基于免疫信息学技术的雏沙门菌多表位疫苗构建

【目的】设计针对雏沙门菌(Salmonella Pullorum)IpaJ蛋白的多表位疫苗(multi-epitope vaccine, MEV),为净化鸡白痢提供新的疫苗。【方法】选用IEDB预测雏沙门菌IpaJ蛋白的T淋巴细胞主要组织相容性复合体Ⅰ(MHCⅠ)类分子结合表位;用NetMHCIIpan 4.0 Server预测T淋巴细胞MHCⅡ类分子结合表位;用IEDB预测B淋巴细胞表位。将各个服务器预测结果筛选出的表位经过VaxiJen v 2.0评估抗原性后,将合格的表位通过柔性linker串联成多表位疫苗。对构建的多表位疫苗进行抗原性、理化性质、N-糖基化位点、二级结构和三级结构预测。使用分子对接评估多表位疫苗与免疫受体的结合能力,使用免疫模拟评估多表位疫苗的免疫效果,最后优化密码子便于克隆表达。【结果】经筛选后,选择4个MHCⅠ、4个MHCⅡ和8个B淋巴细胞表位优势表位构建的多表位疫苗MEV-IpaJ。多表位疫苗MEV-IpaJ的分子质量为28.18 ku,为稳定亲水蛋白,具有良好的抗原性,存在4个潜在的N-糖基化位点,α-螺旋、延长链、β-转角和无规则卷曲分别占20.38%、19.23%、8.08%和52.31%。三级结构Ramachandran作图显示,优势区域中含有残基数占89.9%%,进行细化后优势区域的残基数增加到94.0%,三级结构突出表位作图也证明MEV-IpaJ具有良好的免疫原性。分子对接结果显示,MEV-IpaJ与Toll样受体2(Toll-like receptor 2,TLR2)和TLR4蛋白分子可对接。免疫模拟结果显示,MEV-IpaJ具有较好的免疫应答,能提高部分细胞因子的表达,经密码子优化确保设计的MEV-IpaJ可在大肠杆菌K12表达系统中高效、稳定地表达。【结论】本研究构建的多表位疫苗MEV-IpaJ可有效表达并可能诱导强烈的T细胞和B细胞免疫应答。本研究为雏沙门菌多表位疫苗的设计提供了一种新的方法,为雏沙门菌多表位疫苗的研发提供了理论依据及数据支持。

HPV16 E6、E7多表位DNA疫苗的构建及免疫效果评估

目的构建和评价HPV16 E6、E7多表位DNA疫苗诱导的特异性CTL细胞应答及其对肿瘤生长的干预作用,从而揭示其作为候选HPV治疗性疫苗的潜能。方法首先通过IEDB网站中的MHC I Processing Predictions和MHC I Binding Predictions方法,分别预测人类HLA-A^(*)02:01、HLA-A^(*)11:01、HLA-A^(*)24:02和C57BL/6小鼠H-2b的限制性CTL表位,然后根据评分以及ELISPOT实验筛选出二者共同呈递的CTL表位,并将其构建成多表位DNA疫苗(pVAX1-10P)。从预防性和治疗性二个方面研究pVAX1-10P对小鼠移植TC-1异位癌的免疫干预作用,流式细胞术检测特异性CTL应答。结果获得10条可被人与鼠MHC分子共呈递的CTL表位,ELISPOT结果表明这10条CTL表位均能诱导小鼠淋巴细胞产生特异性免疫应答;由此构建的多表位DNA疫苗pVAX1-10P无论在预防性实验还是治疗性实验中,均能诱导特异性的细胞免疫并抑制肿瘤的生长。结论构建的HPV16 E6、E7多表位DNA疫苗pVAX1-10P能够诱导特异性CTL应答,显著抑制肿瘤生长,有望作为候选HPV治疗性DNA疫苗。

弓形虫多表位PLGA纳米疫苗的研究

构建弓形虫多表位PLGA纳米疫苗并评估其可行性,预测弓形虫TgMIC3蛋白的B、T淋巴细胞优势抗原表位,联合抗原表位SAG1((238-256))、GRA7((20-28))和AS15,构建出新型多表位肽,用生物信息学工具对其理化性质、三级结构和分子对接能力等特征进行分析;原核表达并纯化多表位重组蛋白(multi-epitope protein, MEP),通过Western blot鉴定纯化效果;搭建MEP-PLGA纳米递送体系,对纳米颗粒进行表征。结果表明,多表位肽为亲水性蛋白非过敏原,具有一定抗原性,抗原表位均呈现在蛋白表面,能与MHC分子H-2-Dd稳定结合;可在BL21(DE3)大肠埃希氏菌表达系统中稳定表达,并能被特异性抗体所识别;构建的MEP-PLGA纳米递送体系包封为54.42%,纳米颗粒饱满,大小均一。成功设计并构建出弓形虫多表位PLGA纳米疫苗,为弓形虫新型纳米疫苗的研发奠定了基础。

羊口疮病毒114蛋白的优势抗原表位预测及ORFV多表位疫苗的构建

为了探究羊口疮病毒114蛋白作为羊口疮病毒多表位疫苗靶标的可能性,试验利用在线软件ABCpred预测114蛋白的优势B细胞表位,利用在线软件IEDB的MHC-Ⅰbinding server预测114蛋白的优势细胞毒性T细胞(CTL)表位;利用IEDB的MHC-Ⅱbinding server预测114蛋白的优势辅助性T细胞(HTL)表位;使用柔性短肽接头连接114蛋白的优势B、T细胞抗原表位,构建羊口疮病毒多表位疫苗。结果:羊口疮病毒114蛋白由346个氨基酸组成,包含12个优势B细胞抗原表位,分别位于292~307 aa、264~279 aa、146~161 aa、331~346 aa、113~128 aa、298~313 aa、35~50 aa、324~339 aa、281~296 aa、162~177 aa、315~330 aa、204~219 aa;包含1个优势CTL抗原表位,位于65~73 aa;包含5个优势HTL抗原表位,分别位于69~83 aa、68~82 aa、70~84 aa、48~62 aa、284~298 aa;构建了基于114蛋白的优势抗原表位的羊口疮病毒多表位疫苗。结论:羊口疮病毒114蛋白包含多个优势B细胞和T细胞抗原表位,可作为羊口疮病毒多表位疫苗的候选靶标,具有诱导强烈体液免疫与细胞免疫反应的可能性。

移动式多表位小流量标准装置的研制

南京某区在农村生活污水处理设施全覆盖项目中,安装了数千台的小口径电磁流量计,其中大部分都作为污水计量使用,并要求定期检定或校准。因此,该项目设计了一套移动式多表位小流量标准装置,并进行实验验证。实验证明:该装置可同时开展3台同口径范围不超过DN(10~25)mm的1.0级及以下电磁流量计的检定和校准,且总功率不超过1kW。

HPV16 E5多表位肽免疫原性研究

目的筛选人乳头瘤病毒16型(HPV16)E5蛋白多表位肽段,并评估其诱导小鼠产生特异性体液免疫和细胞免疫的免疫原性反应。方法通过Uniprot获得HPV16 E5蛋白的氨基酸序列,采用EXPASY和SYFPEITHI等软件预测HPV16 E5蛋白的表位,筛选出富含B细胞和CTL表位的氨基酸肽段——HPV16 E5蛋白N端处aa28-46(LIRPLLLSVSTYTSLIILV),进一步用该多表位肽免疫C57BL/6小鼠,评估其诱导产生特异性体液免疫和细胞免疫的反应。结果该肽段可诱导小鼠产生较高水平的特异性IgG抗体,且抗体滴度随着免疫次数增加而升高,同时可诱导小鼠产生特异性的CTL反应,在效靶比为40∶1时,对靶细胞产生显著的特异性杀伤作用。结论HPV16 E5蛋白多表位肽aa28-46(LIRPLLLSVSTYTSLIILV)具有良好的免疫原性,可为基于HPV16 E5蛋白的疫苗研究提供基础。

沙眼衣原体多表位疫苗的构建及其抗感染保护作用

目的 构建沙眼衣原体(Ct)多形态膜蛋白D(PmpD)与衣原体蛋白酶样活性因子(CPAF)多表位疫苗,并通过动物实验评价其抗感染保护作用。方法 利用生物信息学分析PmpD和CPAF的二级结构、抗原性、T细胞表位和B细胞表位;构建基于PmpD和CPAF多表位的重组蛋白RPC、原核表达、纯化RPC蛋白。免疫雌性BABL/c小鼠,ELISA检测小鼠血清IgG、IgG2a/IgG1及脾细胞上清细胞因子水平,CCK-8检测脾细胞增殖;Cm攻毒后,检测生殖道Cm载量以评估多表位融合疫苗RPC的抗感染保护作用。结果 成功构建多表位融合蛋白RPC。与PBS组相比,RPC组IgG抗体水平、IgG2a/IgG1比值、脾细胞刺激指数、γ干扰素、白细胞介素-2水平均明显升高(P<0.05);攻毒后RPC组可加快清除小鼠生殖道衣原体。结论 基于PmpD与CPAF的多表位融合蛋白RPC免疫小鼠,能诱导细胞免疫和体液免疫应答,有效降低衣原体载量,具有一定的抗感染保护作用。

多表位病毒疫苗的研究进展

多表位病毒疫苗是目前病毒疫苗研制的热点,特别是对于易变异或者本身有癌基因的病毒。本文就近年来这方面的研究进展作一综述。

抗禽流感病毒多表位DNA疫苗的构建及其免疫效力研究

多表位DNA疫苗是建立在常规DNA疫苗基础上的一种新型疫苗。它是用表位作免疫原 ,这样就比较容易在一个表达载体上克隆病原体的多个抗原基因中具有免疫活性的部分。本试验以H5N1亚型禽流感病毒的HA和NP基因及其表位为基础构建了 4个重组质粒 :1 pIRES HA(表达全长的HA基因 ) ;2 pIRES tHA(只表达HA基因的主要抗原表位区 ) ;3 pIRES tHA NPep(融合表达HA基因的抗原表位区和NP基因的 3个CTL表位 ) ;4 pIRES tHA NPep IFN γ(用鸡的IFN γ基因取代质粒pIRES tHA NPep中的neo基因 )。分别用这 4个重组质粒和空载体质粒pIRES1neo肌注免疫 30日龄SPF鸡。免疫 3次 ,间隔为 2周 ,每次每只鸡的剂量为 2 0 0 μg。第 3次免疫后两周以高致病性禽流感病毒H5N1强毒攻击 ,免疫及攻毒前后均采血检测HI抗体效价和外周血CD4 + 、CD8+ T细胞的变化。结果发现 ,攻毒前各质粒免疫组均检测不到HI抗体 ,攻毒后 1周存活鸡HI抗体效价迅速升高到 6 4～ 2 5 6。流式细胞仪检测显示外周血CD4 + 、CD8+ T细胞在疫苗免疫后都有不同程度的升高。空载体质粒对照组鸡 (10只 )在攻毒后 3～ 8d内全部死亡 ,其他各重组质粒免疫组鸡都获得了部分保护 ,保护率分别是 :pIRES HA组为 5 4 5 % (6 11) ,pIRES tHA组为 30 % (3 10 ) ,pIRES

小鼠及家兔对丙型肝炎病毒多表位DNA疫苗免疫应答的研究

目的探讨ＨＣＶ复合多表位ＤＮＡ疫苗的可行性。方法把ＨＣＶ多表位抗原基因ＰＣＸ克隆到真核表达载体ｐＲＥＰ９（ＲＳＶ启动子）及ｐＣＤＮＡ３（ＣＭＶ启动子）中，构建真核表达载体ｐＲＥＰ９／ＰＣＸ及ｐｃＤＮＡ３／ＰＣＸ。将其肌肉注射免疫小鼠及家兔，检测特异性体液免疫和细胞免疫的水平，并观察免疫小鼠的安全性。结果质粒ｐＲＥＰ９／ＰＣＸ及ｐｃＤＮＡ３／ＰＣＸ于免疫后第 ６ｗｋ和第 １０ ｗｋ时，开始可检测到抗 ＧＺ－ＰＣＸ ＩｇＧ，随后抗体滴度逐渐升高，但水平较低，持续时间较短。ｐｃＤＮＡ３／ＰＣＸ肌肉注射免疫家兔后，于第８ｗｋ开始出现特异性抗体，至 ３个月后滴度升至 １： ３ ２００，随后也开始下降。免疫小鼠及家兔可诱发针对ＧＺ－ＰＣＸ融合蛋白的迟发型超敏反应，并刺激淋巴细胞转化。免疫后小鼠的体重正常，肝脾脏未见明显肿大，具有良好的安全性。结论ＨＣＶ多表位基因可诱发特异性免疫应答且安全性好，为ＨＣＶ疫苗的研究提供了一定的理论及实验依据。

口蹄疫病毒复合多表位DNA疫苗的设计及构建

目的构建口蹄疫病毒(FMDV)复合多表位基因工程疫苗表达盒OAAT及其DNA疫苗。方法以O型、A型FMDV结构蛋白VP1全基因和Asia1型FMDV两个基因拓扑型的结构蛋白VP1基因上的5个抗原表位基因作为主要免疫原基因,非结构蛋白3ABC上的2个Th2细胞表位基因及结构蛋白VP4上的1个Th2细胞表位基因作为辅助基因,构建表达盒。将构建好的表达盒OAAT克隆到真核表达载体pVAX1 PCMV启动子下游,构建三价口蹄疫核酸疫苗pVAX1-OAAT,并用Western blot和IFA方法检测目的蛋白在HeLa细胞中的表达。结果通过InsightⅡ软件同源建模和DNAStar5.0软件分析表明,所构建的FMDV复合多表位基因工程疫苗表达盒OAAT理论上符合设计要求,且在真核细胞获得了正确表达。结论已成功设计FMDV复合多表位基因工程疫苗表达盒OAAT,并构建了三价口蹄疫核酸疫苗pVAX1-OAAT。

弓形虫多表位基因植物表达载体的构建

目的 构建弓形虫多表位基因(TGMG)植物表达载体。方法①将TGMG亚克隆人pBAC55构建中间载体pB35MG,再将其中E35S/TGMG/NOS3′结构单元亚克隆人pCAMBIA2300构建植物表达载体pC35MG。②将番茄果实特异性启动子E81.1插入pB35MG构建中间载体pB35E1MG,再将其中E35SE81.1/TGMG/NOS3′结构单元亚克隆人pCAMBIA2300构建植物表达载体pC35E1MG。③将番茄果实特异性启动子E82.2插入pB35MG构建中间载体pBE2MG,再将其中E82.2/TGMG/NOS3′结构单元亚克隆人pCAMBIA2300构建植物表达载体pCE2MG。测序鉴定pB35MG、pC35E1MG、pCE2MG中的TGMG序列。④pC35MG、pC35E1MG、pCE2MG转化根癌农杆菌LBA404。结果 重组质粒用酶切鉴定均得到预期片段,pB35MG、pC35E1MG、pCE2MG测序结果正确。结论 成功构建TGMG中间载体pB35MG、pB35E1MG、pBE2MG,以及植物表达载体pC35MG、pC35E1MG、pCE2MG。并将3种植物表达载体导入根癌农杆菌。

利用HCV多表位复合抗原制备高效价抗体

目的利用HCV多表位复合抗原免疫家兔制备高效价抗HCV多克隆抗体,为改进丙型肝炎病毒抗原的诊断试剂盒提供必要条件。方法HCV多表位复合抗原与完全弗氏佐剂混合免疫家兔,获得高效价抗血清,经硫酸铵沉淀及PrintA/G亲和层析纯化。结果已获得效价大于1∶16000的抗HCV多克隆抗血清,经纯化后达电泳纯。该抗体能与HCVNS3、NS5及C抗原特异性结合。结论HCV多表位复合抗原具有较好的免疫原性,可用于改进HCV病毒抗原诊断试剂。

刚地弓形虫多表位抗原基因在转基因番茄中的表达研究

目的获得稳定表达弓形虫多表位抗原基因(Tg-MAG)的转基因番茄植株。方法用植物组成型启动子E35S、番茄果实特异性E82.2启动子以及E35S-E81.1复合式启动子驱动弓形虫Tg-MAG的植物表达载体pC35MG、pCE2MG与pC35E1MG,以农杆菌介导的T-DNA转化法转化番茄子叶和下胚轴;经芽诱导、伸长以及生根的连续性抗性筛选和培育,获得Tg-MAG转基因番茄植株,练苗后移栽花盆中培育至开花、结果。用PCR、RT-PCR、蛋白质印迹(Western blotting)分别对Tg-MAG转基因植株进行DNA、RNA、蛋白水平的鉴定。结果获得的Tg-MAG转基因番茄植株经PCR和RT-PCR鉴定,得到预期360bp的Tg-MAG片段,经Western blotting筛选获得能正确表达预期相对分子质量(Mr)为11900的Tg-MAG重组蛋白,且8株具有免疫反应性,其中有2株于番茄果实中所表达的重组蛋白能与抗弓形虫速殖子主要表面抗原1(SAG1)单克隆抗体K7H3发生强免疫反应。结论获得Tg-MAG转基因番茄株系,在其果实中成功表达具有良好免疫反应性的Tg-MAG重组蛋白。

丙型肝炎病毒多表位基因核酸疫苗的构建及其免疫原性

目的 构建丙型肝炎病毒（HCV）多表位基因的真核表达载体pcDNA3.1（-）-CtEm,用该重组质粒免疫BALB/c小鼠,并检测其免疫原性.方法 用BamHⅠ和Hind Ⅲ双酶切含有HCV C区、E2区模拟表位和NS3～NS5区细胞表位串联基因的原核表达载体pQE30-CtEm,克隆入真核表达载体pcDNA3.1（-）,脂质体瞬时转染CHO细胞,并检测其表达.以100 μg重组质粒免疫BALB/c小鼠,检测其体液免疫和细胞免疫效果.结果 所构建的真核表达载体pcDNA3.1（-）-CtEm在CHO细胞中能获得有效表达.该质粒免疫小鼠后可诱导高水平的抗体,特异性淋巴细胞增殖反应、IFN-γ水平及CTL活性均明显高于空载体和生理盐水对照组.结论 已成功构建HCV多表位基因的真核表达载体pcDNA3.1（-）-CtEm,免疫小鼠后可诱导特异性体液免疫和细胞免疫应答.

弓形虫多表位基因重组抗原在弓形虫免疫检测中的应用

目的评价弓形虫多表位基因重组抗原在弓形虫感染诊断中的效果,探索多表位抗原在弓形虫免疫检测中的应用前景。方法以Ni-NTA Agarose和割胶电渗两步纯化法,获取弓形虫多表位基因的原核表达纯化产物rMAG,以适宜浓度的rMAG包被ELISA微孔板,分别检测弓形虫急性和慢性感染血清,评价试剂盒检测的敏感性和特异性。结果经Ni-NTAAgarose和割胶纯化,得到了纯度为95.86%的弓形虫多表位重组可溶性抗原。以3!g/ml的抗原浓度包被ELISA微孔板,对兔和小鼠的急慢性弓形虫感染血清进行了检测。结果检测小鼠血清141份,其中慢性感染弓形虫小鼠血清117份、正常小鼠血清24份,检测体系的敏感性为88.88%,特异性为91.67%,一致性为89.36%。检测兔血清24份,其中急性感染弓形虫兔血清18份,正常兔血清6份,阳性血清检出率为94.4%,总一致性为91.5%。结论以弓形虫多表位重组抗原构建的ELISA试剂盒既可以检测弓形虫急性感染血清,又可以检测弓形虫慢性感染血清,具有一定的应用前景。

H3、H5、H7、H9亚型流感病毒通用多表位重组鸡痘病毒构建

目的构建表达H3、H5、H7、H9亚型流感病毒通用多表位重组鸡痘病毒活载体疫苗候选株。方法筛选流感病毒主要抗原(HANANPM)优势抗原表位基因,以生物信息学软件优化其排列结构合成流感多表位基因(Epi),以H5、H7HA融合表达基因为骨架,将多表位基因插入构建H7HA-Epi-H5HA阅读盒,定向克隆至鸡痘病毒表达载体pUTA-2复合启动子(ATI-P7.5×20)下游,构建重组鸡痘病毒中间转移载体pUTA-2-H7HA-Epi-H5HA。应用脂质体介导的转染法,将该重组鸡痘病毒中间转移载体与282E4株鸡痘病毒共转染鸡胚成纤维细胞(CEF),经BrdU进行3次加压筛选挑斑纯化后传代,并对重组以鸡痘病毒进行PCR和IFA检测和Western blot分析。结果成功构建了重组鸡痘病毒中间转移载体pUTA-2-H7HA-Epi-H5HA,PCR、IFA和Western blot检测阳性。结论筛选出稳定共表达H5H7HA基因和通用多表位基因的重组鸡痘病毒vUTA2-H7HA-Epi-H5HA株,该重组鸡痘病毒的构建为跨种通用型流感病毒活载体疫苗的研究奠定了物质基础。

乙型肝炎病毒多表位抗原DNA疫苗的免疫原性

目的 :探讨HBV复合多表位DNA疫苗诱导体液及细胞免疫的可行性。方法 :将HBV多表位抗原基因BPT克隆到真核表达载体pcDNA3.1中 ,构建重组真核表达载体pcDNA3.1/BPT。将其通过肌肉注射免疫BALB/c小鼠 ,用间接免疫ELISA法、CTL杀伤功能检测和淋巴细胞增殖试验 ,检测特异性体液免疫和细胞免疫的水平 ,并观察其对免疫小鼠的毒副作用。结果 :用重组质粒pcDNA3.1/BPT免疫BALB/c小鼠后 ,在效靶比为 10 0∶1时 ,可诱导显著地特异性CTL应答 (P <0 .0 5 )。ELISA检测免疫小鼠血清特异性IgG的水平明显升高 (P <0 .0 5 )。在BPT基因原核表达蛋白的刺激下 ,免疫小鼠脾淋巴细胞增殖显著 (P <0 .0 5 )。RT PCR分析表明 ,IL 12mRNA的水平亦明显升高。结论 :HBV多表位基因疫苗可诱发特异性免疫应答 ,为预防。

抗-HCV多表位抗体在检测HCV抗原中的应用

目的 应用丙型肝炎病毒多表位抗体，探索从血浆或血清样品中检测丙型肝炎病毒抗原（HCAg）的可能性，为献血员筛选及临床早期诊断提供检测方法。方法 利用原核系统表达的丙型肝炎病毒（HCV）7个高度保守区基因的多表位复合抗原免疫动物，制备抗-HCV多克隆抗体，采用ELISA双抗体夹心法检测血浆或血清中的HCAg，并与RT-PCR法进行比较。结果 制备的抗-HCV多表位复合抗原多克隆抗体，在用ELISA法检测HCAg中表现出较高的特异性及灵敏性，Cutoff值为0．239，批内CV值为5．60％～6．65％，批间CV值为7．80％。与RT-PCR比较，相关系数为0．816，灵敏度为88．89％，特异度为96．30％，一致性为95．24％，调整一致性为90．82％，阳性预测值为80．00％，阴性预测值为98．11％。HCAg检出率与美国ORTHO公司HCV—C抗原检测试剂盒差异无显著意义（P=0．06）。结论 用HCV多表位复合抗原制备的多克隆抗体，采用ELISA双抗体夹心法检测HCAg，具有灵敏、特异、快速的优点，有望开发成为HCAg诊断试剂盒。

梅毒苍白密螺旋体多表位抗原基因的构建、表达及免疫反应性的鉴定

目的为梅毒检测试剂提供特异性强、灵敏度高的新型多表位重组抗原。方法PCR扩增Tp17和Tp0453基因的优势抗原表位,连接后插入pQE32质粒中构建多表位嵌合重组体pQE32/Tp0453-17,IPTG诱导表达,免疫印迹法检测表达产物的免疫反应性。结果成功构建了多表位嵌合重组质粒pQE32/Tp0453-17,经酶切、测序分析表明,插入的基因片段为Tp0453和Tp17基因,片段长约1180 bp,其测序结果与GenBank上登录序列完全一致;SDS-PAGE分析表达产物发现,融合基因表达的重组蛋白Mr约为52×103,表达产物占全菌总蛋白的19.3%,并且在细胞内主要以包涵体形式存在;用Western印迹法检测显示,该重组蛋白能与梅毒患者的阳性血清反应,具有良好的抗原性。结论成功表达了具有良好免疫反应性的多表位嵌合重组抗原,为新型梅毒快速诊断试剂盒的研究奠定了良好的实验基础。