多色标记免疫组织化学染色和免疫荧光染色在肺癌免疫治疗中的研究进展

肺癌是目前临床上最常见的恶性肿瘤,严重威胁着患者的生命健康及生活质量。程序性细胞死亡受体1(programmed cell death receptor 1, PD-1)及其配体(programmed cell death ligand 1, PD-L1)抑制剂为非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)患者提供了新的治疗策略。现有的生物标志物检测对准确选择免疫治疗受益的患者均有一定的价值,但都存在着局限性。多标记免疫组织化学/免疫荧光(multiplex immunohistochemistry/immunofluorescence,mIHC/IF)技术允许在单一组织切片上同时检测多个抗体,并对细胞组成、细胞功能和细胞-细胞相互作用进行全面研究。国内外已有大量研究使用mIHC/IF技术对肿瘤免疫微环境(tumor immune microenvironment, TIME)下特异性免疫细胞群进行了探索,发现其有助于肺癌患者临床预后判断及疗效预测。肺癌免疫治疗时代,这项技术在转化研究和临床实践中均具有良好的应用前景。本文就mIHC/IF检测方法在肺癌免疫治疗中的研究进展进行了总结和展望。

多标记免疫荧光染色及多光谱成像技术在组织学研究中的应用

免疫组织化学染色及成像分析是研究组织形态和组织原位抗原表达不可或缺的检测技术,广泛应用于临床病理诊断和医学及生物学研究的各个领域。组织切片样本中蕴含着丰富的信息,但是受制于传统单标记免疫组织化学染色方法的限制,通常只能对组织中的一到两种抗原进行染色分析,而且定量结果的判读往往依赖于肉眼观测,缺乏客观标准。随着蛋白组学的发展,对现代组织学分析提出了更高的要求,例如不同的蛋白共表达和共定位分析、低丰度分子的检测、异质性分析、细胞表型统计乃至复杂组织微环境的描绘等,都需要在同一张组织切片样本上同时检测多种靶标分子。这对于理解组织微环境中各种细胞间的关系,推演信号通路上下游蛋白表达的关系,制定临床诊断和治疗方案都有着非常重要的意义。本文介绍一种基于酪胺信号放大(TSA)技术衍生而来的多标记免疫荧光染色方法,能够在同一组织切片样本上复染7种以上抗原并进行区别标记,配合光谱成像技术和定量分析软件,能够将组织中蕴含的丰富信息准确的呈现出来。这套流程化的分析方案为临床诊断和基础科研提供了更高精度和更可靠的组织学数据,将免疫组织化学分析的技术水平提升到一个新的高度。

CRISPR系统在染色体标记方面的应用

在细胞分化和发育过程中, 细胞核的结构也在不断的改变. 哺乳动物基因组在细胞核内的装配不是随机的,且被认为与基因的调控有关, 而且细胞核装配缺陷还会造成一些人类疾病的产生.但是基因定位与基因表达简单因果关系至今尚不明确, 主要因为基因位置动态变化的分析依旧受限. 随着 CRISPR 系统的出现, 其在标记方面的应用价值逐渐显露出来.在 CRISPR 系统中, 将 Cas9 蛋白替换为不具有切割能力的 dCas9 蛋白, 将荧光蛋白与 dCas9 结合或与 sgRNA 的支架结构相结合, CRISPR 系统便可用于染色体的标记.

多色引物原位标记技术快速检测精子染色体

目的:探索和评估应用于精子染色体数目异常检测的多色引物原位标记技术。方法:采用NaOH溶液对精子核进行去浓缩和变性,以非ddNTP阻断的单色及三色引物原位标记技术对正常男性精液标本的4条染色体进行检测。结果:成功地在2.5h内标记了同一精子核内的多条染色体,最佳的染色体同时标记通量为3条,单色以上标记达到99%。结论:该快速多色引物原位标记技术优化了之前的单色精子标记技术,在提高了检测通量的同时,检测也更为简便快速和经济可靠。

小鼠免疫细胞流式染色过程中细胞丢失量的影响因素

目的观察和探讨小鼠免疫细胞多色流式染色过程中细胞丢失的影响因素。方法取C57BL/6J鼠制备脾细胞悬液,分别用不同种类、不同成分和不同pH值缓冲液洗涤和重悬细胞2次,并计数活细胞数量,观察对染色过程中的细胞丢失量有明显影响的因素。结果在小鼠免疫细胞的流式染色标记过程中,缓冲液种类对细胞丢失量有显著影响,含有钾离子的PBS缓冲液洗涤后会造成明显的细胞丢失;离心机转速过高或过低均会导致显著的细胞丢失;而缓冲液pH值的微量偏移和是否加入FBS/BSA对细胞的丢失影响不明显。结论小鼠免疫细胞的流式染色过程中使用含有钾离子的PBS缓冲液会造成明显的细胞丢失,应推荐使用不含钾离子的PBS缓冲液,同时保持离心转速适中。

分子与细胞事件的光学可视化——解读2008年诺贝尔化学奖

绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)及其突变体作为报告基因,已被广泛应用于基因表达调控、蛋白质空间定位、生物分子之间相互作用、转基因动物以及药物药效评价和作用机理研究等方面,极大地推动了现代生物学的发展.随着光电信息技术的不断进步,基于荧光报告基因的光学分子成像技术将在细胞、细胞网络、组织、器官和个体等不同层次实现分子与细胞事件的实时可视化,从而在重大疾病的早期诊断和药物研发中发挥重要作用.

236例SARS患者外周血中幼稚和记忆CD_4T细胞亚群变化

目的 :研究严重急性呼吸综合征 (SARS)患者外周血T淋巴细胞及CD4细胞中幼稚亚群 (Tn)和记忆亚群 (Tm)的异常变化 ,以期更好地了解SARS患者细胞免疫功能 ,从而建立新的实验室指标。方法 :采用多色荧光标记流式细胞术结合血液分析仪检测 2 3 6例不同病程的SARS患者 (包括 5 0例重型患者和 1 86例普通型患者)的外周血T淋巴细胞及CD45RA和CD45RO分子在CD4细胞中的表达情况。结果 :与正常对照组比较 ,SARS患者的外周血T淋巴细胞及CD4细胞中Tn和Tm绝对值明显减低 ,其百分比无明显改变 ,重型尤其明显。其中 ,重型组CD4细胞中的Tm百分比高于普通型 ;各病程SARS患者比较 ,三个病程组的T淋巴细胞计数均明显低于正常对照组 ,以Ⅰ组为最低 ,CD4、CD8亚群的绝对值均低于正常对照组 ;在CD4细胞中 ,各病程Tn和Tm的百分比无明显差异 ,绝对值以Ⅱ组最高 ,但均低于正常对照组。结论 :伴随着全面低下的细胞免疫功能 ,SARS患者的CD4+ T细胞的Tn和Tm均明显减少 ,重型尤其明显 ,但是在病程中可有轻度回升。相对于百分比而言 ,CD4细胞中Tn和Tm表面标志分子 (分别为CD45RA和CD45RO分子 )表达绝对值对于明确机体细胞免疫功能的意义更为重要。

应用多色引物原位标记技术在未培养羊水细胞中同时识别18号、X和Y染色体

目的建立多色引物原位标记（multi-primed in situ labelling）技术在未培养羊水细胞中检测染色体数目异常。方法用非双膜氧核苷酸阻断的三色引物原位标记技术对未培养羊水细胞中的18、x和Y染色体同时进行标记。结果成功地在69份未培养羊水细胞间期核中检测到相应的染色体信号，且结果与培养羊水细胞的染色体制备分析及其三色引物原位标记相符合，反应成功率达96％，标记率达85％。结论该研究方法提高了检测通量，快速、简便、经济可行，值得进一步研究与推广。