多能硫杆菌RubisCO基因鉴定以及在大肠杆菌中的表达

多能硫杆菌(Thiobacillus versutus)是兼性化能自养细菌,在生理学和分类学上具有重要的地位,也是研究硫杆菌生理、生化、遗传学的理想材料。该菌通过卡尔文循环固定CO_2,其关键酶是1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(简称RubisCO)。我们从多能硫杆菌中分离得到的RubisCO基因片段能够在大肠杆菌细胞中表达,说明自养细菌与异养细菌在基因表达方面是相似的。

多能硫杆菌RuhisCO墓因在大肠杆菌中表达产物分析

通过对多能硫杆菌RubiSCO的基因表达分析表明该基因能够在pBR322的P1启动子、pUC19的lac启动子以及pKK223-3的tac启动子的启动下，在大肠杆菌中表达，RubisCO基因片段在pUC19和pKK223-3载体上的表达活性较高。进一步对RubisCO基因表达产物进行了非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，检测到了RubisCO蛋白质带。

多能硫杆菌基因文库的构建以及Rubis CO基因的筛选

以pUC9质粒DNA作为载体，用PstⅠ酶切、碱性磷酸酯酶处理后，与PstⅠ部分酶切的多能硫杆菌染色体DNA3－10kbDNA片段连接，转化大肠杆菌JM83，在MacConkey培养基上筛选重组于，所得的重组子为6.5×103，达到建库要求的理论值。进一步用光合细菌Rhodobactersphaeroides类型Ⅱ磷酸核酮糖羧化酶／加氧酶基因（rbcL－rbcS）为探针，从该库中筛选到了含有多能硫杆菌的1，5－二磷酸核酮糖羧化酶／加氧酶（RubisCO）基因片段的重组子，从而进一步证明所构建多能硫杆菌基因文库的完整性和可靠性。

大肠杆菌粘端质粒pJRD215在兼性自养多能硫杆菌中的带动转移

通过接合将广泛寄主范围的转移性IncP质粒RP_4、R68.45、RP_1::Tn501和pUB307从大肠杆菌转移到了兼性自养多能硫杆菌中,质粒上的Ap、Tc和Km抗性基因在多能硫杆菌中均得到表达。IncQ类群的粘端质粒pJRD215在转移性IncP质粒的带动下,从大肠杆菌转移到了多能硫杆菌,转移频率为8.9×10^(-5)——801×10^(-4),并对pJRD215在多能硫杆菌中的稳定性进行了测定。本文首次将非转移性质粒载体引入到兼性自养多能硫杆菌中。

RP_4质粒在兼性自养多能硫杆菌中的接合转移

本实验以大肠杆菌(Escherichia coli)HB101(RP_4)作为供体菌,以多能硫杆菌(Thiobacillus versutus)作为受体菌,通过接合的方法将RP_4质粒转移到了多能硫杆菌中.接合频率为1.9×10^(-5),RP_4质粒的三个抗性基因(Ap^R、Tc^R、Km^R)在多能硫杆菌中均得到了表达.再将RP_4质粒从多能硫杆菌反向转移到大肠杆菌HB101菌中,接合频率为3.3×10^(-1)～7.3×10^(-1),三个抗性基因也均得到了表达.实验证明,多能硫杆菌对于RP_4质粒既是一个受体菌,也是一个很好的供体菌.

多能硫杆菌1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶基因的启动子克隆和表达

将３．４ｋｂ的多能硫杆菌１，５－二磷酸核酮糖羧化酶／加氧酶基因（ｒｂｃＬ－ｒｂｃＳ）片段亚克隆到启动子探测质粒载体ｐＫＬ６的ＨｉｎｄⅢ位点，该基因片段能够启动ｐＫＬ６的ｌａｃ基因的表达，说明３．４ｋｂ的ｒｂｃＬ－ｒｂｃＳ基因带有自己的启动子．

多能硫杆菌RubisCO基因的亚克隆及各种启动子对其表达的影响

将多能硫杆菌（Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｕｓｖｅｒｓｕｔｕｓ）ＲｕｂｉｓＣＯ基因从两个方向亚克隆到ｐＢＲ３２２和ｐＫＫ２２３－３载体上，通过酶切的方法对各种质粒的插入方向进行了确证．并进一步对这两种插入方向的质粒在大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）中的表达情况进行了酶活性的测定，该基因片段在ｐＫＫ２２３－３载体的ｔａｃ启动子的启动下，表达活性比ｌａｃ启动子以及ｐＢＲ３２２载体上的Ｐ１和Ｐ２启动子高．

多能硫杆菌RubisCO基因（rbcL－rbcS）的克隆及限制性内切酶图谱分析

以光合细菌圆球状红杆菌Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒｓｐｈａｅｒｏｉｏｄｅｓ的ｒｂｃＬ－ｒｂｃＳ基因为探针，与多能硫杆菌（Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓｖｅｒｓｕｔｕｓ）染色体ＤＮＡ酶切谱带进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交，检测到了ｒｂｃＬ－ｒｂｃＳ基因的同源序列，又以ｐＵＣ９为载体，克隆了Ｔ．ｖｅｒｓｕｔｕｓ染色体ＤＮＡＰｓｔＩ酶切片段，构建成Ｔ．ｖｅｒｓｕｔｕｓ基因文库，并从这个基因文库中筛选到了含有ＲｕｂｉｓＣＯ基因的重组质粒，将其命名为ｐＳＤＬＳ－１０，进一步对ｐＳＤＬＳ－１０进行了限制性酶切分析。