银染色测定粘虫核多角体病毒多角体基因序列

LsMNPV DNA用EcoRV酶切进行基因组克降,用AcMNPV的部分多角体基因顺序DNA片段作探针,菌落原位杂交法结合测序筛选到分别含LsMNPV部分多角体基因的重组质粒pLsEV1和pLsPH5。用银染色PCR线性扩增双脱氧法测序,发现LsMNPv的完整基因即位于这两个片段上。LsMNPV多角体基因长741bp,编码区碱基同源性与AcMNPV和MbMNPV分别为80.0％和97.0％,氨基酸同源性分别为89.8和97.5％。氨基酸组成中以谷氨酸(Glu)含量最高,谷氨酰胺和色氨酸含量最低。密码子选用以第三个碱基为嘧啶的密码子频率最高。多角体蛋白N端有一类似信号肽结构的26个氨基酸的疏水区。

转座子介导的多角体基因表达及提高病毒粒子的感染效率

现行的杆状病毒表达外源基因的方法是将外源基因取代病毒中的多角体基因,因而得到的重组杆状病毒感染活体时不能经口感染,只能进行针刺注射,效率低且易引起活体感染其他疾病。将家蚕核型多角体病毒(Bombyx mor inucleopolyhedrovirus,BmNPV)中的多角体基因(polyhedrin,poly)及其启动子片段克隆到转座子载体pigA3GFP中,将其与辅助质粒pHA3PIG利用脂质体介导法导入家蚕细胞中,经过多次筛选获得稳定的转基因家蚕细胞。之后先将BmPAK6(含LacZ)及BmGFP(含GFP)重组病毒分别感染转基因细胞,再将得到的重组病毒经口感染5龄家蚕幼虫。结果显示,重组杆状病毒可以经口感染家蚕幼虫。这些研究表明来自于转基因家蚕细胞的poly基因表达产物可以提高重组杆状病毒经口感染家蚕率,为解决杆状病毒表达系统中重组病毒不能经口感染家蚕幼虫的问题提供新思路。

昆虫杆状病毒多角体基因的增强序列及其增强机制的新见解

一般相信,增强子是生物基因表达调控的普遍机制。1983年Cochran等发现昆虫杆状病毒AcNPV基因组中有5个同源序列(hrl—5)。1986年,Guarino等证明,它们有增强功能,其中以hr5活性最强。 1990年,武汉大学病毒及分子生物学系齐义鹏、张生家发现,大尺蠖核型多角体病毒(BsNPV)的多角体蛋白基因(ocu)启动子上游有增强子序列。

斜纹夜蛾NPV多角体基因的克隆和部分测序

本文对ＳＩＮＰＶ基因组作了酶解分析，测得其基因组大小为１４５ｋｂ，并用双酶法确定了ＳＩＮＰＶ基因组的ＨｉｎｄⅢ和ＰｓｔⅠ物理图谱。以含ＡｃＮＰＶ多角体基因的质粒ｐＡＣ－Ⅰ的ＳａｌＩ－Ｃ片段为探针，对ＳＩＮＰＶＤＮＡ酶切片段ｓｏｕｔｈｅｒｎ转印杂交结果，初步判断多角体基因定位于ＰｓｔＩ－Ｂ／Ｃ／Ｄ片段、ＢｇｌⅡ－Ｃ／Ｄ片段、ＢａｍＨＩ－Ｂ／Ｃ片段和ＥｃｏＲＩ－Ａ／Ｂ片段上，且ＳＩＮＰＶ与ＡｃＮＰＶ多角体蛋白基因有６４％的同源性，而以大肠仟菌质粒ｐＵＣ１９为载体对ＳＩＮＰＶ的多角体基因试克隆，得到带有ＢｇｌⅡ－ＰｓｔⅠ双酶切片段的２个克隆子。对这两个杂交阳性克隆子之一的核苷酸序列测定，表明插入片段与ＢｍＮＰＶ多角体基因上游序列亦有一定同源性。

斜纹夜蛾核型多角体病毒多角体基因的克隆

在以５种限制性内切酶对ＳＩＮＰＶ基因组作酶解分析的基础上，以ＡｃＮＰＶ多角体基因的部分编码序列作探针，对其进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交分析，发现ＸｂａⅠ酶切的２．９ｋｂ片段含有全部或部分ＳＩＮＰＶ多角体基因，并将该片段克隆至ｐｕｃ１８载体上。

肌动蛋白抑制了杆状病毒多角体蛋白基因的转录与表达

为进一步研究肌动蛋白在杆状病毒感染晚期的作用,利用Bac-to-Bac系统构建了表达多角体基因、肌动蛋白与绿色荧光蛋白融合基因的重组病毒vAc-ph/70GA,同时构建对照病毒vAc-ph.实验发现,重组病毒vAc-ph/70GA感染Sf9细胞后能持续表达肌动蛋白,但不能形成多角体,vAc-ph则能形成多角体.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)显示,vAc-ph/70GA感染晚期,细胞内没有多角体蛋白的表达;RT-PCR的结果进一步表明多角体基因的转录被抑制.肌动蛋白的表达并没有影响vAc-ph/70GA对细胞的感染力.结果表明,晚期表达的外源肌动蛋白抑制了多角体基因的转录和表达,从而导致多角体不能正常产生.

茶尺蠖核型多角体病毒多角体蛋白基因核苷酸序列及其在Baculoviridae中的地位(英文)

茶尺蠖核型多角体病毒（ＥｏＳＮＰＶ）基因组的ｐｏｌｈ和ｅｇｔ基因区约１４．２ｋｂ的酶切图谱被构建．ｅｇｔ基因位于ｐｏｌｈ基因上游约４．８ｋｂ处，但转录方向与ｐｏｌｈ基因相反．ＥｃｏＲⅤ－Ｌ片段ｐｏｌｈ基因及其旁侧的１１２５核苷酸序列被测定．ｐｏｌｈ基因编码区长７３８核苷酸，可编码２４６氨基酸的多肽．起始密码子ＡＴＧ上游是一个富含ＡＴ（ＡＴ占７１．２％）的启动子区，在－５２核苷酸处有杆状病毒晚期基因启动子转录起始基序ＡＴＡＡＧ．在终止密码子下游２０８核苷酸有一个ｐｏｌｙ（Ａ）信号，ＡＡＴＡＡＡ．但ＥｏＳＮＰＶｐｏｌｈ基因起始密码子ＡＴＧ相邻核苷酸序列为ＧＴＡＡＴＧＴ，其－３是个Ｇ，这与已知的１６种其它杆状病毒ｐｏｌｈ基因－３位置均是Ａ不相同．在分析了ＥｏＳＮＰＶ和ＨａＳＮＰＶ多角体蛋白基因核苷酸序列的基础上，通过ＭＡＬＩＧＮ程序，比较了目前已发表的２６种杆状病毒包涵体蛋白的序列，ＥｏＳＮＰＶ与黄杉毒蛾核型多角体病毒（ＯｐＳＮＰＶ）的同源性为最高，核苷酸序列的同源性为８３．０％，氨基酸序列达９４．７％；与其它２０种鳞翅目ＮＰＶ的同源性也很高，核苷酸序列同源性为７２．６％～８１．９％，氨基酸序列为８３．７％～９３?

SlNPV多角体蛋白基因的序列分析

ＳｌＮＰＶ多角体蛋白基因的开放读码框为７５０ｂｐ，编码２４９个氨基酸的蛋白质，是目前所发现的最长的多角体蛋白基因．ＳｌＮＰＶ多角体蛋白Ｍｒ＝２９２３６，其氨基酸序列与其它核多角体病毒的多角体蛋白氨基酸序列有高度同源性．

文山松毛虫质型多角体病毒(DpwCPV)多角体蛋白基因的cDNA克隆及序列分析

通过对文山松毛虫质型多角体病毒的增殖 ,纯化 ,获得一株单一类型的质型多角体病毒 提纯的病毒粒子经SDS 酚抽提 ,琼脂糖凝胶电泳分离基因组dsRNA ,低熔点琼脂糖电泳法回收纯化编码多角体蛋白的第十片段S10 S10经DMSO变性 ,逆转录合成cDNA第一条链 ,PCR扩增后 ,克隆在PMD18 T载体上 ,克隆片段全长 76 3bp 起始密码AUG位于第 3～ 5位碱基 ,终止密码UGA位于第 74 7～ 74 9位碱基 推测DpwCPV多角体蛋白基因编码一段由 2 4 9个氨基酸组成的多肽 ,分子质量为 2 84 39.4 4× 10 3 与舞毒蛾质型多角体病毒 (LdCPV)多角体蛋白基因比较 ,两者核苷酸序列的同源性为 97% ,它们各自编码的多角体蛋白的氨基酸同源性为 99% ;与家蚕质型多角体病毒(BmCPV)多角体蛋白基因相比较 ,两者核苷酸序列的同源性为 88% ,它们各自编码的多角体蛋白的氨基酸同源性为 97%

马尾松毛虫质型多角体病毒多角体蛋白基因的cDNA克隆及序列分析

通过对马尾松毛虫质型多角体病毒的增殖、纯化 ,获得一株单一类型的质型多角体病毒。提纯的病毒粒子经SDS-酚抽提 ,琼脂糖凝胶电泳分离基因组dsRNDA ,回收纯化第十片段S10。S10经DMSO变性 ,逆转录合成cDNA第一链 ,PCR扩增后 ,克隆在pGEM T载体上。对重组子进行限制性内切酶分析及序列测定 ,结果表明 ,克隆片段全长 76 3bp ,起始密码AUG位于 3～ 5残基 ,终止密码UGA位于 74 7～ 74 9残基。推测DpCPV多角体蛋白基因编码 2 4 8个氨基酸的多肽 ,分子量 2 8kD。和家蚕质型多角体病毒 (BmCPV)多角体蛋白基因相比较 ,核苷酸和编码氨基酸序列同源性分别为 89.3%和 97.6 %。

茶毛虫核型多角体病毒(EpNPV)多角体蛋白基因的定位及克隆

The polyhedrin gene of EpNPV was located on Hin d III E, Xba I B, Eco RI J, Kpn I A, Pst I F, Bam H I G fragments under stringent condition(68℃,in water),by using the DIG labeled Bam H I F fragment of AcMNPV DNA as the probe.In order to sequence the EpNPV polyhedrin gene,the Bam H I G fragment was cloned into pTZ19R vector.Then the fragment was digested by Xba I? Hin d III,and subcloned into pTZ19R.

柞蚕NPV多角体膜蛋白类似基因的克隆和序列分析

为探明柞蚕核型多角体病毒(Anthraea pernyi nucleopolyhedrovirus,ApNPV)基因组信息,从柞蚕尸体中分离纯化ApNPV,提取其基因组DNA,分别建立ApNPV DNA的HindⅢ和SalⅠ酶切片段文库。对插入片段进行测序,经过同源性分析发现,在2．9kb的SalⅠ片段上包含1个多角体膜蛋白类似基因,其读码框编码289个氨基酸,是一个晚期表达基因。氨基酸同源性比较的结果表明,ApNPV的多角体膜蛋白基因与云杉卷叶蛾(Choristioneure fumiferana)NPV的同源性较高,达91．7%,而与家蚕(Bombyx mori)NPV及苜蓿尺蠖(Autographa califorlica)MNPV的同源性较低,分别为65．1%和63．0%。该结果说明ApNPV与CfNPV在进化关系上较近,而与BmNPV和AcNPV在进化关系上较远。比较多种核型多角体病毒的多角体膜蛋白和多角体蛋白的氨基酸序列发现,这两种多角体结构蛋白的同源性具有相似的变化趋势。

甜菜夜蛾核多角体病毒BAC-TO-BAC外源基因表达系统的建立

用直接克隆法将miniF lacZ attTn7 kan片段插入甜菜夜蛾核多角体病毒 (Spodopteraexiguamulticapsidnucleopolyhe drovirus,SeMNPV)美国分离株 (SeUS1)基因组的多角体蛋白基因框内 ,miniF是大肠杆菌F因子复制子 ,携带miniF的重组病毒能够在大肠杆菌中低拷贝稳定复制 ,称为bacmid。由于SeUS1由不同的SeMNPV基因型组成 ,每个bacmid携带了一种病毒基因型 ,所有bacmid构成了SeUS1分离株的BAC文库。REN对 111个bacmid分析表明 ,SeUS1分离株中除了包含具有完整SeMNPV遗传信息的基因型外 ,还包括不同类型的缺失基因型。将具有完整SeMNPV基因组的基因型SeBAC10转染昆虫细胞 ,可产生子代病毒 ,故SeBAC10是一种在真核细胞和原核细胞中均能复制的穿梭质粒。因为SeBAC10中多角体蛋白基因 (Seph)被插入失活 ,将Seph作为报告基因通过位点特异性重组方式插入位于LacZ框内转座子Tn7的附着靶位点attTn7,得到重组SeBAC10 (即SeBAC10ph)转染甜菜夜蛾培养细胞Se3 0 1后 ,细胞出现典型的病理变化 ,核中出现多角体 ,证明SeMNPVBAC TO

野桑蚕NPV与家蚕NPV的外形差异及多角体蛋白基因的研究

通过电子显微镜观察 ,发现从野桑蚕体内分离的核型多角体病毒 (BmmNPV)经空斑筛选 ,其分离株的多角体外形和家蚕核型多角体病毒 (BmNPV)的多角体外形呈现差异。对PCR扩增出的BmmNPV的多角体蛋白基因polh进行克隆、测序 ,并与BmNPV的polh序列比较 ,结果发现BmmNPV的polh在 +2 2、+70 3和 +711的 3个位点的碱基不同 ,使 +7位、+2 99位的Pro变成了Ser,+711位G变成为A ,而没有引起该位点 +2 31位Ala的改变。由Ser和Pro在形成蛋白二级结构的构象常数可以推测 ,BmmNPV的多角体较BmNPV更稳定 ,查明了多角体在外形存在差异的原因是ORF内碱基的差异引起的。

茶毛虫核型多角体病毒ph基因抗体的制备与利用

以茶毛虫核型多角体病毒(EupsNPV)的基因组DNA为模板,PCR扩增出全长为741bp的ph基因编码区片段。将Ep-ph编码区插入pET-28-a,构建了原核表达载体pET-28-a-Ep-ph,转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG诱导下进行了高效的表达。以经表达纯化的目的融合蛋白作为抗原,免疫新西兰大白兔,制备了EupsNPV的ph抗体,测得的抗体效价为6.4×104。Western blotting检测表明制得的抗体对核型多角体病毒有良好的特异性。利用制备的抗体用间接ELISA方法对茶毛虫病毒样品进行了定量分析,得到线性回归方程为y=0.4152x-0.8299,相关系数r=0.9897(P<0.01)。间接ELISA方法表明该抗体可以用于核型多角体病毒生物农药的定量检测,从而为核型多角体病毒的检测农药制剂提供了一种准确有效的方法。

BmMP54基因在家蚕组织的表达模式及与BmNPV多角体蛋白基因的融合表达分析

从家蚕蛹c DNA文库中筛选到一个403 bp的未知功能基因,将其命名为Bm MP54(Gen Bank登录号:DY231399.1)。该基因序列包含312 bp的开放阅读框,编码由103个氨基酸残基组成的蛋白质,生物信息学预测其含有2个跨膜区域,等电点及分子质量分别为9.90和10.463 k D。将Bm MP54与家蚕核型多角体病毒(Bm NPV)的多角体蛋白基因(Polh)融合后分别连接到原核表达载体p GEX-4T-1和家蚕杆状病毒表达系统转移载体p Fast BacTMHTB中构建重组质粒,并分别在大肠埃希菌BL21(DE3)和家蚕卵巢培养细胞(Bm N)中表达。原核表达的融合蛋白通过调节p H值、阴离子交换层析等纯化获得了65 k D的重组融合蛋白Polh-Bm MP54,通过Western blotting可在重组杆状病毒感染的Bm N细胞中检测到42 k D左右的Bm MP54重组蛋白,表明已按设计要求高效表达并纯化获得目的蛋白质。实时荧光定量PCR分析显示Bm MP54在家蚕5龄幼虫的气门和脂肪体组织中表达量最高,在表皮和头部的表达量最低。上述研究结果有利于后续探讨Bm MP54在家蚕生长发育过程中的生物学功能。

家蚕核型多角体病毒orf61基因缺失对病毒复制和各时期基因转录的影响

orf61是杆状病毒晚期表达的核心基因之一。为了研究家蚕核型多角体病毒(Bm NPV)orf61基因的功能,利用Red重组技术与Bac-to-Bac系统分别敲除和异位补回orf61基因,构建了orf61缺失型病毒orf61-ko-Bacmid以及补回型病毒orf61-reBacmid,然后分别转染家蚕培养细胞Bm N,调查orf61基因缺失对Bm NPV复制和不同时期基因转录的影响。检测orf61基因缺失型病毒转染Bm N细胞液上清中的病毒滴度为0,说明orf61基因缺失导致病毒不能形成有感染活性的芽生型病毒粒子(BV);荧光定量PCR分析orf61基因缺失会显著地降低病毒基因组的复制水平,进而导致病毒各个时期基因转录水平极显著下降(P<0.01)。此外,通过体外EMSA试验和构建双荧光素酶报告基因系统,检测ORF61蛋白对多角体蛋白基因polh启动子的调控作用,结果显示该蛋白质是polh基因转录的负调节因子。研究结果有助于深入阐释Bm NPV orf61基因在病毒基因组复制中的作用以及对极晚期表达的多角体蛋白基因polh的转录调控作用。

多角体蛋白基因核苷酸序列对HBsAg(PreS2+S)在家蚕中表达的作用

应用PCR突变的方法 ,在乙肝病毒表面抗原 (HBsAg)前S2序列的 5’端融合了BmNPV多角体蛋白基因5’端的 12个碱基 ,获得了融合乙肝表面抗原中蛋白基因 (HBMp) ;通过同源重组将其插入到BmNPV基因组多角体启动子后 ,构建了重组杆状病毒BmPAK HBMp。用重组病毒BmPAK HBMp和BmPAK HBM(带有非融合乙肝表面抗原中蛋白基因 )感染家蚕细胞及蛹 ,对两种病毒的表达产物用ELISA进行了跟踪检测 ,结果表明融合蛋白比非融合蛋白HBsAg活性提高了 6 0 %～ 80 % ,作为HBsAg构成部分的PreS2抗原性提高了 8～ 10倍 ;并且HBsAg和PreS2 Ag表达的时相曲线不同 ,PreS2 Ag的表达量比HBsAg早 1～ 2d达到最大值。ELISA检测和Westernblotting分析表明 ,多角体基因序列的存在更有利于中蛋白全基因 (PreS2 +S)的表达。

马尾松毛虫质型多角体病毒多角体蛋白基因的表达与定位

为了表达马尾松毛虫质型多角体病毒(DpCPV)多角体蛋白基因(S10片段)并探讨多角体蛋白在真核细胞中的定位,从DpCPV中分离出S10,与pET-28a载体连接成重组表达质粒pET28-S10;将S10克隆到杆状病毒转座载体pFASTBACHTb中,依次筛选出重组转座质粒pFASTBACS10,重组穿梭质粒BacmidS10,重组杆状病毒AcS10。多角体蛋白基因表达后,用SDS-PAGE、Western-blot和免疫荧光技术对表达产物进行了检测。结果表明:S10原核表达质粒、重组杆状病毒成功获得;在昆虫细胞中表达的质型多角体蛋白主要定位于细胞质,同时有少量产物定位于细胞核。