猫多能性基因慢病毒表达载体的构建与鉴定

从含有猫Oct4、Sox2、Klf4及c-Myc的质粒中获取目的基因,将目的基因与携带绿色荧光蛋白(GFP)的慢病毒载体LV5进行定向连接,构建慢病毒表达载体LV-Oct4、LV-Sox2、LV-Klf4、LV-c-Myc,将其连接产物分别转化至细菌感受态细胞中,经筛选阳性克隆、酶切鉴定后测序,通过lipofectamine2000介导转染293T细胞对慢病毒进行包装并测定病毒滴度,探讨猫多能性基因Oct4、Sox2、Klf4及c-Myc慢病毒载体的构建与包装。结果表明:经双酶切鉴定及测序分析,成功构建并包装出LV-Oct4、LV-Sox2、LV-Klf4及LV-c-Myc慢病毒载体,基因测序结果与目标序列完全一致,且病毒滴度均达到107 TU·mL-1以上。说明成功地构建了猫多能性基因慢病毒表达载体,获得稳定产生慢病毒颗粒的包装细胞株。

囊胚期玻璃化二次冷冻对小鼠胚胎组蛋白表观修饰及多能性基因表达的影响

背景:在辅助生殖工作中,玻璃化二次冷冻可以有效提高胚胎利用率。课题组前期研究结果显示,不同发育时期的玻璃化二次冷冻显著影响胚胎发育,但其机制尚不明确。目的:探讨不同时期玻璃化二次冷冻影响胚胎发育潜力的可能机制。方法:收集ICR小鼠体内受精的2-细胞胚胎并进行体外培养,随机分为4组:对照组、8-细胞冷冻一次组(8C)、8-细胞冷冻一次解冻后于8-细胞期(8C-8C)或培养至囊胚期(8C-BL)再次冷冻。利用免疫荧光分析囊胚期H3K4me3、H3K9me2及H3K9AC的表达水平;实时荧光定量PCR分析多能性基因Cdx2、Oct4及Sox2的转录水平。结果与结论:①免疫荧光结果显示,一次和二次冷冻均会导致囊胚期H3K9me2(P<0.01)及H3K9AC水平显著上升(P<0.0001);②一次冷冻不影响H3K4me3水平,但二次冷冻组H3K4me3水平显著下降,且在8C-BL组下降尤为严重(P<0.0001);③实时荧光定量PCR结果显示,一次冷冻及8-细胞期二次冷冻不会影响胚胎多能性基因Cdx2、Oct4和Sox2的表达水平,但8C-BL组胚胎多能性基因表达水平显著改变,Oct4的表达水平显著下降(P<0.01),而Cdx2(P<0.001)和Sox2(P<0.01)的表达水平显著上升;④结果表明,玻璃化二次冷冻对小鼠胚胎的表观遗传具有一定的负面影响,且囊胚期二次冷冻显著影响H3K4me3修饰及多能性相关基因表达水平。

JNK信号通路对犬骨髓间充质干细胞多能性基因表达的影响

旨在探讨c-Jun氨基末端激酶(JNK)信号通路对犬骨髓间充质干细胞(cBMSCs)多能性基因的影响。采用密度梯度分选法提取cBMSCs,培养至第3代应用流式细胞术鉴定细胞表面标记物后,将其分为对照组、添加JNK信号通路抑制剂SP 600125的抑制组培养。采用MTT法检测细胞活性,荧光定量PCR检测JNK信号通路相关基因Ras相关的C3肉瘤毒素底物1(RAC 1)、激活转录因子2(ATF 2)和多能性相关基因多梳蛋白4(CBX 4)、性别决定基因相关转录因子2(Sox 2)的mRNA转录水平。流式细胞术检测培养细胞的结果显示,CD34、CD11a、CD45为阴性,CD44和CD90为强阳性,符合间充质干细胞细胞表面标记物特点。与对照组相比,抑制组细胞存活率升高,JNK信号通路因子RAC 1、ATF 2 mRNA转录水平明显下降,多能性相关基因CBX 4、Sox2的mRNA表达水平明显升高。结果表明通过抑制JNK信号通路有助于cBMSCs多能性基因的表达从而维持cBMSCs的多能性。

Pladienolide B对牛胚胎干细胞多能性相关基因表达及细胞活力的影响

【背景】牛胚胎干细胞(bovine embryonic stem cells,BESCs)因具备较高的多能性,在牛品种保存、品种选育及研究家畜胚胎发育调控机制方面具有重要的应用价值。然而,BESCs多能性维持及分化调控的研究相对缺乏,很多机制仍不清楚。【目的】探究不同浓度Pladienolide B(PlaB)对BESCs多能标记基因、全能标记基因、胚胎细胞谱系基因表达及细胞活力的影响,为提高BESCs多能性提供参考和理论依据。【方法】利用免疫荧光检测牛BESCs多能标记基因的表达,利用实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR,RT-qPCR)检测不同浓度PlaB对BESCs剪接体、全能标记基因及胚胎细胞谱系基因表达的影响,利用RT-qPCR和Western Blot分别检测不同浓度PlaB对BESCs多能标记基因mRNA和蛋白表达的影响,利用CCK8和EDU染色检测不同浓度PlaB对BESCs增殖的影响。【结果】RT-qPCR结果显示,PlaB浓度为0.5—1.5 nmol·L^(-1)时显著下调EPSCM-BESCs中SF3B1和SF3B2的mRNA表达水平;PlaB浓度为1.5nmol·L^(-1)时,CTFR-BESCs中SF3B1和SF3B2的mRNA表达下降;PlaB浓度范围为0.5—1.5 nmol·L^(-1)时,CTFR-BESCs和EPSCM-BESCs的SF3B4和SF3B5的mRNA表达水平呈剂量依赖性增加。此外,PlaB显著下调CTFR-BESCs中SF3B6的mRNA表达。PlaB浓度为0.5—1.5 nmol·L^(-1)时,EPSCM-BESCs和CTFR-BESCs中剪接体LSM4的mRNA表达显著下调。PlaB浓度为0.5—1.5 nmol·L^(-1)时,显著下调CTFR-BESCs的EFTUD2 mRNA表达水平;PlaB浓度为1—1.5 nmol·L^(-1)时能显著下调BEPSCM-BESCs的EFTUD2 mRNA表达水平。浓度为0.5—1.5 nmol·L^(-1)范围内,PlaB均以剂量依赖性上调CTFR-BESCs和EPSCM-BESCs中多能标记基因OCT4、SOX2及NANOG的mRNA表达水平和蛋白水平。在PlaB浓度为0.5—1.5 nmol·L^(-1)范围内,PlaB以剂量依赖性上调CTFR-BESCs和EPSCM-BESCs中全能标记基因MDM2、PID1及BTG2的mRNA表达水平,而下调DDIT4和PDRG1的mRNA表达水平。CTFR-BESCs中添加PlaB均上调胚胎细胞谱系基因的表达,而EPSCM-BESCs中添加PlaB显著降低GATA4、GATA6、SOX7等胚胎细胞谱系基因的表达,但是对于ZIC1没有显著影响。随着PlaB剂量增加和处理时间延长,CTFR-BESCs和EPSCM-BESCs细胞活力均呈下降趋势,但CTFR-BESCs比EPSCM-BESCs更敏感。【结论】PlaB显著上调CTFR-BESCs和EPSCM-BESCs中多能标记基因和部分全能标记基因的表达;降低EPSCM-BESCs中胚胎细胞谱系基因的表达和细胞活力。PlaB对两种BESCs发挥作用的浓度及对基因表达的影响并不完全一致。由于PlaB降低BESCs的细胞活力,仍需要进一步研究以优化培养体系。

高内涵筛选技术联合多能性基因Oct4、Sox2和Nanog检测建立药物胚胎毒性快速筛查方法

目的通过高内涵筛选技术评价测试药对PA-1细胞的增殖毒性,并联合分化毒性的评价指标——多能性基因(Oct4、Sox2和Nanog)表达检测,初步建立药物胚胎毒性快速筛查方法。方法选择维生素C、青霉素G、维生素E作为无胚胎毒性的阴性测试药,甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶、环磷酰胺作为具有胚胎毒性的阳性测试药。以测试药临床治疗剂量下的最大血药浓度(C_(max))为基础设置加药浓度,阴性测试药设置浓度梯度为:1/2C_(max)、C_(max)、2C_(max)、3C_(max)、4C_(max);阳性测试药设置浓度梯度为:1/8C_(max)、1/4C_(max)、1/2C_(max)、C_(max)、2C_(max)。测试药物在维持培养液(培养液加入1×10^(6) U·L^(-1)的白血病抑制因子)中作用于PA-1细胞24 h后,基于高内涵筛选技术,应用DAPI、Calcein-AM、PI共染PA-1细胞,通过共聚焦成像检测荧光强度,计算细胞存活率;测试药物在分化培养液(不加入白血病抑制因子)中作用于PA-1细胞24 h后,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测多能性基因Oct4、Sox2和Nanog的表达变化。结果DAPI、Calcein-AM、PI 3者共染可以很好地区分活细胞及死细胞;阴性测试药维生素C、维生素E、青霉素G对PA-1细胞的增殖能力均无影响;与对照组比较,阳性测试药5-氟尿嘧啶、甲氨蝶呤1/4C_(max)及以上浓度引起PA-1细胞存活率显著下降(P<0.05);环磷酰胺1/8C_(max)及以上浓度引起PA-1细胞存活率显著下降(P<0.05)。阴性测试药维生素C、维生素E、青霉素G对PA-1细胞多能性基因Sox2、Oct4、Nanog的表达均无影响。与对照组比较,阳性测试药5-氟尿嘧啶1/8C_(max)及以上浓度使PA-1细胞多能性基因Sox2、Oct4、Nanog的表达显著下降(P<0.05);甲氨蝶呤1/8C_(max)及以上浓度使Oct4、Nanog的表达显著增加(P<0.05),但当浓度达到2C_(max)时对Sox2的表达依然没有影响;环磷酰胺1/8C_(max)及以上浓度使Sox2、Oct4、Nanog的表达均显著增加(P<0.05)。结论高内涵筛选技术(DAPI、Calcein-AM、PI共染)联合多能性基因的检测可初步建立药物胚胎毒性快速筛查方法。

人胚生殖嵴干细胞多能性调节基因Oct4的克隆及其在大肠杆菌中的表达(英文)

目的 :克隆人胚生殖系细胞多能性调节基因Oct4 ,并使其在大肠杆菌中表达。 方法 :取 4～ 6周人胚胎分离生殖嵴和背侧肠系膜 ,利用RT PCR技术扩增编码Oct4的全长cDNA ,并插入到原核表达载体 pGEX5T中 ,构建成 pGEX5T Oct4重组质粒。β硫代半乳糖苷 (IPTG)诱导使该基因在k80 2菌中表达。 结果 :用PCR方法扩增获得大小约 1 .1kb条带 ;全自动测序与GenBank中登录的序列 97%同源。获得了pGEX5T Oct4重组子并在k80 2菌中获得了表达 ,SDS PAGE分析有一特异性的 6 2 0 0 0条带。 结论 :扩增和克隆了人胚生殖系细胞多能性调节蛋白Oct4全长cDNA并在大肠杆菌中获得表达 。

P53通过促进miR-145的表达抑制肺腺癌A549细胞的干细胞特性

目的:探讨P53抑制肺腺癌A549细胞干细胞特性及其机制。方法:收集2014年3月至2015年12月解放军第85医院胸外科手术切除的30例非小细胞肺癌(non-small cell lung carcinoma,NSCLC)患者癌组织及癌旁组织,采用Real-time PCR检测NSCLC组织和癌旁组织中miR-145的表达。构建人P53基因的真核表达载体(pcDNA3.1-P53)和突变载体[pcDNA3.1-P53R273H(CGT-CAT)],设计靶向P53基因的siRNA,分别转染A549细胞;细胞分为对照转染组(Vector或NCsiRNA)和实验组(Flag-P53或P53-siRNA);Western blotting检测P53蛋白过表达和干扰效率,Real-time PCR检测OCT4和miR-145的表达,荧光双报告基因和Western blotting技术检测证实A549细胞中干细胞多能性调节基因(OCT4)为miR-145的靶标分子。结果:NSCLC组织中miR-145的表达水平明显低于癌旁组织[(2.31±0.13)vs(3.51±0.27),P<0.01];P53明显促进A549细胞中miR-145的表达[(1.84±0.14)vs(1.00±0.00),P<0.01];miR-145 mimics显著抑制A549细胞中pGL3-OCT4-3′-UTR活性(P<0.01)和OCT4蛋白表达水平(P<0.05),而转染miR-145抑制剂可进一步增加OCT4表达水平,且逆转P53对A549细胞的干细胞特性的抑制作用。结论:P53通过促进miR-145表达下调OCT4表达,进而明显抑制A549细胞的干细胞特性,该结果为肺腺癌的临床诊断和治疗提供了新途径。

LRH-1在女性生殖和乳腺癌中的研究进展

肝受体类似物-1(liver receptor homolog-1,LRH-1;NR5A2)是转录因子家族中的新成员,表达于肝、肠、胰腺和卵巢,尤其在卵巢高表达,参与胚胎发育的调节.近年来发现LRH-1还表达于人类乳腺中未分化脂肪组织的间质层,可能参与前脂细胞功能调节或脂肪细胞分化.因此对LRH-1的研究有助于揭示LRH-1与人类生殖及疾病的关系,为疾病的早期诊断和有效治疗提供了新靶点.

爪蟾卵母细胞抽提物可诱导牛胎儿成纤维细胞发生部分重编程

应用非洲爪蟾卵母细胞抽提物处理和牛胎儿成纤维细胞(Japanese Black cattle fetal fibroblasts,JBCFF),观察处理前后细胞的形态学变化,同时用免疫荧光染色法检测组蛋白的乙酰化状态和OCT4蛋白的表达,并对其多能性标志基因的mRNA表达水平进行定量分析。结果表明,与未处理细胞相比,经抽提物处理和牛胎儿成纤维细胞组蛋白H3K9乙酰化程度与未处理组无显著差异;培养5~6d后细胞聚集形成'克隆簇'中碱性磷酸酶和Oct4蛋白染色阳性;同时也检测到Oct4和Nanog基因在其中的表达,而Sox2基因未见表达;且Oct4、Nanog基因表达量随处理后细胞培养时间的延长(4、5、6d)而呈依次上升趋势。可见,爪蟾卵母细胞抽提物能诱导和牛胎儿成纤维细胞发生部分重编程,恢复其发育全能性,这对牛诱导性干细胞制备方法的探索和体细胞克隆及转基因克隆牛效率的提高具有一定的借鉴意义。

hiPSC多能标志物的表达水平与谱系特异性分化潜能的相关性研究

目的研究人诱导型多能干细胞(hiPSC)不同多能标志物的相对表达水平与其心肌、神经分化潜能的相关性,为hiPSC作为种子细胞在心脏、神经再生医学研究中的应用提供实验指导。方法以人类胚胎干细胞(hESC)系h1ESC作为对照,通过实时定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测2株hiPSC细胞系多能性基因的表达水平;随后,分别利用心肌分化培养基与神经分化培养基对其进行诱导分化。在心肌分化中,通过比较搏动区域数量与面积以及心肌标志物的表达水平,鉴定不同hiPSC的心肌分化潜能;在神经分化中,通过比较早期花结样细胞团的数量与神经标志物的表达水平,鉴定不同hiPSC的神经分化潜能。最后,通过比对hiPSC多能标志物的表达水平高低与谱系分化潜能高低的对应关系,揭示两者的潜在相关性。结果RT-qPCR结果显示,两株hiPSC相比,hiPSC-0100细胞系中SOX2表达显著较高、NANOG显著较低,hiPSC-WTB细胞系SOX2表达显著较低、NANOG显著较高(P<0.05)。在分化潜能上,形态学与RT-qPCR检测共同显示,hiPSC-0100表现相对较低的心肌分化潜能、较高的神经分化潜能,hiPSC-WTB表现较高的心肌分化潜能、较低的神经分化潜能(P<0.05)。结论高表达SOX2、低表达NANOG的hiPSC细胞系倾向于具有较高的神经分化潜能;高表达NANOG、低表达SOX2的hiPSC细胞系倾向于具有较高的心肌分化潜能。

人脐带间充质干细胞的分离培养及多向分化潜能研究

建立人脐带间充质干细胞的分离培养方法,并鉴定其生物学特性及多向分化潜能。采集健康产妇足月剖宫产中的胎儿脐带组织,通过组织块贴壁法进行原代培养,分别采用流式细胞仪和RT-PCR方法检测细胞表面标志物和多能性相关基因的表达,通过向成脂、成骨、成软骨分化,鉴定其多向分化潜能。结果显示:脐带组织贴壁培养14 d,可见组织块周围出现大量贴壁生长的梭形样细胞,获得的细胞高表达间充质干细胞表面标志物CD44、CD105,低表达造血细胞表面标志物CD34、CD45;同时表达多能性相关基因Oct4和Nanog,经组织染色和RT-PCR鉴定,其具有向成脂、成骨和成软骨分化的潜能。人脐带间充质干细胞可在体外扩增培养,表达多能性相关基因,并具有多向分化潜能,可作为种子细胞用于组织工程。

DPPA2沉默对胃癌细胞生物学行为的影响

多能性相关基因2(developmental pluripotency-associated gene 2,DPPA2)在多能性细胞和某些癌组织中特异表达,并有望成为一些恶性肿瘤的特异性免疫治疗靶点。课题组拟研究DPPA2沉默对胃癌细胞SGC-7901生物学行为的影响,为胃癌的治疗提供实验依据。构建DPPA2沉默pGenesil-2/DPPA2重组载体并导入SGC-7901细胞,MTT实验、划痕实验、FACS等研究DPPA2沉默对肿瘤细胞生物学行为的影响,并建立小鼠肾被膜下移植侵袭模型研究肿瘤细胞的在体侵袭能力。结果显示,沉默DPPA2后,DPPA2、NANOG同源盒(NANOG homeobox,NANOG)和八聚体结合转录因子4(octamer binding transcription factor 4,OCT4)mRNA及蛋白表达量在SGC-7901细胞中显著降低(均P<0.01);SGC-7901细胞的增殖、迁移能力减弱,DPPA2沉默后肿瘤细胞停滞于G0/G1期,且能够促进SGC-7901细胞的凋亡;小鼠肾被膜下移植侵袭模型表明,DPPA2沉默可抑制肿瘤细胞对正常组织的局部浸润,减少肿瘤细胞对肾皮质的侵袭。结果显示,DPPA2沉默后胃癌细胞SGC-7901的生物学行为明显被抑制,表明DPPA2在促进胃癌发生、发展过程中发挥着重要的作用,沉默DPPA2可抑制NANOG、OCT4的表达,抑制肿瘤细胞对正常组织的局部浸润,达到影响胃癌细胞生物学行为的目的。

人脂肪干细胞诱导转化为心肌细胞的时期选择

目的:研究人心包外脂肪干细胞生物学性状,并探讨向心肌细胞诱导时期的情况。为脂肪干细胞移植治疗心肌梗死提供优良的种子细胞。方法:通过胶原酶消化法,由人心包外脂肪组织获得脂肪干细胞,通过细胞免疫学方法检测人心包外脂肪干细胞细胞表面抗原的表达,并定量分析;利用RT-PCR、real-time PCR法定量检测人心包外脂肪干细胞细胞多能性基因(Pluripotent mRNA)的表达;采用血细胞计数板计数并比较诱导获得的心肌细胞数量;免疫组织化学法检测诱导获得的心肌细胞表达心肌特异性抗α-actin、cTnT,进行表型鉴定。结果:人心包外脂肪干细胞体外培养过程中贴壁生长,通过形态学特征以及脂肪干细胞特异性相关抗原检测证实,得到高纯度人心包外脂肪干细胞。其表面标记物CD44、CD90表达阳性,并在3、4代传代细胞中荧光强度达峰值。多能性基因(Oct-4、Rex1、Nanog)的表达随细胞传代而下降。经心肌诱导培养基体外诱导培养后,分化的细胞大多呈肌细胞样,且在3、4代细胞数量达峰值。细胞免疫化学检测证实心肌特异性抗α-actin、cTnT表达阳性。结论:细胞表面荧光强度及多能性基因(Pluripotent mRNA)表达量的变化可影响脂肪干细胞向心肌细胞的诱导,脂肪干细胞处于传代早期时向心肌诱导的可能性大,因此可选择早期向心肌细胞的诱导,这可能为脂肪干细胞移植治疗心肌梗死奠定基础。

核转染技术转染大鼠胚胎干细胞的初步研究

大鼠胚胎干细胞(rat embryonic stem cells,r ESCs)的基因转染研究仍处于探索阶段。该文利用不同的核转染条件,将红色荧光蛋白(red fluorescent protein,RFP)表达载体p EF1alphaDs Red-Express2导入大鼠胚胎干细胞中,比较不同转染条件下大鼠胚胎干细胞的红荧光蛋白表达效率和死亡率,确定最佳核转染条件。在采用最佳核转染条件转染大鼠胚胎干细胞后,利用碱性磷酸酶染色、RT-PCR、免疫荧光染色等方法,比较核转染前后大鼠胚胎干细胞的干细胞特性,探讨核转染过程对大鼠胚胎干细胞的干细胞特性的影响。实验结果显示,转染条件为A-13时,可获得最好的大鼠胚胎干细胞转染效率(39.63±1.75)%。核转染后,表达红色荧光蛋白的大鼠胚胎干细胞的碱性磷酸酶染色结果仍为阳性。另外,RT-PCR和免疫荧光染色结果表明,核转染前后大鼠胚胎干细胞的干细胞多能性标志基因的表达情况未出现明显差异。研究表明,核转染条件A-13可以在不改变大鼠胚胎干细胞特性的条件下有效地对其进行基因转染,即核转染技术适用于大鼠胚胎干细胞的基因转染。