miR-152-3p表达下调降低紫杉醇耐药人卵巢癌细胞A2780T对紫杉醇的耐药性

目的探讨miR-152-3p对紫杉醇耐药人卵巢癌细胞A2780T对紫杉醇耐药性的影响及机制。方法①紫杉醇(1.875,3.75,7.5,17和23μmol·L^(-1))与人卵巢癌A2780和A2780T细胞作用48 h,MTT法检测细胞存活率,计算抑制细胞存活半数抑制浓度(IC50)值和耐药指数(RI)。Western印迹法检测A2780和A2780T细胞耐药蛋白P-糖蛋白(P-gp)、多药耐药相关蛋白1(MRP1)和三磷酸腺苷结合转运蛋白G超家族成员2(ABCG2)蛋白表达。②实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测A2780和A2780T细胞miR-152-3p表达水平。脂质体瞬时转染技术转染miR-152-3p抑制物降低A2780T细胞中miR-152-3p表达(miR-152-3p抑制物组),同时设转染miR-152-3p阴性对照组,RT-qPCR检测转染效率,MTT法、划痕实验和流式细胞术分别检测转染miR-152-3p抑制物对A2780T细胞存活、迁移和凋亡的影响;Western印迹法检测转染miR-152-3p抑制物对A2780T细胞Bax和Bcl-2蛋白表达的影响。③用miRDB,Targetscan,miRWalk和Starbase数据库预测miR-152-3p的靶基因,并用Western印迹法检测转染miR-152-3p抑制物后A2780T细胞磷酸酯酶张力蛋白同源物(PTEN)蛋白表达的变化及RT-qPCR检测A2780和A2780T细胞PTEN mRNA表达水平予以验证。随后,脂质体瞬时转染技术转染PTEN siRNA沉默A2780T细胞中PTEN表达,同时设转染siRNA阴性对照组,RT-qPCR检测转染效率,MTT法检测沉默PTEN表达后A2780T细胞存活率和IC50值,Western印迹法检测P-gp,MRP1和ABCG2蛋白表达。结果①紫杉醇处理后A2780和A2780T细胞存活率均降低(P<0.01),A2780T细胞RI为2.8。与A2780细胞相比,A2780T细胞P-gp,MRP1和ABCG2蛋白高表达(P<0.05,P<0.01)。②与A2780细胞相比,A2780T细胞miR-152-3p明显高表达(P<0.01)。与转染miR-152-3p阴性对照组比较,转染miR-152-3p抑制物后A2780T细胞存活率(P<0.05,P<0.01)和细胞迁移能力(P<0.05)明显降低,细胞凋亡率升高(P<0.01);Bax蛋白表达增加(P<0.01),Bcl-2蛋白表达降低(P<0.05)。③生物信息学数据库分析结果提示,PTEN是miR-152-3p的一个靶基因;Western印迹法验证显示,转染miR-152-3p抑制物组A2780T细胞PTEN蛋白表达低于转染miR-152-3p阴性对照组(P<0.05);RT-qPCR结果显示,A2780T细胞PTEN mRNA表达水平高于A2780细胞(P<0.01)。转染PTEN siRNA沉默PTEN表达后,与转染siRNA阴性对照组相比,A2780T细胞存活率(P<0.05,P<0.01)和IC50值(P<0.01)显著降低,P-gp,MRP1和ABCG2蛋白表达降低(P<0.05,P<0.01)。结论miR-152-3p在A2780T细胞中高表达,其表达下调可抑制A2780T细胞增殖和迁移,促进细胞凋亡,降低A2780T细胞对紫杉醇的耐药性,该作用可能是通过降低其靶基因PTEN表达发挥的。

糖酵解在非小细胞肺癌吉非替尼耐药中的作用研究

目的探讨糖酵解在非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)吉非替尼(Gefitinib)耐药中的变化及作用。方法体外培养NSCLC亲本细胞PC-9和A549,并采用浓度递增法构建NSCLC吉非替尼耐药细胞PC-9-GR和A549-GR,通过CCK-8和平板克隆形成实验鉴定细胞耐药性,葡萄糖摄取检测试剂盒和乳酸测试盒分别检测葡萄糖代谢和乳酸产出水平,qRT-PCR和Western blot实验检测细胞糖酵解关键酶的mRNA和蛋白表达水平。采用糖酵解抑制剂2-脱氧-D-葡萄糖(2-deoxy-D-glucose,2-DG)抑制细胞糖酵解后,观察细胞活力及吉非替尼耐药性的变化情况。结果相较于各自亲本细胞,耐药细胞PC-9-GR和A549-GR对吉非替尼抵抗性增强(均P<0.01),葡萄糖代谢速率和乳酸产出水平提高(均P<0.01);糖酵解关键酶HK2、LDHA和PFK的mRNA表达水平升高(均P<0.001),HK2、LDHA、PFKP和PKM2的蛋白表达水平增加(均P<0.001)。2-DG对耐药细胞活力的抑制作用较各自亲本细胞更明显(均P<0.05),且在一定程度上可增强吉非替尼对耐药细胞的杀伤效应。结论NSCLC吉非替尼耐药伴随着糖酵解的激活,该过程可能与糖酵解关键酶表达升高有关,抑制其水平或活性可能是逆转吉非替尼耐药的有效措施。

甘肃省食源性单核细胞增生李斯特菌耐药性和基因组特征研究

目的分析甘肃省市售食品中分离的25株单核细胞增生李斯特菌耐药性和基因组特征,为单核细胞增生李斯特菌引起的食源性疾病的防控提供依据。方法以2021—2022年甘肃省市售食品中分离的25株单核细胞增生李斯特菌为研究对象,采用肉汤微量稀释法检测菌株对8种抗菌药物的敏感性,并对菌株进行血清分型和全基因组测序,分析其系统发育谱系、CC型、ST型、血清型、耐药表型及基因、毒力基因、抗性基因、系统发生关系。结果25株单核细胞增生李斯特菌分属谱系Ⅰ、谱系Ⅱ,以谱系Ⅱ为主,共21株(84.0%)。血清型以1/2a为主,共14株(56.0%),分属10个CC型,其中CC9、CC8和CC121为优势CC型,共占56.0%(14株),发现一个新的ST型,即ST3142。仅1株单核细胞增生李斯特菌耐药(4.0%,1/25),为复方磺胺甲恶唑、红霉素、四环素和环丙沙星多重耐药株,本研究菌株耐药表型与耐药基因的携带情况基本一致。25株单核细胞增生李斯特菌均携带LIPI-1和内化素基因,未发现携带LIPI-3的菌株,仅2株ST87型菌株携带LIPI-4。16株菌(64.0%)携带SSI-1,5株ST121携带SSI-2。68.0%(17/25)的菌株inlA基因发生了提前终止(PMSC)。核心基因组多位点序列分型分析能将不同谱系、血清群和CC型的菌株明显分开,25株菌共分为10个亚群,与CC型保持一致。结论甘肃省市售食品中25株单核细胞增生李斯特菌呈现遗传进化多样性,耐药基因及表型均表现出低耐药率,且携带的毒力基因丰富。

Th1/Th2细胞表达对耐多药肺结核患者治疗转归的影响

目的探讨辅助T细胞1(Th1)/辅助T细胞2(Th2)细胞表达对耐多药肺结核(MDR-TB)患者治疗转归的影响。方法回顾性纳入南阳市中心医院2019年1月至2022年9月收治的92例MDR-TB患者临床资料。所有患者均接受左氧氟沙星、贝达喹啉、利奈唑胺、氯法齐明、环丝氨酸联合治疗,强化治疗周期为6个月。根据强化治疗结束后患者治疗转归情况将患者分为转归良好组(74例)和转归不良组(18例)。对比两组一般资料和治疗前所测的Th1、Th2细胞表达情况及其他实验室指标,分析Th1/Th2细胞表达对患者治疗转归的影响。结果转归不良组有既往吸烟史占比、Th2高于转归良好组,Th1、Th1/Th2低于转归良好组(P<0.05)。经点二列相关性分析显示,Th1、Th2、Th1/Th2细胞表达与MDR-TB患者治疗转归情况有关。绘制受试者工作特征(ROC)曲线,结果显示,Th1、Th2、Th1/Th2细胞表达预测MDR-TB患者治疗转归的曲线下面积(AUC)分别为0.827、0.813、0.883,Th1/Th2预测价值最高。结论Th1/Th2细胞表达可对MDR-TB患者治疗转归的产生影响,其值越高,治疗转归不良发生率越高。

当归多糖对结直肠癌细胞顺铂耐药性的影响及作用机制

目的 探讨当归多糖对结直肠癌细胞顺铂耐药性的影响及作用机制。方法 将人结直肠癌细胞HT-15、顺铂耐药细胞株HT-15/DDP仅使用30μmol/L浓度的顺铂干预设为对照组,使用对应质量浓度1.0、1.5、2.0 mg/mL的当归多糖干预12 h后再加入30μmol/L浓度顺铂设为当归多糖组。通过脂质体细胞转染技术分别将miR-10b-5p inhibitor、TGFBR2 mimics转染至HT-15/DDP细胞中,再加入2.0 mg/mL当归多糖干预48 h,然后将其分为当归多糖(2.0 mg/mL)+miR-10b-5p inhibitor组、当归多糖(2.0 mg/mL)+TGFBR2 mimics组。MTT法检测细胞增殖能力;Transwell小室试验检测细胞迁移能力;流式细胞术检测细胞凋亡能力。RT-PCR检测miR-10b-5p、TGFBR2 mRNA表达水平;Western blot检测TGFBR2蛋白表达水平。结果 单独顺铂干预的对照组HT-15/DDP细胞增殖率、细胞迁移个数明显高于HT-15细胞(P<0.01);经不同质量浓度当归多糖预处理12 h后,可明显增强HT-15/DDP细胞对顺铂的敏感性,HT-15/DDP细胞增殖率、细胞迁移个数明显降低(P<0.01)。单独顺铂干预的对照组HT-15/DDP细胞凋亡率明显低于HT-15细胞(P<0.01);经不同质量浓度当归多糖预处理12 h后,明显增强了HT-15/DDP细胞对顺铂的敏感性,HT-15/DDP细胞凋亡率明显升高(P<0.01)。HT-15/DDP细胞miR-10b-5p、TGFBR2表达水平在各组间比较差异均具有统计学意义(P<0.01);不同剂量当归多糖组中HT-15/DDP细胞miR-10b-5p表达水平明显低于对照组,TGFBR2表达水平明显高于对照组(P<0.01),随着当归多糖剂量的增加miR-10b-5p表达水平逐渐降低,TGFBR2表达水平逐渐升高(P<0.01)。使用生物信息学数据库(TargetScan、miRanda)预测miR-10b-5p的靶基因,结果显示,TGFBR2是miR-10b-5p的候选靶基因。miR-10b-5p表达下调后,HT-15/DDP细胞中TGFBR2相对表达量明显高于对照组HT-15/DDP细胞中TGFBR2相对表达量(P<0.01)。当归多糖(2.0 mg/mL)+miR-10b-5p inhibitor组、当归多糖(2.0 mg/mL)+TGFBR2 mimics组的HT-15/DDP细胞增殖率、细胞增殖迁移个数明显低于当归多糖组(2.0 mg/mL),HT-15/DDP细胞凋亡率明显高于当归多糖组(2.0 mg/mL)(P<0.05)。结论 当归多糖可通过下调miR-10b-5p表达、上调TGFBR2表达逆转结直肠癌细胞顺铂耐药性,进而抑制肿瘤细胞增殖、迁移,促进细胞凋亡。

多重耐药菌感染肺炎患者巨噬细胞表型、血清炎症因子水平变化与治疗预后的相关性

目的探究不同预后的多重耐药菌感染肺炎患者巨噬细胞表型、血清炎症因子水平特征并分析与预后的相关性。方法选取2023年1月-10月在我院就诊的101例多重耐药菌感染肺炎患者作为研究对象。根据患者确诊及治疗后1个月内预后情况划分为预后良好组(n=71)和预后不良组(n=30)。对比两组患者间一般临床资料、入院时常规临床检验指标[白细胞(WBC)、中性粒细胞计数(NEU)、淋巴细胞计数(LYM)、血红蛋白(Hb)、D-二聚体(D-D)]、有创操作情况(通气方式、是否留置胃管、是否留置尿管、是否深静脉置管)、巨噬细胞表型和血清炎症因子[白细胞介素(IL)-1β、IL-6、IL-10、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、降钙素原(PCT)、C-反应蛋白(CRP)]的表达水平差异。通过Spearman相关性检验与多因素Logistic回归分析筛选多重耐药菌感染肺炎患者预后不良的危险因素。结果预后不良组患者平均WBC、NEU水平均显著高于预后良好组患者,平均Hb水平显著低于预后良好组患者(P<0.05);平均M1型巨噬细胞比例、M1/M2比值均显著高于预后良好组患者,平均M2型巨噬细胞比例显著低于预后良好组患者(P<0.05);平均血清IL-1β、PCT水平均显著高于预后良好组患者,平均血清IL-10水平显著低于预后良好组患者(P<0.05);Spearman相关性分析及多因素Logistic回归分析发现多重耐药菌感染肺炎患者M1型巨噬细胞比例较高、M1/M2比值较高、血清IL-1β水平较高、PCT水平较高、M2型巨噬细胞比例较低、血清IL-10水平较低均是不良预后的独立危险因素(P<0.05)。结论多重耐药菌感染肺炎患者巨噬细胞分型及炎症水平与预后不良存在显著相关性,其中M1型巨噬细胞增多、促炎性细胞因子升高、M2型巨噬细胞减少及抗炎性细胞因子降低均是评估不良预后的重要生物学指标,对于预测患者临床结局具有一定意义。

转录因子MYB转录调控MTFR2通过DNA损伤修复促进胃癌细胞化疗耐药性

目的探究v-myb禽成髓细胞病病毒癌基因同源物(MYB)转录调控线粒体裂变调节因子2(MTFR2)对胃癌(GC)细胞顺铂(DDP)耐药性的影响及分子作用机制。方法TCGA数据库分析GC中差异mRNA并预测上游调控分子,qRT-PCR检测MTFR2和MYB的表达,双荧光素酶和染色质免疫共沉淀(ChIP)实验验证MTFR2和MYB的调控关系,细胞计数盒8(CCK-8)检测细胞活力并计算IC_(50)值,流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡,彗星实验检测DNA损伤,蛋白质免疫印迹法检测DNA损伤相关蛋白(γ-H2AX、ATM、p-ATM)的表达。结果MTFR2在GC组织和细胞中显著高表达,敲低MTFR2能够降低细胞增殖,阻滞S期,诱导细胞凋亡,促进DNA损伤和DDP敏感性。生信预测MTFR2存在上游转录因子MYB,MYB在GC组织和细胞中的表达显著上调,双荧光素酶和ChIP验证了MTFR2启动子区域与MYB的结合关系。回复实验发现进一步过表达MTFR2能够逆转敲低MYB对GC细胞增殖和DDP耐药性的抑制作用。结论MYB上调MTFR2的表达通过DNA损伤途径促进GC细胞增殖和DDP耐药,表明靶向MYB/MTFR2调控轴可能是克服GC DDP耐药性的潜在途径。

人参皂苷 Rg3对人乳腺癌细胞紫杉醇化疗耐药的影响

目的:分析人参皂苷Rg3对人乳腺癌细胞紫杉醇化疗耐药的影响。方法:选择2021年1月至2022年12月为4研究时间段,经低浓度持续递增法建立乳腺癌紫杉醇(PTX)耐药细胞,稀释细胞浓度1×10^(4)个/mL,在96孔板中接种,在明确贴壁后,加入紫杉醇(150µM),分为5组,分别为空白对照组、PTX组、3组G-Rg3+PTX组,每组设3个平行样本。其中,3组G-Rg3+PTX组分别加入G-Rg3药物60µM、80µM、100µM,PTX组及G-Rg3+PTX组均加入PTX 150µM。待PTX组、加入不同浓度(60µM、80µM、100µM)的G-Rg3+PTX组,共4组人乳腺癌MCF-7细胞处理24 h后,检测4组吸光值(OD值),经Annexin-V/FITC和PI双染,流式细胞仪检测,利用GraphPad Prism 7.04计算半数抑制浓度(IC50)值和耐药指数(RI);其中,RI计算公式为RI=空白对照组耐药细胞IC50/亲本MCF-7细胞IC500。结果:经24 h处理后,空白对照组OD值(0.90±0.04),无IC50值、RI值;PTX组的OD值(0.40±0.06)、IC50值(725.60±5.85)µmol/L、RI值3.2;G-Rg3+PTX组60µM的OD值(0.21±0.06)、IC50值(686.68±5.36)µmol/L、RI值4.9;80µM的OD值(0.17±0.05)、IC50值(412.46±723)µmol/L、RI值6.7;100µM的OD值(0.14±0.04)、IC50值(235.87±5.93)µmol/L、RI值9.1。结论:人参皂苷Rg3能够影响人乳腺癌细胞紫杉醇的化疗耐药性,提升对癌症的抑制作用。

降低有氧糖酵解增强非小细胞肺癌耐药细胞对顺铂的敏感性

目的:探究顺铂耐药的非小细胞肺癌细胞糖代谢的特点及抑制有氧糖酵解对非小细胞肺癌细胞顺铂耐药细胞的影响及其机制。方法:通过梯度倍增浓度法建立非小细胞肺癌顺铂耐药细胞模型(A549/DDP);酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,Elisa)检测A549/DDP与A549细胞两组葡萄糖消耗量、三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)释放量、乳酸生成及丙酮酸生成量的差异;CCK-8法(cell counting kit-8)检测2-脱氧葡萄糖(2-deoxyglucose,2-DG)及顺铂处理后A549/DDP与A549细胞增殖能力的变化;Elisa检测2-DG处理A549/DDP细胞与A549细胞葡萄糖消耗量、ATP释放量、乳酸生成及丙酮酸生成量的差异;Elisa检测2-DG处理A549/DDP细胞与A549细胞后对非神经元性烯醇化酶(recombinant enolase 1,ENO1)、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase,G6PD)、缺氧诱导因子-α(hypoxia inducible factor-α,HIF-α)表达的影响。结果:与A549细胞相比,顺铂耐药细胞株短时间内生长速度无明显差异。A549/DDP细胞消耗葡萄糖量增多、有氧糖酵解产生ATP增多、乳酸生成及丙酮酸释放量也增多,有氧糖酵解能力明显增强,差异具有统计学意义。2-DG处理后能够显著逆转A549/DDP细胞对顺铂的耐药性,增强对顺铂的敏感性,达到抑制A549/DDP细胞增殖的效果,差异具有统计学意义。2-DG能够抑制A549/DDP细胞的葡萄糖摄取,减少ATP的释放,减少乳酸生成及丙酮酸的产生,差异具有统计学意义。与A549细胞相比,A549/DDP细胞ENO1、G6PD、HIF-α表达水平升高,2-DG抑制有氧糖酵解后三者表达水平均降低,差异具有统计学意义。结论:2-DG抑制非小细胞肺癌细胞顺铂耐药有氧糖酵解,可在一定程度上逆转其对顺铂的耐药性。

白细胞减少的准广泛耐药肺结核患者使用康替唑胺的临床实践分析

目的:分析1例白细胞减少的准广泛耐药(pre-extensively drug-resistant,pre-XDR)肺结核患者使用康替唑胺的临床实践过程,为类似耐药结核病患者探索有效的抗结核治疗方案提供参考。方法与结果:患者4个月前被确诊为pre-XDR肺结核,并予贝达喹啉+利奈唑胺+氯法齐明+环丝氨酸+丙硫异烟胺抗结核治疗;治疗20 d后,反复出现头晕、多梦、易醒等症状;1 d前,再次出现难以入睡症状并伴烦热感和右膝关节疼痛,遂入院治疗;住院期间,患者多次出现白细胞减少情况,考虑为利奈唑胺骨髓抑制所致,服用利可君片亦不能改善,临床在斟酌后决定停用利奈唑胺,改用康替唑胺,之后白细胞水平果然明显恢复;此外,患者反复出现的难以入睡症状考虑为环丝氨酸的中枢神经毒性反应,而住院期间出现的Q-T间期延长则考虑是贝达喹啉所致,遂决定停用此二药;最后,患者的抗结核方案被调整为康替唑胺+氯法齐明+阿米卡星+乙胺丁醇+丙硫异烟胺,之后患者未再出现不适症状和指标异常。结论:pre-XDR肺结核属于较为难治的疾病,治疗时用药较多且复杂,很容易发生药物不良反应,并且部分药物不良反应可能会导致严重不良后果;对此,临床应采取积极干预措施,并及时调整抗结核治疗方案,以保证患者的用药安全和治疗效果。

枸杞多糖联合奥沙利铂可逆转结肠癌干细胞的耐药

背景:结肠癌临床主要采用以氟尿嘧啶、伊立替康及奥沙利铂为基础的治疗方法,研究发现这些药物的转运与ABC转运蛋白G家族成员2(ATP-binding cassette transport protein of G2,ABCG2)等膜转运蛋白相关,然而当患者对这些化疗药物产生耐药后,ABCG2的高表达致使治疗效果明显下降,引起了结肠癌的耐药问题。临床急切需要新的药物及治疗方法来提高疗效,枸杞多糖具有广泛的生物学活性,将多糖作为抗肿瘤药物,可以克服化疗和放疗过程中杀死肿瘤细胞的同时对机体正常细胞的损伤。目的:通过体外实验探索枸杞多糖联合奥沙利铂对结肠癌干细胞耐药的逆转作用,进而探讨枸杞多糖逆转结肠癌耐药的可能分子机制。方法:选用结肠癌细胞株HCT116以及奥沙利铂耐药细胞株HCT116-OXR进行体外实验,采用CCK8检测细胞增殖情况确定枸杞多糖和奥沙利铂的最适干预浓度和干预时间,进一步分为HCT116对照组,HCT116-OXR空白处理组,枸杞多糖组(2.5 mg/mL枸杞多糖),奥沙利铂组(10μmol/L奥沙利铂),枸杞多糖+奥沙利铂组(2.5 mg/mL枸杞多糖+10μmol/L奥沙利铂),流式细胞仪检测细胞凋亡情况,免疫荧光和Western blot检测磷酸甘露糖异构酶(phosphomannose isomerase,PMI)和ABCG2的表达,Western blot检测PI3K,AKT,Bcl-2和Bax的蛋白表达水平。结果与结论:①HCT116-OXR相较HCT116对枸杞多糖更敏感(P<0.05);②与HCT116-OXR空白处理组比较,奥沙利铂联合枸杞多糖促进了HCT116-OXR细胞凋亡(P<0.05),Bcl-2蛋白表达明显下调(P<0.05),Bax蛋白表达明显上调(P<0.05),ABCG2、PMI、PI3K、AKT的蛋白表达明显下调(P<0.05);③结果表明枸杞多糖通过抑制PMI/PI3K/AKT通路逆转结肠癌耐药,为研究枸杞多糖增敏化疗作用的分子机制奠定了基础。

小细胞肺癌耐药细胞的建立及生物学特性和多药耐药性鉴定

目的建立对顺铂与依托泊苷抵抗的小细胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)耐药细胞NCI-H446/EP,对其生物学特性和多药耐药性进行评价。方法裸鼠皮下接种SCLC NCI-H446细胞构建异种移植瘤体内模型,给予SCLC一线EP方案治疗,诱导体内耐药,剥离瘤组织体外培养获得耐药细胞。体外实验检测其耐药系数,细胞倍增时间,细胞周期分布,多药耐药基因(MDR1)、耐药相关蛋白的表达,体内验证其耐药性。结果NCI-H446成瘤裸鼠给予EP治疗,8周后产生获得性耐药,经分离培养获得耐药细胞株NCI-H446/EP。该细胞株对顺铂、依托泊苷、SN38和阿霉素的耐药系数分别是12.01、18.36、65.4和10.12。与亲本细胞相比,耐药细胞G 0/G 1期比例明显增加,G 2/M期细胞比例减少,倍增时间延长。耐药细胞MDR1在mRNA及蛋白水平均高于亲本细胞,在体内也具有耐药性。结论成功构建了SCLC耐药细胞株NCI-H446/EP,该细胞具有多药耐药的基本特征,可用于抗SCLC药物筛选及耐药机制的研究。

蟾毒灵抑制乏氧耐药细胞诱导的M2型巨噬细胞极化逆转结肠癌耐药

目的:在乏氧微环境中探讨蟾毒灵(bufalin,BU)抑制耐药结肠癌细胞诱导M2型巨噬细胞极化对普通结肠癌细胞的作用。方法:培养基中加入氯化钴(cobalt chloride,CoCl 2)模拟乏氧环境,佛波酯(phorbol 12-myristate 13-acetate,PMA)诱导人源单核细胞THP-1分化为M0巨噬细胞。分别采集乏氧条件下耐药结肠癌细胞、普通结肠癌细胞和BU作用于耐药结肠癌细胞的条件培养基(conditioned medium,CM),然后放入M0巨噬细胞中。通过流式细胞术、Realtime PCR、ELISA实验检测M2型巨噬细胞极化标志因子的表达;运用CCK-8和蛋白免疫印迹(western blot,WB)实验检测耐药结肠癌和普通结肠癌条件培养基诱导M2型巨噬细胞极化后的上清对普通结肠癌的作用。结果:在缺氧环境下,与普通结肠癌细胞相比,耐药结肠癌细胞CM促进M2型巨噬细胞标志物IL-10、TGF-β、CD11b、CD206升高(P<0.01,P<0.05)。极化巨噬细胞的上清液增加了普通结肠癌细胞中P-gp和Bcl-2的表达,同时降低了Bax的表达和对奥沙利铂的敏感性。耐药结肠癌细胞经BU处理后,M2型巨噬细胞标志物IL-10、TGF-β、CD11b、CD206表达降低(P<0.01,P<0.05)。此外,P-gp和Bcl-2的表达减少,而Bax的表达增加,导致对OXA的敏感性增加。结论:乏氧条件下,结肠癌耐药细胞CM促进M2型巨噬细胞极化,蟾蜍灵可通过调节M2型巨噬细胞极化过程逆转结肠癌耐药。

索拉非尼基于Hippo/YAP及PI3K/Akt/mTOR信号通路介导细胞自噬在肝细胞癌中产生耐药机制研究进展

肝细胞癌(HCC)是世界上最常见的恶性肿瘤之一,它的形成是一个复杂的过程,其具体形成机制尚不明确,由于大多数HCC患者被诊断出来时已是晚期,通常已丧失良好的手术时机。而靶向药物的出现给当前HCC患者带来了新的希望,同时还可作为术后治疗措施,在HCC中发挥着巨大的作用。索拉非尼是第一个被用于治疗HCC的靶向药物,它可抑制肝肿瘤组织血管生成和细胞增殖,可诱导肝肿瘤细胞凋亡,进而提高部分肝癌患者的生存率。但据目前研究显示,有50%~60%HCC经治患者对该药物出现了敏感性下降。主要是由于索拉非尼使用后会抑制体内相关信号通路,从而致使耐药的发生,故进一步探索索拉非尼耐药机制,使其逆转索拉非尼耐药对于改善肝癌治疗的预后具有极其重要的临床价值。近些年来,许多学者致力研究索拉非尼通过Hippo/YAP及PI3K/Akt/mTOR信号通路介导细胞自噬与耐药性的产生有着密切联系。并探讨其耐药分子机制,使该领域获得了巨大的发展。因此,本篇文章主要从Hippo/YAP及PI3K/Akt/mTOR信号通路展开,探讨其与细胞自噬之间的关系以及介导的耐药机制,为索拉非尼治疗肝癌产生耐药性提供可靠的科学理论依据。

沉默NAC-1基因对人卵巢癌耐药细胞株SKOV3/DDP裸鼠移植瘤化疗敏感的影响

目的:探讨核转录因子NAC-1基因沉默对人卵巢癌耐药细胞株SKOV3/DDP裸鼠移植瘤化疗敏感性的影响。方法:采用LV4-LUC-GFP慢病毒转染建立NAC-1基因沉默SKOV3/DDP细胞株,将细胞接种到免疫缺陷小鼠皮下,建立人卵巢癌耐药细胞株SKOV3/DDP裸鼠移植瘤模型,给予顺铂化疗,比较NAC-1基因沉默对SKOV3/DDP在裸鼠体内增殖的影响。取肿瘤组织进行转录组测序,利用Illumina平台进行转录组mRNA测序,筛选差异表达基因,并进行GO和KEGG功能注释和富集分析,揭示NAC-1基因影响移植瘤化疗敏感的可能分子机制。使用STRING数据库构建DEGs编码蛋白互作网络,筛选MCC算法、Degree算法、Closeness算法3种算法共有基因作为关键基因,使用Metascape网站在线分析这些共同基因的基因功能。结果:与对照组相比,抑制NAC-1基因后裸鼠皮下肿瘤体积变小,重量减轻,差异有统计学意义(P<0.05)。转录组学分析显示,抑制NAC-1基因导致肿瘤组织中460个基因显著下调,568个基因显著上调。差异基因(DEGs)在多项GO富集类别中具有显著差异,如细胞代谢、有丝分裂、坏死、炎症、信号传递等。KEGG功能富集结果显示,NAC-1基因沉默可能影响了细胞因子-细胞因子受体相互作用、白细胞跨内皮迁移、神经活性配体-受体相互作用、细胞黏附分子、坏死、ECM受体相互作用、PI3K-Akt信号通路、NF-κB信号通路等。筛选获得的关键基因主要富集在白细胞介素的信号传导、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)通路、炎症反应等通路。结论:抑制NAC-1基因能提高人卵巢癌耐药细胞株SKOV3/DDP化疗敏感性,其可能通过多个信号通路影响肿瘤细胞的代谢、增殖、死亡、炎症反应等。

沉默MPZL1调控β-catenin对A549/Tax细胞干性及耐药性的影响

目的探讨髓磷脂蛋白零样蛋白1(MPZL1)沉默后是否通过调控β-catenin表达对A549/Tax耐药性和细胞干性产生影响。方法采用不同浓度阿霉素和紫杉醇处理A549和A549紫杉醇耐药性(A549/Tax)细胞,观察两种细胞的耐药性差异。实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)和Western blot检测A549和A549/Tax细胞中MPZL1的表达量差异。对A549/Tax细胞沉默或者过表达MPZL1,进一步将细胞分为对照(control)组、短发卡RNA阴性对照(sh-NC)组、MPZL1沉默(sh-MPZL1)组、过表达阴性对照(OE-NC)组、MPZL1过表达(OE-MPZL1)组,运用细胞计数试剂盒8(CCK-8)和平板克隆实验分别检测MPZL1的表达变化对A549/Tax细胞增殖和克隆形成能力的影响。Western blot检测Wnt/β-catenin抑制剂XAV939和激活剂CHIR-99201处理细胞后,不同蛋白的表达变化。结果A549/Tax细胞对阿霉素和紫杉醇的半数抑制浓度(IC 50)较A549细胞明显增加(P<0.01)。MPZL1在A549/Tax中呈更高的表达趋势。MPZL1敲除后A549/Tax对阿霉素和紫杉醇的IC 50分别为2.731 mg/ml和4.939μg/ml,较阴性对照组的4.541 mg/ml和13.55μg/ml降低(P<0.01)。CCK-8和克隆形成实验结果显示,MPZL1敲除抑制肺癌A549/Tax细胞的增殖活力和克隆形成能力(P<0.05);Western blot结果显示,与阴性对照组相比,MPZL1、肿瘤干性相关蛋白(CD44和CD133)、多药耐药蛋白1(MDR1)、肺耐药相关蛋白(LRP)和β-catenin在sh-MPZL1中的表达水平明显减少(P<0.01)。此外,XAV939可抑制MPZL1、CD44、CD133、MDR1、LRP和β-catenin的表达。CHIR-99201处理细胞后部分逆转敲除MPZL1对上述蛋白的抑制作用。结论MPZL1在肺癌A549/Tax细胞中高表达。敲除MPZL1可抑制肿瘤干性和细胞增殖,增强肺癌A549/Tax细胞对阿霉素和紫杉醇的敏感性。

华蟾素对HepG_(2)/ADM细胞耐药的抑制作用及其机制研究

目的观察华蟾素对人肝癌细胞HepG_(2)/阿霉素(ADM)耐药性的影响并分析其可能的作用机制。方法用不同浓度的华蟾素处理HepG_(2)和HepG_(2)/ADM细胞24 h,MTT法检测细胞增殖抑制率,计算半数抑制浓度(IC 50);倒置显微镜观察细胞形态学变化;药物蓄积实验检测对细胞内药物累积的影响;Western blot实验检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-9、Caspase-3表达情况。结果华蟾素能对HepG_(2)和HepG_(2)/ADM细胞具有增殖抑制作用,耐药倍数为4.67;随华蟾素处理浓度升高,HepG_(2)/ADM细胞体积变小,细胞皱缩突起减少,细胞间连接减少;与耐药组比较,华蟾素可提高HepG_(2)/ADM细胞对阿霉素的蓄积水平,上调Bax、Caspase-9、Caspase-3蛋白表达(P<0.05),下调Bcl-2蛋白表达(P<0.01),促进细胞凋亡。结论华蟾素能够显著抑制HepG_(2)/ADM细胞增殖,增加ADM在细胞内的蓄积,其作用机制可能与调控Bcl-2/Bax蛋白表达,诱导细胞凋亡有关。

汉防己甲素对白血病骨髓间充质干细胞相关耐药的影响及其机制研究

目的:研究骨髓间充质干细胞(BMSC)是否对白血病的多药耐药有促进作用,并研究汉防己甲素(TET)对BMSC介导的多药耐药(MDR)的影响及其作用机制。方法:构建人骨髓间充质干细胞与白血病K562细胞株的混合共培养体系和Transwell小室共培养体系,并将细胞进行分组,分别给以柔红霉素(DNR)单药干预、TET与DNR联合干预,然后利用CCK-8法检测各组细胞增殖情况,计算细胞抑制率;利用流式细胞术测定各组上清液中IFN、IL-2、IL-6、IL-10的表达水平;利用RT-q PCR和Western blot分别在m RNA和蛋白水平对K562细胞中STAT3的表达进行验证。结果:与BMSC共培养后,DNR对K562细胞增殖的抑制率明显降低(P<0.05),培养上清液中IL-6的水平和K562细胞中磷酸化的STAT3水平显著增加(P<0.05)。加入TET联合干预后,DNR对K562细胞增殖的抑制率显著增加(P<0.05),IL-6和磷酸化的STAT3水平降低(P<0.05)。结论:BMSC对白血病细胞的耐药有促进作用,TET可能通过抑制IL-6/STAT3通路从而逆转骨髓微环境介导的耐药作用。

片仔癀通过BCL-2及Caspase途径参与急性淋巴白血病耐药细胞株MOLT-4/ADM耐药逆转机制的研究

目的探讨片仔癀对耐阿霉素的急性淋巴细胞白血病细胞株MOLT-4/ADM药物耐受逆转的机制。方法在不同浓度片仔癀作用MOLT-4/ADM细胞48 h后,用MTS法检测MOLT-4/ADM增殖的影响;利用流式细胞术检测MOLT-4/ADM细胞凋亡率;实时荧光PCR检测耐药基因MDR1以及BCL-2 mRNA、Caspase-3/8/9 mRNA表达;蛋白免疫印迹法(western blotting)检测凋亡蛋白BCL-2、Caspase-3/8/9以及多药耐药蛋白(P-gp)表达。结果0.4 mg/ml片仔癀组对MOLT-4/ADM耐阿霉素的IC50逆转倍数为4.02倍。0.2 mg/ml片仔癀组凋亡率为(9.87±0.47)%,0.4 mg/ml片仔癀组凋亡率为(15.17±0.69)%,0.8 mg/ml片仔癀组凋亡率为(20.32±0.87)%,均高于阴性对照组(6.06±0.35)%。随着片仔癀用药浓度的增大,BCL-2 mRNA表达下降,而Caspase-3/8/9 mRNA升高。BCL-2蛋白表达下降,而Caspase-3/9蛋白表达量升高,Caspase-8蛋白相对变化不大。结论片仔癀可以通过BCL-2以及Caspase途径诱导凋亡,增加MOLT-4/ADM对阿霉素的敏感性。

肿瘤干细胞源性的外泌体促进结直肠癌细胞的化疗耐药和侵袭

肿瘤干细胞作为肿瘤组织中一小群具有自我更新和多向分化潜能的细胞,可以启动原发肿瘤并介导治疗耐药、肿瘤复发和转移,但其在细胞间层面如何影响结直肠癌的机制仍尚不清楚。因此,本文探究了肿瘤干细胞及其分泌的外泌体对结直肠癌恶性表型的影响。首先,从结直肠癌肿瘤组织中分离出CD166+CD44+肿瘤干细胞(CSC),通过超速离心法提取肿瘤干细胞源性的外泌体(CSC-exo)和结直肠癌SW480细胞源性的外泌体(S-exo),并进行NTA粒径分析、电镜观察和Western印迹鉴定。将成功分离得到的CSC和CSCexo与结直肠癌SW480细胞共培养,共培养后的细胞通过CCK-8、细胞凋亡实验发现,经过CSC或CSCexo共培养后的SW480细胞凋亡率从20%下降至13%(P<0.01),并且侵袭能力显著增加(P<0.001)。此外,通过动物体内实验发现,S-exo治疗组的肿瘤生长速度比CSCexo治疗组的缓慢,CSCexo抑制了5-FU对结直肠癌肿瘤的药物疗效。PET/CT显像、免疫组化分析以及Western印迹结果显示,CSCexo增强了结直肠癌肿瘤对葡萄糖类似物18F-FDG的摄取和糖酵解酶HK2、PFKFB2、PKM2和LDHA的表达。此外,用siRNA干扰糖酵解酶的表达会阻断CSCexo引起的耐药现象。综上,本研究表明,结直肠癌干细胞传递外泌体影响肿瘤葡萄糖代谢途径,并促进化疗耐药和侵袭能力,揭示了恶性肿瘤微环境的形成和动态变化机制。