生改变,分裂增殖减慢。结果还显示,反义封闭pp-GalNAc-T2基因表达可使TGF-β1,MMP2基因在mRNA表达水平均增加,提示pp-GalNAc-T2基因表达可能对胃癌细胞SGC7901浸润转移产生影响。结论:pp-GalNAc-T2可能在肿瘤的增殖、浸润和转移中发挥作用。