大肠杆菌多酚氧化酶的分子克隆及异源高效表达

菜籽粕、棉籽粕等非粮饲料资源存在的酚类化合物芥子碱、棉酚等抗营养因子,严重影响了其饲喂价值。本课题组筛选出的一株大肠杆菌属芥子碱降解菌SDB2已被证实能通过分泌多酚氧化酶来降解芥子碱和棉酚,本试验旨在运用基因工程技术克隆SDB2多酚氧化酶基因,实现其高效表达,为SDB2多酚氧化酶在饲料工业上的规模化应用奠定基础。从大肠杆菌SDB2中克隆出多酚氧化酶基因,将其与质粒pET28a连接后转化至大肠杆菌BL21感受态细胞中培养,通过PCR鉴定及质粒酶切验证方法构建重组菌株,同时对重组克隆基因进行生物信息学分析。采用“2×2”交叉试验设计,以温度和诱导剂IPTG浓度两个影响因素诱导SDB2多酚氧化酶基因在重组菌株中高效表达,经SDS-PAGE和WB双重验证后,确立最佳诱导条件,最终纯化出目标酶蛋白。结果表明:(1)成功克隆SDB2多酚氧化酶基因,构建出异源表达重组菌株。(2)克隆出的SDB2重组多酚氧化酶基因含目标核苷酸741个,总编码氨基酸263个(含标签氨基酸20个),氨基酸组成的蛋白相对分子质量为28499.0,理论等电点为6.94,据此预测出SDB2重组多酚氧化酶三维结构模型。(3)确立SDB2多酚氧化酶异源高效表达的最佳诱导条件为温度37℃,IPTG浓度1 mmol,该条件下表达出大量可溶性酶蛋白,有利于工业化生产。本试验条件下,大肠杆菌SDB2多酚氧化酶成功实现了分子克隆及异源高效表达,为我国非粮饲料资源实现高效利用提供了技术参考。

灰霉病早期胁迫下花椰菜多酚氧化酶活性的高光谱研究

利用高光谱技术实现灰霉病早期胁迫下花椰菜多酚氧化酶(PPO)活性的快速无损检测。为了使预测效果更好,在900~1700 nm光谱范围内采集253个健康花椰菜样本及257个染病花椰菜样本的光谱信息,并使用分光光度计法对样本中多酚氧化酶活性进行测定。对健康及染病花椰菜样本PPO活性均值进行分析,发现健康花椰菜PPO活性均值(10.257 U·g^(-1))小于染病花椰菜PPO活性均值(12.324 U·g^(-1))。利用光谱-理化值共生距离(SPXY)算法对样本进行校正集(健康样本193个,染病样本197个)和预测集(健康样本60个,染病样本60个)的划分,对划分后的样本集进行六种单一预处理(卷积平滑算法SG、去趋势算法DT、中值滤波MF、归一化处理NOR、标准正态变量变换SNV、基线校正Baseline)。利用相关系数(R)和均方根误差(RMSE)作为模型评价指标,发现预处理能够有效提高模型的精度和稳定性,其中健康样本经NOR预处理后的预测集建模效果最好;染病样本经DT预处理后的预测集建模效果最好。采用连续投影算法(SPA)与回归系数法(RC)提取特征波长,建立PPO活性值的偏最小二乘回归(PLSR)、最小二乘支持向量机(LS-SVM)及BP神经网络三种预测模型,探究不同特征波长提取方法对模型精度的影响,比较不同建模方式对花椰菜PPO活性预测的准确度。结果说明提取特征波长可以优化光谱信息,SPA和RC对两种样本提取的波长个数分别为9,12,7和11,其中SPA优化后的光谱数据对健康样本PPO活性预测效果较好,RC优化后的光谱数据对染病样本PPO活性预测效果较好。对比分析模型效果,发现LS-SVM模型对两种样本和其对应的酶活性产生了很好的拟合效果。最终发现,SPA-LS-SVM模型对于健康花椰菜PPO活性预测效果较好,其预测相关系数(Rp)为0.832,预测均方根误差(RMSEP)为1.676;RC-LS-SVM模型对于染病花椰菜PPO活性预测效果较好,其Rp为0.848,RMSEP为1.156。研究结果表明高光谱技术可以实现灰霉病早期胁迫下花椰菜多酚氧化酶活性的测定,为快速检测花椰菜多酚氧化酶活性及便携式仪器开发提供了科学依据。

酚氧化酶处理对白肋烟化学成分和烟叶品质的影响

为探索酚氧化酶处理在提升白肋烟烟叶品质方面的可行性,以未经醇化的湖北恩施白肋烟片烟为研究材料,将酚氧化酶施用于烟叶表面,研究了其在不同温度、酶液施加量及处理时间下对白肋烟烟叶内在化学组分及品质的影响。结果表明,酚氧化酶能够促进白肋烟中多种化学组分的改变,包括降低烟叶中特有亚硝胺(TSNAs)类和酚类物质含量,并促进酯类物质的积累。此外,酚氧化酶对烟叶中总糖及还原糖、总植物碱及酮类物质的作用效果受到处理条件的显著影响。在50℃、20%酶液添加量下施用酚氧化酶24 h后,烟叶中的TSNAs、酚类致香物质和酮类致香物质含量分别降低20.04%、27.08%和21.29%,还原糖、总糖、酯类致香物质含量分别增加44.92%、29.02%和11.27%,白肋烟的香气质、香气量、杂气、浓度、刺激性等多个指标分值提升1分以上,烟叶品质得到改善。综上,酚氧化酶施用于未经醇化的白肋烟叶,能够快速改善烟叶内在化学组分和提升烟叶品质。

褐变抑制剂对果蔬多酚氧化酶的影响

果蔬贮藏过程中,褐变问题严重影响其经济价值及营养价值,由多酚氧化酶引起的酶促褐变备受关注,寻找合适的抑制方法是国内外研究的热点。一些化学抑制剂对于酶促褐变具有良好的抑制效果,本文综述了果蔬褐变的机理,抗坏血酸、半胱氨酸、柠檬酸抑制剂的作用原理及具体应用,旨在为解决由酶促褐变引起的果蔬生产加工问题提供参考,促进果蔬品质的提升。

分子动力学模拟分析超高压对固液两态多酚氧化酶稳定性的影响

以固态晶体(crystal,C-)、液态(liquid,L-)多酚氧化酶(polyphenol oxidase,PPO)为对象,采用分子动力学模拟的方法,分析其在常温(298.15 K)常压/高压(0.1~400.0 MPa)条件下分子构象的变化。结果表明:固液两态PPO的空间结构均随压力(0.1~400.0 MPa)增大而变的不稳定;与L-PPO相比,C-PPO对压力更敏感,表现出更高的残基波动,溶剂可及表面积和体积减小,蛋白结构更致密;α-螺旋向无规卷曲过渡,导致氢键数量不稳定,螺旋弹性也降低,整体构象差异明显;活性位点Cu^(2+)位置疏远,残基之间距离发生改变、运动出现随机化,干扰底物催化结合。因此,物理状态和压力改变PPO空间结构、残基运动模式和底物结合范围,影响酶稳定性。因此,PPO状态和压力因素对酶变性程度可排序为:固态>液态,物理状态>压力水平。

过氧化氢酶、多酚氧化酶及其组合对白芽奇兰速溶茶粉香气品质的影响

本研究采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用技术和香气活性值(odor activity value,OAV)分析,探究过氧化氢酶、多酚氧化酶及复合酶处理对特色乌龙茶白芽奇兰速溶茶粉香气成分的影响。结果表明,经过氧化氢酶、多酚氧化酶及复合酶处理后,白芽奇兰速溶茶粉的香气成分和含量均发生了显著变化。过氧化氢酶处理组的香气成分含量最高且OAV提高最多,新生成了反式芳樟醇氧化物(呋喃糖)、顺式-己酸-3-己烯基酯和反式-β-法呢烯,且与未经处理的茶样相比反式-2-壬烯醛、β-环柠檬醛、反式-2-癸烯醛和反式香叶基丙酮的OAV均显著增加;多酚氧化酶处理组新生成了顺式-己酸-3-己烯基酯、反式-β-法呢烯、反式-β-紫罗兰酮和β-环氧紫罗兰酮,且反式-2-壬烯醛、芳樟醇和反式-β-紫罗兰酮的OAV显著增加;过氧化氢酶和多酚氧化酶复合处理组的香气成分种类最多,新生成了顺式-3-己烯-1-醇、反,反-2,4-庚二烯醛、顺式-β-罗勒烯、反式-2-辛烯醛、反,反-3,5-辛二烯-2-酮、壬醛、5-乙基-6-甲基-3-庚烯-2-酮、丁酸己酯、戊酸叶醇酯、2-甲基丁酸己酯、顺式-己酸-3-己烯基酯、己酸己酯、反式-β-法呢烯和反式-β-紫罗兰酮,且芳樟醇的OAV显著增加。这些酶处理引起的香气成分变化可能与类胡萝卜素氧化降解、脂质过氧化、萜醇类前体糖苷键断裂等机制相关。本研究发现了过氧化氢酶和多酚氧化酶复合处理对白芽奇兰速溶茶粉香气具有协同增效作用,可为提高速溶茶粉的香气品质提供理论依据。

中华蜜蜂酚氧化酶和丝氨酸蛋白酶相关基因及其全长转录本发掘与分析

为深入开展中华蜜蜂相关研究提供参考信息和基础,利用已获得的纳米孔(Nanopore)测序数据对中华蜜蜂Apis cerana cerana的酚氧化酶(phenoloxidase,PO)和丝氨酸蛋白酶(serine protease,SP)相关基因和全长转录本进行发掘和分析。通过Blast工具将中华蜜蜂所有全长转录本比对KEGG和Nr数据库以筛选出PO和SP相关基因和全长转录本。采用gffcompare软件将PO和SP相关全长转录本与东方蜜蜂参考基因组(ACSNU-2.0)已注释基因进行比较以优化结构。使用Astalavista软件鉴定PO和SP相关基因的可变剪接(alternative splicing,AS)事件,再利用IGV浏览器进行结构可视化。通过PCR验证AS事件的真实性。利用TAPIS pipeline预测和分析可变多聚腺苷酸化(alternative polyadenylation,APA)位点,并通过TBtool软件鉴定APA位点上游的基序(motif)。鉴定到中华蜜蜂PO和SP相关的42个基因与146条转录本。优化了16个参考基因组已注释PO和SP相关基因的结构,其中5′端延长和3′端延长的基因均有7个,5′端和3′端同时延长的基因有2个。鉴定到PO和SP相关的10个基因的389次AS事件,其中最丰富的AS类型是5′端可变剪接。PCR结果证实了2次AS事件的真实性。共鉴定到34个PO和SP相关基因含有1个及以上的APA位点,其中含有3个APA位点的基因数量最多;在APA位点上游鉴定到多个motif,一致性序列为:GGHKSYWSHHTRATWTCNBHDMRRYWYRTNYTVACNGCKGCDCAYTGYR。鉴定到中华蜜蜂PO和SP相关的42个基因和146条全长转录本,优化了东方蜜蜂参考基因组已注释的PO和SP相关基因结构,并发掘出PO和SP相关基因的389次AS事件和237个APA位点。

棉酚对雄性肉仔鸡脏器指数和血清氧化酶活性的影响

试验旨在研究棉酚对不同生长阶段雄性肉仔鸡脏器指数及血清氧化酶活性的影响,选择1日龄48只雄性肉仔鸡,随机分为4组,即C组(对照组)、L组、M组、H组,每组4个重复,每个重复3只鸡。各组在饲喂基础日粮基础上根据体重每天分别灌入蒸馏水和100、150、200 mg/kg棉酚。试验期3周。结果显示:与C组相比,8日龄及13日龄试验组肉仔鸡肝脏指数均极显著升高(P<0.01);8日龄M组、13日龄H组和18日龄L组肉仔鸡脾脏指数均显著升高(P<0.05);13日龄M组肉仔鸡肾脏指数显著升高(P<0.05),H组肉仔鸡肾脏指数极显著升高(P<0.01)。8日龄M组、H组以及18日龄L组肉仔鸡法氏囊指数显著升高(P<0.05)。随着棉酚剂量增加,肉仔鸡血清丙二醛(MDA)的含量逐渐升高,超氧化物歧化酶(SOD)活性和总抗氧化能力(T-AOC)逐渐降低,机体抗氧化能力下降。试验组肉仔鸡肝脏发生明显病变,出现肝脏细胞间隙变大、分布杂乱不整齐、肝脏细胞结构不完整和细胞膜溶解等病理特征。研究表明,灌喂100 mg/kg以上剂量的棉酚可影响雄性肉仔鸡肝脏、脾脏、肾脏、法氏囊的脏器指数,引起机体的氧化应激反应,降低其抗氧化能力,对肝脏造成损伤。

抗褐变抑制剂对果蔬多酚氧化酶的影响

果蔬的褐变问题对农户造成了很大的经济损失。在生产贮藏过程中,由于酶促褐变产生的对果蔬色泽、感官、及营养品质的负面影响大大降低了果蔬市场的经济效益。褐变是果实成熟老化生理衰退和果实品质劣变的特征之一,本质上是根据是否有酶的参与分为酶促褐变和非酶促褐变。

基于黄鲫蛋白肽制备南美白对虾多酚氧化酶复合生物抑制剂的研究

目的 以黄鲫蛋白肽(half-fin anchovy hydrolysate peptides,HAHp)为基料复配抗坏血酸和茶多酚制备南美白对虾多酚氧化酶(polyphenol oxidase, PPO)复合生物抑制剂(composite biological inhibitor, CBI)。方法 以南美白对虾PPO抑制率为检测指标,分别研究HAHp、抗坏血酸、茶多酚、柠檬酸和乙二胺四乙酸二钠盐(ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt, EDTA-2Na)单独抑制PPO活性,选取HAHp、抗坏血酸和茶多酚进行三因素三水平正交优化实验优化CBI配方组成,通过酶促动力学研究CBI对南美白对虾PPO的抑制模式。结果 HAHp、抗坏血酸、茶多酚、柠檬酸和EDTA-2Na对南美白对虾PPO都有一定的抑制作用,且有一定的剂量依赖性,但单一抑制剂对PPO的抑制作用有限。HAHp与天然抗氧化剂抗坏血酸和茶多酚复配,经(L933)正交实验优化CBI的最佳配方为:0.7%HAHp、0.02%抗坏血酸和0.20%茶多酚。经测定CBI对南美白对虾PPO抑制率达到94.71%±0.46%,酶促动力学结果表明CBI是一种混合型抑制剂,通过降低南美白对虾PPO对底物亲和力实现抑制PPO活力。结论 以HAHp为基料复配抗坏血酸和茶多酚制备的CBI能够有效地抑制南美白对虾PPO活性,有望开发成一种防虾黑变的天然抑制剂,为南美白对虾天然保鲜剂的研究奠定了理论基础。

茶叶中多酚氧化酶的性质及其在茶叶加工中的作用

本文着眼于茶叶领域多酚氧化酶的研究进展,着重介绍了该酶在茶叶氧化过程中的关键作用。多酚氧化酶是茶叶加工中不可或缺的酶类之一,对茶叶的风味、色泽和营养成分有直接影响。深入了解多酚氧化酶的特性和调控机制,对于优化茶叶加工工艺至关重要。通过科学研究多酚氧化酶的作用机制,我们能够提供更高效的加工方法,从而进一步提升茶叶的品质和市场竞争力。这项研究对茶叶产业的发展、品质提升有着重要意义。

产多酚氧化酶菌株在改善雪茄烟叶品质中的应用研究

为了更好地协调雪茄烟叶中多酚类物质含量和提升烟叶感官质量,通过特异性筛选产多酚氧化酶菌株,将其应用于雪茄烟叶发酵中,测定发酵烟叶挥发性化合物含量和分析烟叶感官质量,探究产多酚氧化酶菌株对雪茄烟叶品质改善的机制。结果表明,共筛选出3株菌株(C1、C2和C3)可降解绿原酸,产多酚氧化酶活性分别为116.67、41.67、141.67 U/mL。产多酚氧化酶的菌株应用于雪茄发酵能够丰富烟叶香韵类型、减轻烟叶杂气、提升烟叶感官质量和提高烟叶工业可用性,其中菌株C2发酵烟叶香气质、香气量、杂气和透发性等指标改善最明显。发酵烟叶中2,6-二甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪等美拉德反应产物,壬酸乙酯、3-甲基戊酸等脂肪酸降解产物和苯甲醇、苯甲醛、苯乙酸乙酯等芳香族氨基酸降解产物的含量增加。多酚物质降解能够增加美拉德反应前体和芳香族氨基酸前体物质,促进美拉德反应产物和芳香族氨基酸降解产物转化;同时,多酚的氧化降解减少对微生物代谢生长的抑制,使得发酵烟叶中乙酸乙酯积累。综上,产多酚氧化酶菌株能够促进烟叶美拉德反应产物和芳香族氨基酸降解产物含量的增加,较好地改善雪茄烟叶品质。

不同氧浓度气调和解封对片烟多酚氧化酶活性的影响及来源探究

为了研究气调贮存和解封后使用过程中片烟多酚氧化酶(PPO)活性的变化及探究烟草中PPO的活性来源,以5种氧气浓度气调醇化的3种烟草片烟为研究对象,分别在气调醇化的18个月、21个月和26个月时,取样测定气调贮存和解封1~3个月过程中片烟PPO的活性;并通过对片烟表面微生物的灭菌处理,研究片烟气调过程中PPO的来源。结果表明,低氧气调处理对PPO的活性有一定的抑制效果。解封后的2个月内,4种低氧处理组片烟PPO的活性降幅均大于正常氧浓度处理组;且对于三种产地的片烟而言,采用2%~4%的氧气浓度气调处理都能较好地抑制PPO的活性。本研究证明了片烟的PPO活性来源于片烟内部而非片烟表面微生物,2%~4%的低氧气浓度气调处理能有效降低PPO活性,有利于片烟中多酚类物质的保留,为片烟贮藏和解封后的生产和使用提供了一定的理论基础。

马铃薯多酚氧化酶的分离纯化及酶学特性研究

为控制马铃薯在贮藏和加工过程发生的酶促褐变,对马铃薯多酚氧化酶进行分离纯化,并研究其酶学特性。采用缓冲液提取、低温离心得到马铃薯多酚氧化酶(PPO)粗酶液,粗酶液经硫酸铵分级盐析、Sephadex G-25分子凝胶柱层析脱盐处理、DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换柱层析和Sephadex G-75分子筛凝胶过滤层析分离纯化得到马铃薯PPO,进一步对其部分酶学特性进行研究。结果显示:纯化后的马铃薯PPO其比活力为283.0 U·mg^(-1),回收率为16.8%,纯化倍数为18.6倍;该酶最适反应温度为30℃,最适反应pH为6.5;以邻苯二酚为底物时,最适底物浓度为50 mmol·L^(-1)。该酶对焦性没食子酸、间苯二酚的底物亲和性较强,对4-甲基儿茶酚、咖啡酸、没食子酸、对苯二酚、邻苯二酚、绿原酸的底物亲和性较低,对N-BOC-酪胺、愈创木酚亲和性很低。

红树莓叶片生长代谢过程中酚类物质含量及抗氧化酶活性分析

为探究红树莓叶片生长代谢过程中酚类物质含量与抗氧化酶活性的变化规律,以‘海尔特兹’和‘秋福’红树莓叶片为材料,对其总黄酮、7种酚类物质和3种抗氧化酶活性的变化规律进行比较分析。结果表明:从5月到12月,两品种红树莓上、中、下部叶片的鞣花酸含量、过氧化物酶(peroxidase,POD)活性在生长代谢过程中均呈双峰曲线,水杨酸含量在生长代谢过程中均呈下降趋势,阿魏酸、儿茶素、表儿茶素、芦丁、总黄酮含量在生长代谢过程中均呈单峰曲线,超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性一直处于较高水平,过氧化氢酶(catalase,CAT)活性呈先下降再上升又下降的变化趋势;两品种红树莓上部叶片的咖啡酸含量均呈下降趋势,中部和下部叶片均呈单峰曲线。红树莓叶片中的酚类物质含量和抗氧化酶活性因生长代谢过程而异。其中,水杨酸、阿魏酸、鞣花酸、表儿茶素含量最高的时期依次是‘秋福’的5月份上部叶片、6月份上部叶片、7月份中部叶片、7月份上部叶片,依次为59.33 mg/100 g、158.18 mg/100 g、250.84 mg/g、350.04 mg/100 g;芦丁、咖啡酸、儿茶素、总黄酮含量最高的时期依次为‘海尔特兹’的6月份下部叶片、7月份中部叶片、7月份中部叶片、7月份上部叶片,依次为8.00 mg/100 g、100.48 mg/100 g、18.71 mg/g、34.18 mg/g;POD、SOD、CAT活性最高的分别是‘秋福’7月份上部叶片、‘海尔特兹’7月份下部叶片、‘海尔特兹’7月份下部叶片,依次为13.05 U/(g·min)、37.00 U/g、41.12 U/(g·min)。综上所述,5—7月份采摘的‘海尔特兹’和‘秋福’红树莓叶片中酚类物质含量和抗氧化酶活性最高。本研究为红树莓叶片的适时采收及更好地开发利用提供重要理论依据。

远红外辐射对山药多酚氧化酶活性及构象的影响

目的:探讨远红外辐射加热对山药多酚氧化酶活性及构象的影响。方法:采用不同的远红外辐射温度对山药进行预处理,研究不同远红外辐射温度对山药多酚氧化酶(PPO)活性、褐变度、总酚含量及PPO构象的影响。结果:当辐射温度为260℃时,处理11 min后PPO酶活仍未钝化,辐射温度高于260℃时,PPO在3~7 min内即可失活;褐变度与总酚含量不随辐射温度的升高和处理时间的增加而规律性变化。经远红外预处理后,随着辐射温度的升高,无规则卷曲和α-螺旋含量有轻微的变化,β-转角减少、β-折叠增加,表明远红外改变了PPO的二级结构。PPO紫外光谱蓝移,荧光光谱红移,表明PPO三级结构发生改变。结论:远红外辐射加热能改变山药中PPO构象并有效钝化PPO活性。

一种多金属氧酸盐对多酚氧化酶的抑制活性评价及在南美白对虾保鲜上的应用

目的:研究新型多酚氧化酶抑制剂对南美白对虾的保鲜效果。方法:通过紫外和红外光谱表征合成的多酚氧化酶抑制剂H_(8)[P_(2)Mo_(17)Ni(OH_(2))O_(61)](P_(2)Mo_(17)Ni),研究其对蘑菇多酚氧化酶(PPO)相对酶活的影响及抑制机制和抑制类型;再测定经P_(2)Mo_(17)Ni处理后的南美白对虾在贮藏过程中的感官评分、色差(L*)值、总色差(ΔE)值、菌落总数、酸碱度(pH)值和总挥发性盐基氮(TVB-N)值的变化情况,评价P_(2)Mo_(17)Ni在南美白对虾保鲜上的作用。结果:P_(2)Mo_(17)Ni对体外蘑菇PPO的活性具有抑制作用,其半抑制浓度(IC_(50))为(0.377±0.004)mmol/L,且对PPO的抑制模式为竞争型可逆抑制,抑制常数K_(I)为0.185 mmol/L。在4℃冷藏条件下,与空白组相比,P_(2)Mo_(17)Ni处理能延缓对虾感官评分的下降和L*值、ΔE值的增加,抑制效果显著;且能显著延缓菌落总数、pH值和TVB-N值的增加,货架期可延长4~5 d。结论:P_(2)Mo_(17)Ni对南美白对虾具有良好的保鲜效果。

响应面法优化美味牛肝菌伞部及柄部多酚氧化酶的提取工艺

分别以美味牛肝菌的伞部和柄部为原料提取多酚氧化酶(PPO)。以伞部和柄部PPO酶活为指标,在单因素试验的基础上,通过响应面试验优化美味牛肝菌伞部和柄部PPO的提取工艺。结果表明:美味牛肝菌伞部PPO的最佳提取工艺为提取温度22℃、液料比2.0∶1(mL/g)、底物浓度1.0 mol/L、pH 7.4,在此条件下伞部PPO酶活为13.111 U;柄部PPO的最佳提取工艺为提取温度60℃、液料比2.2∶1(mL/g)、底物浓度0.5 mol/L、pH 5.9,在此条件下柄部PPO酶活为10.833 U。

芒果果实多酚氧化酶(PPO)基因的克隆与表达分析

多酚氧化酶(Polyphenol oxidase,PPO)是引起水果褐变的关键酶。为了研究芒果果实中PPO基因的功能,本试验采用RACE方法从‘贵妃’芒果果实中克隆得到了1个PPO基因,该基因cDNA序列全长为1930bp,开放阅读框为1782bp,编码593个氨基酸。芒果PPO基因编码的多酚氧化酶属于亲水性蛋白质,分子重量为66.82KD,等电点为6.95,不含跨膜结构和信号肽,为非分泌蛋白,包含Tyrosinase、PP01_DWL和PP01_KFDV保守结构域。芒果PPO蛋白的二级结构无规则卷曲、β-折叠和α-螺旋占比分别为63.58%、22.60%和13.83%,三级结构与模板6els.1.A-致性达70.94%,可能与C2H2 and C2HC zinc fingers superfamily protein(TT1),Multidrug resistance protein,mate family(TT12)和Autoinhibited H(+)-ATPase isoform 10(AHA10)等存在相互作用。聚类分析表明该蛋白与开心果、橄榄、克莱门柚和甜橙等植物的亲缘关系较近。通过qRT-PCR分析,芒果PPO基因主要在‘桂七’果皮中表达量较高,而在‘贵妃’果皮中表达量较低。该基因的克隆及其功能的研究对芒果抗酶促褐变品种的培育以及分子改良具有重大意义。

香叶木素抑制多酚氧化酶的分子机制

采用多种光谱学方法结合计算机模拟手段研究了香叶木素对多酚氧化酶(PPO)的抑制机制。发现香叶木素通过可逆混合方式对PPO活性产生抑制,IC 50值为(302.9±1.82)μmol·L^(-1)。荧光结果显示香叶木素通过静态方式猝灭PPO的内源荧光,二者形成复合物主要依靠疏水相互作用驱动,在测定温度下,其结合常数为104数量级,结合位点数为1。圆二色谱和同步荧光分析表明,香叶木素诱导PPO的α-螺旋含量增加,β-折叠和无规则卷曲含量降低,酶结构紧缩,但对酪氨酸和色氨酸残基周围微环境几乎没有影响。分子对接显示香叶木素进入PPO的疏水空腔,结合于双核铜活性中心附近并与周围的氨基酸残基主要通过氢键、疏水作用力和范德华力相互作用。分子动力学模拟结果表明,香叶木素的加入降低了酶的稳定性和亲水性,增强了酶结构的致密性。因此,香叶木素抑制PPO活性可能归因于香叶木素结合在PPO的活性中心附近,与周围的氨基酸残基相互作用,占据了底物进出活性中心的通道,诱导了PPO二级结构的改变,阻止了底物被催化,从而抑制了PPO的催化活性。本研究为香叶木素作为新型PPO抑制剂的应用提供了理论基础。