PEDV与TGEV双重荧光RT-LAMP检测方法的建立与评价

为建立可快速鉴别检测猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)和猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus,TGEV)的双重荧光RT-环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)方法,从GenBank下载PEDV和TGEV不同毒株M基因序列进行比对后,针对高度保守区设计合成内、外引物对和探针,在PEDV探针5′端标记FAM基团,3′端标记BHQ1基团,在TGEV探针5′端标记CY5.5基团,3′端标记BHQ2基团,对反应条件和体系优化后建立了一种快速鉴别PEDV和TGEV的双重荧光RT-LAMP检测方法。采用建立的方法在63℃水浴锅中反应60 min,然后再85℃作用10 min结束反应,将反应管置于多色荧光成像仪,在520、690 nm双通道下即可观察结果。用该方法检测其他猪常见病毒性病原均无交叉反应;以10倍稀释的重组质粒为模板评价该方法的灵敏度,结果最低检测限为10^(2)拷贝/μL重组质粒,是常规RT-PCR方法敏感度的10倍。从175份有腹泻症状仔猪的肛拭子样品中采用建立的方法共检出PEDV阳性样品72份,TGEV阳性样品49份,PEDV和TGEV混合感染样品40份,均比采用常规RT-PCR方法的检出率高。本研究建立的双重荧光RT-LAMP方法采用普通水浴锅即可进行扩增反应,而无需对反应产物进行凝胶电泳,为快速方便的进行PED与TGE的鉴别诊断和PEDV与TGEV混合感染的同步检测提供了技术支撑。