一株草地贪夜蛾核型多角体病毒新分离物的室内毒力测定与基因组分析

草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda是我国重要的入侵农业害虫。草地贪夜蛾核型多角体病毒是专一性感染草地贪夜蛾的病原。本研究于江西省南昌市玉米田分离得到一株多粒包埋型草地贪夜蛾核型多角体病毒分离物,命名为草地贪夜蛾核型多角体病毒江西分离物(SfMNPV_JX),其对本地草地贪夜蛾幼虫毒力高,LC 50达到1.634×105 PIB/mL。全基因组测序表明,SfMNPV_JX基因组全长134241 bp,共包含140个ORF,系统发育分析显示,SfMNPV_JX属于α-杆状病毒GroupⅡ,是SfMNPV的一个分离物,与草地贪夜蛾核型多角体病毒哥伦比亚分离物(SfMNPV_Colombian)最为近似,序列相似性为97.85%。上述研究结果为研发绿色高效的草地贪夜蛾生物杀虫剂提供重要依据。

甜菜夜蛾核型多角体病毒颗粒剂制备及其抗逆性能评价

甜菜夜蛾核型多角体病毒(SeNPV)具有专一性和高效性,可以有效控制甜菜夜蛾种群,而且对环境和生态安全。为了提高甜菜夜蛾核型多角体病毒的稳定性,以海藻酸钠为包埋材料,通过优化载体用量和进料速率等条件,采用喷雾法制备了病毒颗粒剂,并对其相关性能进行了表征和评价。结果表明:海藻酸钠质量浓度为1%,进料速率为13mL/min时制备的病毒颗粒剂呈不规则形状,颗粒剂产率79.4%,病毒含量1.0×10^(6)PIB/g,D_(50)在130μm左右。经颗粒剂海藻酸钠包埋的甜菜夜蛾核型多角体病毒具有良好的热稳定性和抗紫外性能,同时不会影响其对甜菜夜蛾幼虫的致病力。

落叶松尺蛾核型多角体病毒形态特征及分子检测技术建立

【目的】落叶松尺蛾核型多角体病毒(Erannis ankeraria nucleopolyhedrovirus,EranNPV)是有效调控落叶松尺蛾种群数量和质量的重要生物因子,明确EranNPV超微形态学结构,研究并建立其精准灵敏的分子(PCR)快速检测技术,有助于深入探究该病毒的传播机制和林间流行规律,从而为利用该病毒持续控制落叶松尺蛾提供技术支撑。【方法】利用扫描电镜和透射电镜对EranNPV多角体的外部形态和内部结构特征进行观察;根据EranNPV的ac54基因设计用于PCR检测的特异性引物EaV,通过多种昆虫病毒的PCR扩增结果验证引物特异性,测试该PCR检测技术体系对EranNPV基因组DNA和病毒悬浮液的灵敏性。【结果】电镜观察结果表明,该病毒多角体多为表面光滑的不规则多面体,少数多角体表面散布孔洞凹陷,平均直径为1.43±0.20μm,多角体内的病毒粒子呈单束分布,平均长度为219.14±17.50 nm;以EaV为引物,只有EranNPV能够扩增到目的条带,利用EaV为引物建立的PCR检测技术对EranNPV基因组DNA的检测灵敏度可达10 fg/mL,对EranNPV悬浮液的检测灵敏度可达1×102 OBs/mL。【结论】EranNPV为典型的单粒包埋型核型多角体病毒,利用EaV引物建立的PCR检测技术具有高度的特异性和灵敏度,有望进一步应用于EranNPV的林间传播和流行病学研究当中。

草地贪夜蛾核型多角体病毒Hub1的稳定性及对草地贪夜蛾的田间防治效果

草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda是一种破坏性极强的害虫,严重威胁粮食安全。草地贪夜蛾核型多角体病毒Hub1 (S. frugiperda nuclear polyhedrosis virus Hub1,SpfrNPV Hub1)是首个专一性针对草地贪夜蛾的病毒杀虫剂,具有较好的应用前景。本研究采用药膜法评价不同温度、pH值、光照条件等处理对SpfrNPV Hub1活性及稳定性的影响,并开展了20亿病毒包涵体(polyhedral inclusion body,PIB)/mL SpfrNPV Hub1悬浮剂防治草地贪夜蛾田间药效试验。稳定性测定结果表明:SpfrNPV Hub1在pH 4和pH 7,4℃及25℃条件下稳定,在pH9条件下较不稳定,在54℃高温及4000 lx强光照射条件下不稳定。田间药效试验结果显示:20亿PIB/mL SpfrNPV Hub1悬浮剂对草地贪夜蛾有较好的防治效果,制剂用量为1500~1875mL/hm^(2)时,药后7 d和14 d的防效分别达81.18%~82.57%和81.23%~83.06%,持效期长。本研究明确了不同温度、pH值、光照条件对SpfrNPV Hub1活性及稳定性的影响,为指导应用SpfrNPV Hub1防治草地贪夜蛾提供了重要技术支撑。

灰茶尺蠖核型多角体病毒对两种尺蠖的致病性

灰茶尺蠖核型多角体病毒(Ectropis grisescens Nucleopolyhedrovirus,EgNPV)是灰茶尺蠖幼虫的重要病原微生物。为明确其对茶树重要害虫尺蠖类的两个近缘种灰茶尺蠖Ectropis grisescens Warren和茶尺蠖E.obliqua Prout的致病性,进行了一系列的生物测定。结果表明,EgNPV对2龄灰茶尺蠖和茶尺蠖幼虫的剂量对数-死亡机率值回归方程和LC50分别为y=0.943x+0.3582,LC50=8.3×10^(4) PIB/mL;y=0.663x+1.614,LC50=1.3×10^(5) PIB/mL。当使用不同浓度EgNPV处理不同龄期灰茶尺蠖和茶尺蠖幼虫时发现,两种幼虫致死率趋势大致相同;在虫龄一致时,达到相同的致病率,灰茶尺蠖所需的时间比茶尺蠖平均短一天。使用2×106 PIB/mL浓度处理不同代别灰茶尺蠖和茶尺蠖2龄幼虫,在第1、2和第6代,EgNPV对两种幼虫的致死率均大于80%。上述结果表明灰茶尺蠖核型多角体病毒对灰茶尺蠖、茶尺蠖的幼虫都比较敏感,具有致死能力。这为灰茶尺蠖核型多角体病毒的合理应用提供理论基础。

斜纹夜蛾成虫带核型多角体病毒的巢式PCR检测

旨在建立一种快速、可靠的斜纹夜蛾成虫带核型多角体病毒(Spodoptera litura Nucleopolyhedrovirus,SpltNPV)的分子检测方法,以克服目前常规PCR技术很难检测到斜纹夜蛾成虫带病毒的缺陷。以SpltNPV的蜕皮甾体尿苷二磷酸葡萄糖转移酶(ecdysteroid UDP-glucosyltransferase,egt)基因为检测对象,基于该基因序列设计了巢式PCR引物,其中一对外侧引物egt-F/R和一对内侧引物egt1-F/R,并研究斜纹夜蛾成虫带毒的巢式PCR检测可靠性。结果表明:基于egt基因的巢式PCR方法可以特异性扩增SpltNPV的DNA,引物egt-F/R的扩增检测最低限为10-7μg/μL;且基于引物egt-F/R的两轮普通PCR无法检测出成虫带毒,而采用巢式PCR方法可有效扩增出目的egt片段,巢式PCR检测方法的灵敏度比两轮普通PCR检测方法提高2个数量级。因此,本研究成功建立了基于SpltNPV的egt基因的巢式PCR检测技术,该方法为斜纹夜蛾成虫带毒、传毒等流行病学研究提供了可靠的技术支撑。

家蚕Gloverin 2克隆、高效表达及其抗核型多角体病毒感染作用研究

为获得家蚕抗菌肽葛佬素2(BmGloverin 2),并研究其在家蚕抗核型多角体病毒(BmNPV)感染过程中的作用,以经BmNPV诱导的3龄3日家蚕中肠cDNA为模板,根据GenBank上BmGloverin 2基因序列设计特异性引物,克隆出去除信号肽部分(1—18 aa)的BmGloverin 2基因,与表达载体pET-28a(+)连接构建pET28a(+)-BmGloverin 2,对含有pET28a(+)-BmGloverin 2重组质粒的菌株诱导表达,然后对抗菌肽重组蛋白进行Ni-IDA亲和层析、透析及浓缩过滤以获得高浓度目的蛋白;并采用抑菌试验检测BmGloverin 2重组蛋白生物活性;最后,将具有生物活性的BmGloverin 2重组蛋白和BmNPV混合处理4 h后喂食家蚕,并以直接喂食BmNPV和无菌水处理为对照组,以检测BmGloverin 2对BmNPV感染家蚕的影响。结果显示,成功克隆BmGloverin 2基因,并构建重组pET28a(+)-BmGloverin 2;在37℃、0.5 mmol/L IPTG条件下诱导表达可获得大量BmGloverin 2重组蛋白,经SDS-PAGE检测其分子质量为19.1 ku,与预期大小相符,经过纯化浓缩最终获得BmGloverin 2重组蛋白;抑菌试验证明,重组BmGloverin 2蛋白具有生物活性;与BmNPV对照组相比,饲喂重组BmGloverin 2蛋白与BmNPV混合液处理组幼虫存活率提高。可见,BmGloverin 2在家蚕抵抗BmNPV侵染中发挥作用。

中红侧沟茧蜂对棉铃虫核型多角体病毒的传播作用

中红侧沟茧蜂Microplitis mediator与核型多角体病毒(nucleopolyhedrovirus, NPV)是棉铃虫Helicoverpa armigera的两种重要生物防治因子。中红侧沟茧蜂传播NPV对于利用二者协同防治棉铃虫具有重要意义。本研究探讨了给中红侧沟茧蜂饲喂含病毒蜂蜜水、体表喷洒病毒液、中红侧沟茧蜂在染毒宿主体内产卵、从染毒宿主体内发育、蜂茧浸泡病毒5种带毒方式的传播病毒效率,以及饲喂带病毒蜂蜜水方式下的传播机制。结果表明,饲喂带病毒蜂蜜水和体表喷洒病毒时中红侧沟茧蜂传毒率较高,在连续传毒的3 d内传毒效率分别为15.1%、9.1%~9.3%、2.4%~4%,其他3种方式传毒效率较低。在田间防治时可以利用中红侧沟茧蜂的传毒作用采用病毒与寄生峰的协同防控策略。

家蚕核型多角体病毒lef-8基因克隆及系统进化分析

【目的】了解云南省德宏州陇川县蚕区家蚕核型多角体病毒(BmNPV)株系的遗传地位和多样性,为厘清云南蚕区BmNPV的起源及科学防控家蚕血液型脓病提供参考依据。【方法】对分离自云南省德宏州陇川县蚕区的BmNPV进行lef-8基因克隆,通过ExPASy、SignalP 5.0、TMHMM 2.0、NetOGlyc 4.0、NetPhos 2.0及SWISS-MODEL等在线软件进行生物信息学分析,并基于lef-8基因核苷酸序列相似性,采用MEGA7.0中的邻接法(NJ)构建系统发育进化树。【结果】云南省德宏州陇川县蚕区BmNPV-YNLC株的lef-8基因序列全长2631 bp,共编码876个氨基酸残基;其编码蛋白(LEF-8)无信号肽序列,也不存在跨膜结构域,蛋白分子量为101.63 kD,理论等电点(pI)为8.8;在第750~800位氨基酸残基区域具有较高的疏水性,部分氨基酸位点表现为亲水性,且具有较高抗原指数和表面可及性;存在6个潜在的N-糖基化位点,62个磷酸化位点(25个丝氨酸磷酸化位点,23个苏氨酸酸化位点,14个酪氨酸磷酸化位点),但不存在O-糖基化位点。BmNPV-YNLC株与BmNPV-T3株的lef-8基因核苷酸序列相似性为99.7%,BmNPV-YNLC株lef-8基因在第96~98位核苷酸序列上存在3个碱基(CAA)缺失;此外,还存在2个非同义突变(^(646)T→A和^(1895)C→G)和7个同义突变。基于lef-8基因核苷酸序列相似性构建的系统发育进化树显示,BmNPV-YNLC株与日本和韩国地区的BmNPV亲缘关系较近,而与我国流行的BmNPV遗传关系较远。【结论】lef-8基因在不同地区来源的BmNPV株系中高度保守,BmNPV-YNLC株与日本和韩国地区的BmNPV亲缘关系较近,但其LEF-8蛋白N端存在氨基酸缺失突变,说明BmNPVYNLC株为云南蚕区的新流行株系。

木毒蛾核型多角体病毒的PCR快速检测技术

【目的】木毒蛾是福建沿海地区防护林树种木麻黄的主要害虫之一,具有成为国际危险性有害生物的潜在可能性。木毒蛾核型多角体病毒(Lymantria xylina multiple nucleopolyhedrovirus,LyxyMNPV)是高效控制木毒蛾的优良天敌资源,具有高度安全性。建立LyxyMNPV的PCR快速检测技术,有利于该虫防治技术及木毒蛾核型多角体病毒的进一步研究。【方法】根据LyxyMNPV基因组中的特有基因gp131设计特异性引物,利用PCR法扩增该目的基因片段并测序检验,建立LyxyMNPV的分子快速检测技术体系。【结果】以GAL为引物的PCR检测技术对LyxyMNPV基因组的灵敏度可达1 fg·mL^(-1),对多角体悬液浓度检测最低量可达5.0 PIB·mL^(-1),可明确区分LyxyMNPV和其他7种昆虫核型多角体病毒。该体系同时适用于感病木毒蛾的不同虫态(卵、幼虫、蛹和成虫)的检测,以及环境样本(包括土壤、树枝和寄生蜂)的检测。【结论】成功建立了具有高度特异性、灵敏性的LyxyMNPV分子快速检测技术,为LyxyMNPV的快速检测提供分子生物学证据。

10亿PIB/mL斜纹夜蛾核型多角体病毒悬浮剂防治玉米草地贪夜蛾田间药效评价

为做到有效防控保山地区草地贪夜蛾的发生危害,同时又做到化学农药使用减量的目的,选用生物农药10亿PIB/mL斜纹夜蛾核型多角体病毒悬浮剂防治玉米草地贪夜蛾,明确不同剂量斜纹夜蛾核型多角体病毒悬浮剂对玉米安全性、对草地贪夜防效及持效期。本文开展了10亿PIB/mL斜纹夜蛾核型多角体病毒悬浮剂防治玉米草地贪夜蛾田间小区药效试验。结果表明,斜纹夜蛾核型多角体病毒悬浮剂对玉米安全、对草地贪夜蛾具有较好的防治效果,随着每公顷用量的增加,防效和持效期增加,较为突出的是斜纹夜蛾核型多角体病毒悬浮剂450倍液、600倍液,药后1 d防效分别为95.11%、94.04%,药后14 d防效分别为71.09%、63.13%,玉米受损率控制在22.49%以下,药效持续期在14 d。

东台市富安镇综合防控家蚕核型多角体病的做法与体会

本文通过对家蚕核型多角体病高发原因进行调查与分析,阐述了东台市富安镇针对该病防控所采取的综合应对措施,旨在预防家蚕病毒病的发生,提升蚕茧产量和蚕茧质量,提高经济效益。

4种核型多角体病毒对玉米草地贪夜蛾的防效试验

为比较4种核型多角体病毒对富民县玉米草地贪夜蛾的防效,选用苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒、甘蓝夜蛾核型多角体病毒、斜纹夜蛾核型多角体病毒和甜菜夜蛾核型多角体病毒进行田间药效试验。结果显示,10亿PIB·mL^(-1)斜纹夜蛾核型多角体病毒悬浮剂按照2250 mL·hm^(-2)的施用量,药后3 d、7 d、10 d对玉米草地贪夜蛾的相对防效分别达64.13%、76.66%、86.54%,显著高于另外3种核型多角体病毒的相对防效。4种核型多角体病毒中,10亿PIB·mL^(-1)斜纹夜蛾核型多角体病毒悬浮剂最适宜富民县草地贪夜蛾生物防控,但核型多角体病毒对玉米草地贪夜蛾的速效性较差,在草地贪夜蛾大量危害时,需与速效性高的高效低毒化学药剂搭配施用或交替施用,迅速降低草地贪夜蛾危害的同时减少化学农药用量。

不同来源家蚕核型多角体病毒的致病力及其vp 39基因的遗传进化分析

家蚕核型多角体病毒(BmNPV)是养蚕生产中的主要病原微生物之一。收集广西壮族自治区9个蚕区的BmNPV分离株,纯化后分别给家蚕品种两广二号的2龄起蚕添食感染,调查9个BmNPV分离株对2龄起蚕的LC_(50)在1.55×10^(6)~4.19×10^(6)mL^(-1)之间,各分离株间的致病力差异不显著。选择BmNPV的感染相关基因vp 39设计合成序列引物进行PCR,对各分离株的扩增产物测序并进行遗传进化分析,结果表明不同来源分离株的vp 39基因在进化树上归于一个分支上的几个层次分支,序列间的相似度大部分>98%,相互间的遗传距离也较小,部分<1.0,提示vp 39基因相对比较保守。研究结果为解析家蚕抗病毒机制提供了一些新的参考信息。

家蚕保存种对核型多角体病的抗性

家蚕对核型多角体(NPV)病的抵抗性,鲇泽千寻、荒武义信分别采用皮下和经口感染试验,认为家蚕对NPV病抵抗性,因品种有很大差异。我国学者吕鸿声首先对NPV病品种抵抗性差异作了研究,张远能对33个品种进行了抗NPV病鉴定,发现了抗性品种与感性品种差异近千倍。本试验在前人研究的基础上对本所保存的品种进行抗NPV病鉴定,力图挖掘抗病基因或直接筛选出抗病品种,并对不同地理品种间、化性进行了分类分析。现简报如下。

柞蚕核型多角体病毒研究进展

柞蚕核型多角体病毒(AntheraeapernyiNuclearPolyhedrosisVirus,简称ApNPV) ,属杆状病毒科包含体杆状病毒亚科核型多角体病毒属 ,是柞蚕核型多角体病的病原。该成熟病毒包含体的断面分三层结构 :最外层是致密层 ,次外层是多角体蛋白层 ,内部是病毒束。柞蚕核型多角体病毒的核酸为DNA ,经限制性内切酶PstⅠ,HindⅢ,BamHⅠ,XhoⅠ,SalⅠ,EcoRⅠ和EcoRⅠ +BamHⅠ酶解后 ,电泳分别形成31,25,6,15,24,5,7条谱带。柞蚕核型多角体病毒主要通过食下和体壁创伤途径感染柞蚕幼虫 ,不同病毒株对柞蚕的致病性存在着差异。柞蚕幼虫消化液对柞蚕核型多角体病毒有溶解、灭活作用 ;柞蚕幼虫中肠围食膜对柞蚕核型多角体病毒有灭活作用。柞蚕核型多角体病毒多角体在自然条件下有自然裂解现象 ,游离的病毒粒子在自然条件下很快失活。目前已建立柞蚕核型多角体病毒载体表达系统 ,并在分别在体内。

耐家蚕核型多角体病毒病蚕品种“华康2号”的育成

以对家蚕核型多角体病毒(BmNPV)侵染具有较强耐受力,且综合经济性状优良为家蚕新品种选育目标,选择我国蚕区推广量较大的家蚕品种秋丰和白玉作为受体,用BmNPV耐受性基因载体品种N作供体,采用杂交技术将耐病基因导入受体品种,再用受体品种秋丰和白玉分别作回交亲本连续进行4次回交,纯合固定耐病基因,通过系统选育提高、稳定回交后代的综合经济性状,育成对家蚕核型多角体病毒病具有较强耐受性的新品种秋丰N×白玉N(定名为华康2号)。BmNPV对新品种的LC50为2.033×109个/mL,是原系统秋丰×白玉LC50值的12 115倍,新品种的耐病力显著增强。新品种的发育经过及丝质、茧质等主要经济性状与原系统相仿,万头收茧量、万头产丝量分别提高5.5%和9.6%,解舒丝长增加60 m,洁净提高1.1分,达到实用化的水平。

美国白蛾核型多角体病毒传播途径及对寄主的持续作用

用不同浓度的美国白蛾核型多角体病毒亚致死剂量感染美国白蛾4龄和5龄幼虫,并分别收集不同处理的残余带毒试虫进行室内传代饲养。结果表明:病毒对寄主昆虫不仅具有直接致死作用,而且对蛹重和雌虫产卵量均有明显影响,尤其是对亲代、子一代和子二代寄主昆虫。对病毒传播途径的研究证实HcNPV可通过多种途径传播到寄主种群中。

日本三株斜纹夜蛾核型多角体病毒的增殖特性及其多角体蛋白基因的序列分析

利用斜纹夜蛾Spodopteralitura培养细胞 ,对近年来在日本本州、九州和四国等地发现并筛选出的对斜纹夜蛾幼虫具有强烈杀虫活性的 3株斜纹夜蛾核型多角体病毒 (SpltMNPV) (K 3、G1 2和G10 3)进行了生物学活性和分子生物学的初步研究 ,克隆了多角体蛋白基因 ,并进行了序列分析和比较。结果表明 :(1)SpltMNPV日本分离株K 3、G1 2和G10 3分别具有不同的特征性酶切图谱 ,分别属于 3种基因型 (A型、B型和C型 ) ;(2 ) 3个分离株的芽生型病毒 (buddedvirus)产生能力和多角体产生能力有差异 ,免疫印迹分析表明 ,多角体蛋白的分子量也不同 ;(3)日本株SpltMNPV核型多角体蛋白结构基因由 74 7个核苷酸编码序列 (编码 2 4 9个氨基酸 )组成 ,其序列与中国株SpltMNPV的同源性为 98 9% ,与其他 6种核型多角体病毒有较高的同源性 (6 1 7%～ 74 2 % ) ,但其 5′端侧翼序列 (nt_1～_10 0 )与AcMNPV和BmNPV相比差异显著 ,在对该基因表达调控起决定性作用的 8个高度保守核苷酸序列中 (nt_4 4～_5 1)有 2处发生自然突变。

家蚕对核型多角体病的抗性及遗传规律的研究

试验研究了家蚕对ＮＰＶ病的抵抗性及其遗传规律，结果表明：家蚕品种间存在抗性差异，幼虫期的攻毒发病率与全龄虫蛹率成极显著的负相关，抗性对感性呈不完全显性，是由两对以上基因控制的，至少有一对为主效基因，再一次证明有偏父遗传现象，其狭义遗传力为３６．１％。