荧光定量PCR探针熔解曲线法在结核分枝杆菌耐药基因检测中的应用研究

探讨在结核分枝杆菌耐药基因检测中,对其予以荧光定量PCR探针熔解曲线法,观察分析应用价值。方法 本研究的时长段在2022年6月到2023年6月,统共1000例结核患者接受治疗,所有病患都拓展了抗结核药物的测验,且每一位患者的标本均予以荧光定量PCR探针熔解曲线法检测,药物敏感性测定结果为黄金基准,考察判辨荧光定量PCR探针熔解曲线法对利福平医药品、异烟肼医药品、乙胺丁醇医药品、链霉素医药品的诊断效能。结果 针对1000例的标本中,经过液体药敏试验检测显示对利福平药物耐药例数250例,役使溶解曲线观察耐药性包含了240例患者;对异烟肼医药有耐药性的液体药敏试验500例,应用溶解曲线检测耐药性包含了470例;经过液体药敏试验检测显示对乙胺丁醇药物耐药例数170例,予以熔解曲线法显示耐药140例。经过液体药敏试验检测显示对乙胺丁醇药物耐药例数300例,役使溶解曲线观察耐药性包含了240例患者。熔解曲线法对利福平医药品、异烟肼医药品、乙胺丁醇医药品、链霉素医药品的灵敏度分别为84.00%、84.00%、47.06%、66.67%;特异度分别为96.00%、90.00%、84.34%、94.29%;准确度分别为93.00%、97.00%、91.00%、86.00%。结论 在结核分枝杆菌耐药基因检测中,对其予以荧光定量PCR探针熔解曲线法,可得到较高的应用价值,灵敏度、特异度、准确度较高,可筛查结核病患者对利福平、异烟肼、乙胺丁醇等药物的耐药性,为临床治疗疾病提供可靠的依据。

RT-fqPCR检测腐乳耐药基因方法的建立及应用

该研究根据腐乳中微生物全基因组测序结果中耐药基因的丰度筛选出3种耐药基因(Baca、Emra、Imrp)设计引物,建立一种非培养方式—实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-fqPCR)方法检测不同腐乳样品中微生物可能存在的耐药基因,并对该方法的灵敏度、抗干扰能力及重复性进行检测,最后应用于市售腐乳样品中耐药基因的检测。结果表明,建立的RT-fqPCR方法对3种耐药基因检测的灵敏度较高,均达到5.4 pg;添加黄豆基因对检测结果影响不显著,抗干扰能力较好;重复性试验结果的相对标准偏差(RSD)均<1.8%,重复性较好。采用该方法对市售的47批次腐乳样品进行检测发现,3种耐药基因Baca、Emra、Imrp在腐乳中的检出率较高,分别为96.5%、92.2%和97.2%;青方腐乳、白方腐乳、红方腐乳3类腐乳含有的耐药基因分别为84.4%、83.3%和89.6%。综上,建立的RT-fqPCR方法可快速检测不同腐乳中的3种耐药基因。

大肠杆菌耐药基因TD-PCR检测方法的建立及应用

为建立一种检测大肠杆菌主要耐药基因(ARG)的通用降落PCR(TD-PCR)方法,本研究参考大肠杆菌标准菌株K12 MG1655 yeeJ基因序列设计合成不同Tm值引物、不同产物长度引物、不同长度引物,并参考Gen Bank中登录的β-内酰胺酶、氨基糖苷类、酰胺醇类、喹诺酮类和黏菌素类部分ARG序列设计合成共29对引物。以大肠杆菌标准菌株K12 MG1655总DNA为模板,采用TD-PCR和普通PCR方法,分别利用不同Tm值引物(P1~P8)、不同产物长度引物(P9~P16)、不同长度的引物(P17~P22)分别扩增yeeJ基因,均用于检测TD-PCR方法的特异性;利用引物P5扩增yeeJ基因,根据目的条带平均亮度值,对TD-PCR方法的扩增产物量分析。不同Tm值引物的扩增结果显示,TD-PCR方法中利用8对不同Tm值引物扩增后均出现目的条带,且均无非特异性条带,而普通PCR方法仅有部分引物扩增后出现目的条带,表明以不同Tm值引物扩增时,TD-PCR方法特异性更强,且适用引物Tm值范围较广。不同产物长度扩增结果显示,TD-PCR方法中利用8对引物扩增后均出现相应目的条带,且无非特异条带,而普通PCR方法虽然均出现目的条带,但部分引物扩增后还出现了非特异性条带,表明以不同产物长度引物扩增时,TD-PCR方法的特异性更强。不同长度的引物扩增结果显示,TD-PCR方法中利用6对不同长度的引物扩增后均出现目的条带,且无非特异条带,而普通PCR方法在52℃退火温度时引物P22出现非特异性扩增,表明TD-PCR方特异性更强。扩增产物量分析结果显示,TD-PCR和普通PCR方法扩增的目的条带平均亮度值均随反应总循环数的增加而上升,但普通PCR方法扩增的产物目的条带平均亮度值始终高于TD-PCR,表明TD-PCR方法的扩增产物量低于普通PCR。以24株临床分离的鹅源大肠杆菌总DNA为模板,采用TD-PCR和普通PCR方法,分别对β-内酰胺酶、氨基糖苷类、酰胺醇类、喹诺酮类和黏菌素类共29种ARG进行检测。结果显示,TD-PCR方法对其中25种ARG的检测结果与普通PCR相同,二者符率为100%;而对另外4种ARG检测结果显示,与普通PCR相比,TD-PCR方法的非特异条带明显减少,且无假阳性。表明TD-PCR在检测ARG方面比普通PCR具有更强的特异性。本研究建立了一种特异性较强的检测大肠杆菌主要ARG的TD-PCR通用方法,为细菌耐药性的研究提供了便捷高效的检测技术手段。

2019—2021年皖南地区地方品种鸡源沙门菌的血清型鉴定、毒力基因和耐药性检测

为了分析皖南地区地方品种鸡(淮南麻黄鸡、淮北麻鸡、霍邱鸡和五华鸡)来源沙门菌的分布、毒力基因和耐药性情况,本试验于2019—2021年采集该地区地方品种鸡养殖场疑似沙门菌感染病死鸡的肝脏组织、肛拭子和死胚等病料组织456份,采用细菌分离培养、形态学观察、生化试验和特异性invA基因的PCR检测进行沙门菌鉴定,采用Kauffmann-White法、PCR法和K-B纸片法分别检测分离菌株的血清型、毒力基因、耐药基因和耐药性。结果显示,共分离得到127株沙门菌,分属于13种血清型,其中以鸡白痢沙门菌、禽伤寒沙门菌和肠炎沙门菌为流行的优势血清型,分别占分离菌株的26.0%、20.5%和17.3%;127株沙门菌中携带的4种毒力基因(spvA、spvB、spvC和spvR)检出率介于7.1%~74.8%,携带的4种毒力岛基因(SPI-1 SPI-2、SPI-3和SPI-5)检出率介于38.6%~81.1%;127株沙门菌对阿莫西林、氨苄西林和磺胺二甲氧嘧啶等8种药物的耐药率介于56.7%~99.2%,以耐10(12.6%)、9(15.0%)和8(20.5%)种药物为主,耐药基因sul 1、sul 2、sul 3、tet(A)、tet(M)和tet(R)检出率介于32.3%~89.8%;经分析,地方品种鸡流行优势血清型与毒力基因和耐药基因均有一定的相关性。结果表明,从安徽省皖南地区4种地方品种鸡中分离的沙门菌具有多种血清型、携带多种毒力基因、耐药性严重,且携带多种耐药基因。

施用猪粪水对青脆李果实品质和产量、土壤中微生物群落与抗生素耐药基因的影响

【目的】为了解猪粪浇灌对青脆李果实品质和产量、土壤性质、土壤中微生物群落与抗生素耐药基因的影响。【方法】以5年生青脆李作试材,设置猪粪水按不同比例(100%、75%、50%、25%、0%)替代化肥田间试验,通过单果重、单果横径等外观指标,李子每667 m^(2)产量,维生素C、可溶性固形物等果实品质指标测定,分析不同施肥处理对青脆李果实品质和产量的影响;基于土壤中pH、有机质含量等理化指标测定,分析不同施肥处理对李树土壤理化性质的影响;基于Illumina Hiseq 4000测序平台对李树土壤宏基因组测序,分析猪粪水浇灌对土壤中微生物群落变化、抗生素耐药基因分布的影响。【结果】不同施肥处理青脆李果实品质和产量研究结果表明,“75%猪粪+25%化肥”“50%猪粪+50%化肥”处理青脆李果实外观品质均较优,“50%猪粪+50%化肥”处理青脆李每667 m^(2)产量最高。不同施肥处理对李树土壤理化性质的研究结果显示,各处理间有机质、碱解氮等理化指标均不存在显著性差异(P>0.05)。宏基因组测序分析结果显示,“100%猪粪”组中的优势菌群为放线菌,而其余4组的优势菌群均为假单胞菌门;共鉴定39个抗生素本体(ARO),随着猪粪水用量的减少,土壤样品中检出ARO种类、ARO相对丰度和均呈依次递减趋势。【结论】本研究条件下,猪粪水部分替代化肥为青脆李树施肥是可行的,且以“50%猪粪+50%化肥”进行施肥最佳。

甘肃省食源性单核细胞增生李斯特菌耐药性和基因组特征研究

目的分析甘肃省市售食品中分离的25株单核细胞增生李斯特菌耐药性和基因组特征,为单核细胞增生李斯特菌引起的食源性疾病的防控提供依据。方法以2021—2022年甘肃省市售食品中分离的25株单核细胞增生李斯特菌为研究对象,采用肉汤微量稀释法检测菌株对8种抗菌药物的敏感性,并对菌株进行血清分型和全基因组测序,分析其系统发育谱系、CC型、ST型、血清型、耐药表型及基因、毒力基因、抗性基因、系统发生关系。结果25株单核细胞增生李斯特菌分属谱系Ⅰ、谱系Ⅱ,以谱系Ⅱ为主,共21株(84.0%)。血清型以1/2a为主,共14株(56.0%),分属10个CC型,其中CC9、CC8和CC121为优势CC型,共占56.0%(14株),发现一个新的ST型,即ST3142。仅1株单核细胞增生李斯特菌耐药(4.0%,1/25),为复方磺胺甲恶唑、红霉素、四环素和环丙沙星多重耐药株,本研究菌株耐药表型与耐药基因的携带情况基本一致。25株单核细胞增生李斯特菌均携带LIPI-1和内化素基因,未发现携带LIPI-3的菌株,仅2株ST87型菌株携带LIPI-4。16株菌(64.0%)携带SSI-1,5株ST121携带SSI-2。68.0%(17/25)的菌株inlA基因发生了提前终止(PMSC)。核心基因组多位点序列分型分析能将不同谱系、血清群和CC型的菌株明显分开,25株菌共分为10个亚群,与CC型保持一致。结论甘肃省市售食品中25株单核细胞增生李斯特菌呈现遗传进化多样性,耐药基因及表型均表现出低耐药率,且携带的毒力基因丰富。

河南省胞内分枝杆菌临床分离株耐药特征及基因分型

目的:分析河南省胞内分枝杆菌临床分离株的耐药及基因分型。方法:收集68株2019年河南省部分地市结核病专科医院痰标本分离的胞内分枝杆菌,采用微孔板法测定其对16种药物的敏感性,用16位点VNTR方法进行基因分型,并用BioNumerics软件对分型数据进行聚类分析。结果:68株对克拉霉素、利福布汀和甲氧苄啶/磺胺甲恶唑的耐药率分别为11.76%(8/68)、5.88%(4/68)、8.82%(6/68)。克拉霉素、利福布汀和甲氧苄啶/磺胺甲恶唑的抑制50%胞内分枝杆菌的最低抑菌浓度(MIC 50)和MIC 90分别为2和32 mg/L、0.5和2 mg/L以及0.25/4.75和2/38 mg/L。16位点VNTR将68株分为45个基因型,包括来自11个簇的34株和34个独特模式的分离株,Hunter-Gaston分辨力指数为0.978。成簇菌株利奈唑胺和阿米卡星耐药率高于非成簇菌株(58.82%vs 23.53%;44.12%vs 14.71%)(P<0.05)。结论:克拉霉素、利福布汀和甲氧苄啶/磺胺甲恶唑等对河南省胞内分枝杆菌临床分离株具有较好的抗菌活性。VNTR分型方法对胞内分枝杆菌具有较好的分型能力。成簇菌株中利奈唑胺和阿米卡星的耐药率高于非成簇菌株。

miR-152-3p表达下调降低紫杉醇耐药人卵巢癌细胞A2780T对紫杉醇的耐药性

目的探讨miR-152-3p对紫杉醇耐药人卵巢癌细胞A2780T对紫杉醇耐药性的影响及机制。方法①紫杉醇(1.875,3.75,7.5,17和23μmol·L^(-1))与人卵巢癌A2780和A2780T细胞作用48 h,MTT法检测细胞存活率,计算抑制细胞存活半数抑制浓度(IC50)值和耐药指数(RI)。Western印迹法检测A2780和A2780T细胞耐药蛋白P-糖蛋白(P-gp)、多药耐药相关蛋白1(MRP1)和三磷酸腺苷结合转运蛋白G超家族成员2(ABCG2)蛋白表达。②实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测A2780和A2780T细胞miR-152-3p表达水平。脂质体瞬时转染技术转染miR-152-3p抑制物降低A2780T细胞中miR-152-3p表达(miR-152-3p抑制物组),同时设转染miR-152-3p阴性对照组,RT-qPCR检测转染效率,MTT法、划痕实验和流式细胞术分别检测转染miR-152-3p抑制物对A2780T细胞存活、迁移和凋亡的影响;Western印迹法检测转染miR-152-3p抑制物对A2780T细胞Bax和Bcl-2蛋白表达的影响。③用miRDB,Targetscan,miRWalk和Starbase数据库预测miR-152-3p的靶基因,并用Western印迹法检测转染miR-152-3p抑制物后A2780T细胞磷酸酯酶张力蛋白同源物(PTEN)蛋白表达的变化及RT-qPCR检测A2780和A2780T细胞PTEN mRNA表达水平予以验证。随后,脂质体瞬时转染技术转染PTEN siRNA沉默A2780T细胞中PTEN表达,同时设转染siRNA阴性对照组,RT-qPCR检测转染效率,MTT法检测沉默PTEN表达后A2780T细胞存活率和IC50值,Western印迹法检测P-gp,MRP1和ABCG2蛋白表达。结果①紫杉醇处理后A2780和A2780T细胞存活率均降低(P<0.01),A2780T细胞RI为2.8。与A2780细胞相比,A2780T细胞P-gp,MRP1和ABCG2蛋白高表达(P<0.05,P<0.01)。②与A2780细胞相比,A2780T细胞miR-152-3p明显高表达(P<0.01)。与转染miR-152-3p阴性对照组比较,转染miR-152-3p抑制物后A2780T细胞存活率(P<0.05,P<0.01)和细胞迁移能力(P<0.05)明显降低,细胞凋亡率升高(P<0.01);Bax蛋白表达增加(P<0.01),Bcl-2蛋白表达降低(P<0.05)。③生物信息学数据库分析结果提示,PTEN是miR-152-3p的一个靶基因;Western印迹法验证显示,转染miR-152-3p抑制物组A2780T细胞PTEN蛋白表达低于转染miR-152-3p阴性对照组(P<0.05);RT-qPCR结果显示,A2780T细胞PTEN mRNA表达水平高于A2780细胞(P<0.01)。转染PTEN siRNA沉默PTEN表达后,与转染siRNA阴性对照组相比,A2780T细胞存活率(P<0.05,P<0.01)和IC50值(P<0.01)显著降低,P-gp,MRP1和ABCG2蛋白表达降低(P<0.05,P<0.01)。结论miR-152-3p在A2780T细胞中高表达,其表达下调可抑制A2780T细胞增殖和迁移,促进细胞凋亡,降低A2780T细胞对紫杉醇的耐药性,该作用可能是通过降低其靶基因PTEN表达发挥的。

多重耐药弗劳地枸橼酸杆菌的基因组及耐药机制分析

目的对多重耐药弗劳地枸橼酸杆菌进行全基因组分析,为研究其耐药机制提供依据。方法采用含美罗培南的MH培养基对粪便标本进行初筛,经BD Phoenix100全自动微生物鉴定仪进行菌种鉴定及药敏试验,提取耐药菌总DNA进行二代测序和细菌多位点序列分型(MLST),经质粒全基因组序列分析检测质粒的组分和功能,并与参考质粒进行比较,通过质粒接合转移实验分析耐药质粒传递情况。结果413份粪便标本中分离出1株多重耐药弗劳地枸橼酸杆菌,该菌株对头孢菌素类、碳青霉烯类抗菌药物、复方磺胺甲噁唑的耐药率均为100%,对氨曲南、环丙沙星、左氧氟沙星、庆大霉素等抗菌药物呈现不同程度耐药;MLST分型的耐药弗劳地枸橼酸杆菌为ST22型,该菌株共含有5412个基因,含耐药基因367个,包括碳青霉烯酶类耐药基因、AmpC酶基因、大环内酯类耐药基因、氨基糖苷类耐药基、喹诺酮类耐药基因等。质粒的全基因组分析结果显示,该质粒含碳青霉烯类耐药基因blaNDM-1、blaSHV12,该质粒与泄殖腔肠杆菌菌株ECN49质粒和肺炎克雷伯菌菌株质粒pA575-NDM有极高的同源性;质粒接合实验显示,blaNDM-1和blaSHV-12可以通过质粒转移。结论弗劳地枸橼酸杆菌耐药的主要原因之一是含有blaNDM-1、blaSHV-12等耐药基因,并且该耐药性能通过质粒进行水平转移。

广州地区利奈唑胺耐药结核分枝杆菌耐药基因特征分析

目的分析广州地区利奈唑胺(linezolid,LZD)耐药结核分枝杆菌临床分离株耐药基因的突变特征,为控制广州地区耐利奈唑胺结核病提供一定的研究基础和依据。方法选取2012年1月~2022年1月广州市胸科医院住院患者的60株利奈唑胺耐药结核分枝杆菌的临床分离株,分为耐多药组和广泛耐药组。采用微孔板稀释法对60株菌株进行利奈唑胺最低抑菌浓度(MIC)检测,并对60株菌株的利奈唑胺耐药基因23S rRNA、rplC、rplD进行测序,分析其突变特征。结果60株LZD耐药株对LZD的MIC值分布于2~32μg/ml之间。耐多药组的MIC50和MIC90分别为2μg/ml、32μg/ml,广泛耐药组的MIC50和MIC90分别为8μg/ml、32μg/ml。60株菌株中发现有12株23S rRNA基因发生突变,其中有1株发生两个基因位点突变;有11株rplC基因发生突变,其中有1株发生双位点突变;发现2株rplD基因发生突变。23S rRNA、rplC基因突变发生率在不同性别和年龄患者中差异无统计学意义(P>0.05)。结论广州地区利奈唑胺耐药结核分枝杆菌耐药基因23S rRNA、rplC突变发生率明显高于rplD,在不同性别和不同年龄患者中的发生率无显著差异。

评价和分析云南昭通地区肺结核患者中MTB基因多样性及耐药分子特征对临床疗效的影响

目的:探讨和分析云南昭通地区肺结核患者中结核分枝杆菌(MTB)基因多样性及耐药分子特征对临床疗效的影响。方法:将2022年1月—2023年3月云南昭通地区300例初治的肺结核患者作为研究对象,以传统固体比例法对利福平、异烟肼、乙胺丁醇、链霉素、卡那霉素、氧氟沙星、卷曲霉素等临床常用抗结核药物进行药敏试验,分析所选研究对象MTB基因分型及不同MTB基因型与耐药性关系。结果:MTB分离株基因型以北京家族占比最高,构成比达52.33%,属于主要流行基因型。不同基因家族MTB菌株对乙胺丁醇、链霉素、卡那霉素及卷曲霉素的耐药性差异无统计学意义(P>0.05);不同基因家族MTB菌株对利福平、异烟肼、氧氟沙星的耐药性差异有统计学意义(P<0.05)。结论:云南昭通地区肺结核患者MTB基因存在多样性且以北京基因型为主,不同MTB基因型对抗结核药物耐药性存在较大的差异,可影响抗结核药物治疗效果,临床可根据MTB基因分型以及药敏试验结果合理选择抗结核药物。

江西省猪链球菌的分离鉴定及耐药基因、毒力基因检测分析

为了解猪链球菌临床分离株的生物学特性、耐药基因与毒力基因的携带情况。采集疑似链球菌感染病死的猪肺脏和关节液,用常规方法分离细菌,通过镜检、16S rRNA序列测定分析、分子分型、动物实验鉴定分离菌的生物学特性,用药敏试验进行药物敏感度测定,并利用PCR检测耐药基因及毒力基因。结果可知,从8个养猪场的10份肺脏和关节液中共分离到10株菌,经16S rRNA序列比对和血清分型,10株分离株均为猪链球菌,其中9型7株,1型1株,其余2株为猪豕链球菌和猪生殖道链球菌;小鼠致病性试验结果显示,分离株JXNC1906、JXJJ1904和JXNC1904的毒力较强;毒力基因检测显示,JXNC2103可检出6种毒力基因,JXNC2011株只检出mrp毒力基因,毒力型mrp^(+)ef^(-)gdh^(+)sly^(+)mmum^(+)Orf2^(+)2株、mrp^(-)ef^(+)gdh^(+)sly^(-)mmum^(+)Orf2^(-)4株、mrpef^(-)gdh^(+)sly^(-)mmum^(+)Orf2^(+)1株、mrp^(+)ef^(+)gdh^(+)sly^(-)mmum^(+)Orf2^(+)1株;药敏试验结果,10株分离菌的耐药性均不强,对大观霉素、恩诺沙星、丁胺卡纳、氨苄西林和头孢曲松均在中度以上敏感;耐药基因检测结果,10株链球菌分离株均能检测出氟喹诺酮类耐药基因,除JXNC1906外,其他9株还能检测出四环素类、大环内酯类以及磺胺类耐药基因,分离菌JXNC1906检测出β-内酰胺类blaTEM和氨基糖苷类Aph3’耐药基因,其他分离菌株可检测出vanA、vanD、strA、strB、floR以及多重耐药基因optrA和Lsa(E)等。结果表明,从临床病死猪中分离的链球菌致病性高低不一,对临床常见药物仍较为敏感,不同分离株的耐药基因表型和毒力基因表型相差较大。本实验结果为进一步研究猪链球菌的致病机理和临床有效防控措施提供基础。

1株ST515型多重耐药单增李斯特菌全基因组测序分析

【目的】了解1株分离自调理肉制品的单增李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)携带耐药基因、毒力基因、可移动元件情况以及遗传进化关系。【方法】以1株从新疆某地的调理肉制品中分离获得的LM菌株LM5567为研究对象,通过VITEK-2 Compact和AST-GP67药敏卡检测LM5567菌株耐药性;经全基因组测序后,对LM5567菌株进行功能注释、分子分型、遗传进化关系和耐药基因、毒力基因及可移动元件携带情况分析。【结果】LM5567菌株对苄青霉素、氨苄西林、苯唑西林、呋喃妥因、复方新诺明、四环素等抗菌药均有耐药性,其基因组全长为2.974 Mb,包含2 941个编码基因。通过GO注释共获得2 144个基因,包含了50种功能特性。多位点序列分型(MLST)分析结果显示,LM5567菌株为ST515型,与分离自不同国家的复合克隆系(clonal complex, CC)CC1菌株具有较近亲缘关系。单核苷酸多态性(SNP)分析表明,LM5567菌株与来自加拿大的菌株02_17924b、02_1103和1株来自波兰的菌株220的突变位点最少,该菌株携带88个毒力基因和6个耐药基因,存在1个转座子Tn6009并携带四环素耐药基因tetM。【结论】食源性LM5567菌株为ST515型多重耐药菌株,基因组携带多种耐药基因、毒力基因和1个转座子,具有发生耐药性转移的潜力,存在通过食物链传播引起人类李斯特菌病的潜在风险。

江苏省2016—2021年临床分离铜绿假单胞菌耐药及基因组特征分析

目的了解江苏地区临床分离的铜绿假单胞菌耐药情况及基因特征。方法收集2016—2021年江苏地区各哨点医院临床分离的铜绿假单胞菌,采用肉汤稀释法对分离株进行10类19种抗菌药物的敏感性测定,对分离株行全基因组测序并多位点序列分型,综合抗菌药物耐药性数据库(CARD)扫描分析耐药基因。结果2016—2021年通过致病菌识别网12个市的哨点医院收集患者分离的铜绿假单胞菌101株。药敏试验结果显示,全部菌株对共计6类8种抗菌药物全部耐药,包括酰胺醇类抗生素氯霉素、磺胺类的复方磺胺甲口恶唑、头孢菌素类的头孢噻肟和头孢唑林、四环素类的四环素、青霉素类的氨苄西林及氨苄西林/舒巴坦以及β-内酰胺类的阿莫西林/克拉维酸;45.54%的分离株为碳青霉烯类耐药菌株,对亚胺培南、美罗培南两种碳青霉烯类抗生素的耐药率已分别达45.54%、39.60%;耐10种以上抗生素的菌株达63.36%;共发现35种耐药表型,其中1株菌对19种抗菌药物广泛耐药,耐药谱为AMC-AM-SAM-CZ-CTX-C-TE-SXT的菌株最多(31.69%,32株)。多位点序列分析发现75个ST型,聚类发现ST 262处于中心点,并遗传进化出11个亚型或分支。全基因组扫描发现6类18种抗菌药物耐药基因,crp P基因的携带情况与表型完全一致。结论2016—2021年江苏地区临床分离的铜绿假单胞菌耐药情况严重,两种碳青霉烯类抗生素的耐药率、耐10种以上抗生素的菌株比例高于国内其他省份,应引起高度重视。

广州市环境污水中沙门菌耐药性及携带耐药基因分析

目的 探讨广州市环境污水中沙门菌的耐药性及耐药基因携带情况。方法 收集广州市2022年3月1日至2022年11月30日环境污水中分离培养的140株沙门菌作为研究对象,开展药物敏感性检测及全基因组测序,通过CARD耐药数据库分析全基因组测序结果,获取相应的耐药基因。结果 试验菌株对氨苄西林、四环素、链霉素、氯霉素、复方新诺明的耐药率较高,均达80%以上。多粘菌素E、环丙沙星的中介率较高,达60%以上。多重耐药现象严重,多重耐药率高达92.86%。菌株携带多种类型的耐药基因,特别是氨基糖苷类,携带率高达92.68%。结论 广州市环境污水中沙门菌的耐药以及多重耐药情况严重,多重耐药率整体呈逐渐上升的时间趋势,耐药谱具有多样性,耐药基因等可移动遗传元件介导的耐药机制为耐药和多重耐药产生的主要原因。

34株鸭疫里默氏杆菌的分离鉴定及部分耐药基因调查分析

为更好的指导养殖场鸭疫里默氏杆菌病临床用药以及探究该菌多重耐药机制,本研究对安徽地区患病鸭采样、细菌分离鉴定后,进行生化鉴定、药敏试验,再根据药敏结果进行氨基糖苷类耐药基因以及Ⅰ类整合子鉴定。药敏试验结果表明该地区34株鸭疫里默氏杆菌分离株对头孢拉定、头孢曲松、氟苯尼考、大观霉素、磺胺异恶唑等抗生素较敏感,对卡那霉素、庆大霉素、丁胺卡那、链霉素、阿奇霉素等抗生素均有较强的耐药性;其中有97%的菌株存在多重耐药现象,最高可耐19种抗生素。15种氨基糖苷类耐药基因鉴定结果表明aac(6')Ⅰb基因、aac(6')Ⅱ基因、rmtC基因、aph(3')Ⅱa基因检出率分别为94.1%(32/34)、82.4%(28/34)、73.5%(25/34)、70.6%(24/34),其余基因均未检测到;同时34株分离株均携带Ⅰ类整合子,大小为1 kb,其基因盒种类为aadA1(链霉素耐药基因);其氨基糖苷类耐药表型和耐药基因符合率大于69%。因此,安徽地区鸭疫里默氏杆菌分离株多重耐药性严重,需加强对抗生素的用药规范性,特别要注意氨基糖苷类药物使用。

鸡源大肠杆菌对β-内酰胺类药物的耐药性分析和耐药基因检测

为研究江苏部分地区鸡源大肠杆菌对β-内酰胺类抗菌药物的耐药情况和耐药基因,分析其耐药表型与耐药基因的相关性,以K-B纸片扩散法对分离的20株鸡源大肠杆菌进行11种β-内酰胺类药物的敏感性分析,PCR法检测bla_(CTX-M-1)、bla_(CTX-M-2)、bla_(CTX-M-8)、bla_(CTX-M-9)、bla_(TEM)与bla_(SHV)等6种耐药基因携带情况。结果显示:20株鸡源大肠杆菌对β-内酰胺类药物的耐药率较高,其中苯唑西林为100%,氨苄西林为75%,头孢呋辛为70%,对头孢哌酮、头孢曲松的耐药率最低,均为30%,且分离菌株表现为多重耐药;共检出3种耐药基因,bla_(CTX-M-1)、bla_(TEM)、bla_(SHV),检出率分别为85%、30%、30%,7株分离菌同时携带2种及以上耐药基因,占比35%(7/20);11种β-内酰胺类药物与blaCTX-M-1基因的符合率较高,均达85%以上,与bla_(SHV)基因的符合率相对低些,均在40%以下,且耐药表型与耐药基因型并不完全吻合。提示:江苏部分地区鸡源大肠杆菌对β-内酰胺类药物的耐药问题比较严重,应加强当地鸡源大肠杆菌的耐药性监测,从而选择合适的药物防治鸡大肠杆菌病。

血培养大肠埃希菌的耐药特点、毒力基因分布及种系分型

目的检测并分析血培养大肠埃希菌的耐药特点、种系分型和毒力基因分布。方法收集我院2019年1月1日至2020年12月13日连续且非重复血培养大肠埃希菌。采用微量肉汤法测定大肠埃希菌对17种抗菌药物的敏感性;水煮法提取细菌基因组DNA,采用PCR法检测arpA、chuA、yjaA、TspE4C2、ArpAgpE和trpAgpC基因以确定细菌的种系分型;采用多重PCR法检测毒力基因iutA、fimH、fyuA、kpsMTⅡ、cnf1、cvac、hlyA、traT、kpsMTⅢ和PAI;使用卡方检验分析种系分型之间的耐药率及毒力基因分布差异。结果270株血培养大肠埃希菌对头孢曲松、复方新诺明、氨苄西林、氨苄西林/舒巴坦、头孢唑林和环丙沙星的耐药率较高,均大于50.0%;对亚胺培南、厄他培南、阿米卡星和哌拉西林/他唑巴坦的敏感性较高,耐药率均低于5.0%。在种系分型方面,最常见的型别是B2型和D型,分别占总数的38.0%和16.2%,而E型和隐分支Ⅰ型占比<1.0%,较为少见。毒力基因分析发现,fimH和fyuA基因的分布率最高,均在99.0%以上,而kpsMTⅢ、hlyA和cvaC 3种基因的分布率较低,均低于20.0%。卡方检验显示,毒力基因iutA、fimH、fyuA、kpsMTⅡ、cnf1、PAI在B2型的分布显著高于非B2型(P<0.05),且B2型携带的iutA、fyuA、kpsMTⅡ、cnf1、PAI基因显著高于D型(P<0.05)。结论在治疗引起血流感染的大肠埃希菌时,应慎用头孢曲松、复方新诺明、氨苄西林、氨苄西林/舒巴坦、头孢唑林和环丙沙星等药物。血流感染的大肠埃希菌为B2型时,应同时进行中段尿培养以确认感染源并监测治疗的成功率。

河南地区兔源克雷伯氏菌耐药性及耐药基因的分析

为了解河南地区兔源克雷伯氏菌的生物学特性、携带的耐药基因及耐药基因与耐药表型之间的相关性,本研究于2022年3月~2023年4月从河南省7个不同地区规模化养兔场共采集74份具有典型克雷伯氏菌病临床症状兔的病料样品,分别划线接种于LB固体培养板和血琼脂培养板进行病原菌的分离培养。通过菌落形态观察、革兰染色镜检、生化试验、PCR扩增克雷伯氏菌Khe基因并经BLAST比对和构建Khe基因的进化树确定细菌的种类。结果显示,从74份兔病料样品中共分离到10株克雷伯氏菌,且该10株菌主要集中在洛阳(3/10)和周口(2/10),开封、郑州、漯河、济源及新乡各分离到1株。分别通过K-B法和PCR对不同地区来源的菌株进行3类共8种药物的药敏试验和上述药物的相关耐药基因检测,采用SPSS 26软件分析耐药表型与耐药基因之间的相关性。结果显示,对新霉素、庆大霉素、卡那霉素(氨基糖苷类),环丙沙星、诺氟沙星(喹诺酮类),四环素(四环素类)6种药物耐药的菌株占80%~100%,对氧氟沙星(喹诺酮类)和多西环素(四环素类)耐药的菌株占60%~70%,且多重耐药菌株占90%,并以耐庆大霉素和环丙沙星药物为主。对上述3类药物平均耐药菌株的占比分别为90%、80%和80%。从洛阳、开封和郑州地区分离的菌株耐药严重,对8种药物均耐药,呈严重的多重耐药性;周口和新乡地区分离的菌株耐药性虽相对较弱,但也呈多重耐药性。耐药基因的PCR结果显示,aac(6')-Ib、ant(3'')-I和aph(3'')-I(氨基糖苷类)、Aac6和q Ep A(喹诺酮类)、tetQ(四环素类)的检测率均高达60%以上,qnrs(喹诺酮类)的检测率为30%,未检出tetO(四环素类)。从洛阳分离的菌株携带耐药基因的数量和种类最多,从周口和郑州分离的菌株携带耐药基因的数量和种类较少,从开封、漯河、济源和新乡分离的菌株携带耐药基因的数量相同,但携带耐药基因的种类不同。经计算分析,10株菌对氨基糖苷类和喹诺酮类药物的耐药表型及其耐药基因之间基本呈正相关(符合率分别为81.4%和70.9%),四环素类耐药表型和耐药基因的符合率较低仅为37.5%,但分离菌对四环素类药物呈一定的耐药性。综上表明,河南地区兔源克雷伯氏菌的耐药性严重,且多呈多重耐药性,耐药基因较复杂多样。本研究首次检测了河南地区兔源克雷伯氏菌的耐药表型与耐药基因并分析它们之间的相关性,为河南地区兔场克雷伯氏菌病的防治提供参考依据。

鸡源大肠杆菌生物被膜形成与耐药性、毒力基因的关联性分析

旨在了解鸡源大肠杆菌临床分离株生物被膜形成能力与耐药性、毒力基因之间的关系。通过刚果红试验、结晶紫染色法测定生物被膜形成能力;采用微量肉汤稀释法检测分离株对阿莫西林、氟苯尼考、庆大霉素等8种抗菌药的耐药性;PCR检测常见耐药、毒力基因携带情况;采用实时荧光定量PCR检测毒力基因在生物被膜阳性菌中的表达量。结果表明,在51株分离株中,生物被膜阳性菌株比例为19.61%,阳性菌株中,OD_(600)最大值为2.233±0.702,最小值为0.374±0.099,其他介于1.455~1.604之间;耐药性检测显示,生物被膜阳性菌株对头孢喹肟、氟苯尼考、庆大霉素、阿米卡星、黏菌素的耐药率均高于阴性菌株,其中对阿米卡星和黏菌素差异显著(P<0.05),但对多西环素耐药率低于阴性菌株,差异显著(P<0.05),二者对阿莫西林+克拉维酸、恩诺沙星耐药率无差异;OD_(600)值最大的E13对8种测定药物全部耐药,6株OD_(600)值介于1.455~1.604的菌株对5种及以上抗菌药产生耐药性,OD_(600)值为0.374的菌株E39为敏感菌株。PCR结果显示耐药基因bla_(CTX-M-9)、bla_(CTX-M-U)、bla_(OXA-1)、mcr-1、rmtB、floR在生物被膜阳性菌株中的检出率高于阴性菌株,菌株E13同时携带9种耐药基因;共检出16种毒力基因,其中fimH、astA、aggR、irp1、iucD、fyuA、ybtA、ompA在生物被膜阳性菌株中的检出率高于阴性菌株,且阳性菌株毒力基因型复杂;以OD_(600)值为0.374的E39菌株为对照,OD_(600)值较大的生物被膜阳性菌株中,fimH、ompA、ompA、iucD、hlyF毒力基因表达呈现上调趋势。综上,与生物被膜阴性菌株相比,大肠杆菌生物被膜阳性菌株耐药更为严重,携带毒力基因型更加复杂多样,且毒力基因表达呈现上调趋势。