香蕉多酚氧化酶基因编码序列的电子克隆和生物信息学分析

用电子克隆方法获得香蕉多酚氧化酶(polyphenol oxidase,PPO)基因编码序列。采用生物信息学方法,对此序列编码的蛋白质从氨基酸组成、理化性质、疏水性/亲水性、亚细胞定位、高级结构及功能域等方面进行了预测和分析。结果表明:香蕉PPO基因编码序列全长1 602 bp,包含1 602 bp开放阅读框(open reading frame,ORF),含有PPO功能域和酪氨酸酶功能域,在序列组成、高级结构及活性位点等方面,与小麦等其他植物的PPO基因具有高度的相似性。

茶树多酚氧化酶基因的克隆及其序列比较

根据已经发表的多酚氧化酶基因中的保守序列 ,设计兼并引物 ,利用nest-PCR技术 ,首次克隆了茶树多酚氧化酶基因。该基因已经在GenBank上登录 ,登录号为AF2 69192。序列分析表明 ,茶树多酚氧化酶基因与其它植物中的多酚氧化酶基因有较高的相似性 ,尤其在铜离子结合部位 ,所有的植物基本上一致。进化树分析表明 。

短沟对虾和斑节对虾酚氧化酶原基因的克隆和序列分析

采用RT PCR原理和长片段扩增技术克隆短沟对虾和斑节对虾酚氧化酶原基因。设计合成特异引物、提取血细胞总RNA ,反转录后扩增获得的特异片段回收并克隆到pGEM TEasyVector系统的T载体上 ,重组子进行碱基序列测定。结果表明 ,所克隆的短沟对虾酚氧化酶原基因含起始密码子ATG到终止密码子TGA的 2 0 5 5bp ,编码 6 84个氨基酸。斑节对虾酚氧化酶原基因含ATG到TGA的 2 0 6 1bp ,编码 6 86个氨基酸。短沟对虾酚氧化酶原推算分子量为 781 5 3Da ,等电点pI为 6 2 5 ;斑节对虾则为 785 81Da ,pI为 5 83。用DNA分析软件分析显示两种对虾酚氧化酶原基因具有高度的同源性 ,二者的碱基和推测的氨基酸序列同源性分别为 93 %和 92 %;对虾与其他节肢动物酚氧化酶原基因的同源性的高低与种类间亲缘关系相关 ;不同种类间酚氧化酶活性中心重要组成部分的 2个铜结合位点、位于铜结合位点内的6个组氨酸以及与铜结合位点相邻的氨基酸序列高度保守。

茶叶多酚氧化酶基因克隆与序列分析

以天然无咖啡碱南昆山毛叶茶、英红9号和福云6号三个茶树品种为研究材料,采用同源克隆法,根据已克隆的植物多酚氧化酶基因的序列分析,设计特异引物,从三个茶树品种中克隆获得多酚氧化酶基因全长,分别编码595、599和597个氨基酸。序列比较分析表明,茶树多酚氧化酶基因的核苷酸序列同源性高于92.6%,氨基酸序列同源性高于94.6%,并包含两个富含组氨酸的铜离子保守区域。

莲多酚氧化酶基因的克隆及序列分析

多酚氧化酶是一类普遍存在于植物、真菌、昆虫的质体中,由核基因编码能与铜相结合的金属蛋白酶。它是许多果蔬等农产品酶促褐变的主因,也在植物的光合作用、抗病虫害、生长发育以及花色的形成中起一定作用。用RT-PCR方法,从中国莲(Nelumbonucifera)幼叶RNA中成功扩增出ppo的部分序列,经克隆测序,得到长度在978～1057bp的序列共7个,编码326～352个氨基酸。与其他物种PPO进行比较,其核苷酸序列相似性为83%～85%,氨基酸序列相似性为84%～99%。莲ppo的成功克隆为抑制莲藕的酶促褐变,提高莲的抗虫抗病性等的研究打下了良好的基础。

棉铃虫酚氧化酶原基因的克隆、序列分析和组织表达

利用RT-PCR和RACE方法,获得了棉铃虫Helicoverpa armigera酚氧化酶原（prophenoloxidase,PPO）基因一个亚型cDNA的完整序列.该序列全长2 405 bp,含有一个2 097 bp的开放阅读框,编码一个由698个氨基酸残基组成的蛋白质.推导的氨基酸序列与其他鳞翅目昆虫PPO2基因相应氨基酸序列有较高的同源性（76%～80%）,同时该序列具有铜离子结合位点等PPO基因所具有的典型特征.组织特异性表达分析表明,该基因在棉铃虫血细胞、体壁和中肠中均有表达.

草莓果实多酚氧化酶基因的克隆及序列分析

多酚氧化酶(polyphenol oxidase,PPO)是一类植物体内广泛存在的由核基因编码的能与铜结合的金属蛋白酶。它是诱导许多果蔬等农产品产生酶促褐变的主要原因,同时在植物的生长发育、抗病虫害及果实品质形成等方面也起到了一定的作用。本文用RACE的方法,从草莓幼果cDNA中成功扩增出PPO基因的3'端部分序列。序列分析表明该基因片段编码424个氨基酸。与其他物种PPO核苷酸序列比较相似性为72%～80%,氨基酸相似性为82%～87%。草莓多酚氧化酶基因的成功克隆,为草莓抗褐变的研究及果实品质的改良打下了坚实的理论基础。

碱蓬多酚氧化酶基因的克隆及序列分析

多酚氧化酶（polyphenol oxidase,PPO）是一类植物体内广泛存在的由核基因编码的能与铜结合的金属蛋白酶,是碱蓬甜菜红素合成的第一关键酶。以盘锦红海滩碱蓬（盐地碱蓬）为研究材料,采用同源克隆法,根据植物中已克隆出的PPO序列进行引物设计,利用RT-PCR和RACE技术,从碱蓬中克隆出的PPO基因cDNA全长为1 830 bp,编码609个氨基酸。序列分析表明,与其他植物PPO核苷酸序列的相似性为69%~87%,氨基酸的相似性为49%~62%。碱蓬多酚氧化酶基因的成功克隆,为碱蓬甜菜红素的研究和利用打下了坚实的理论基础。

烟草多酚氧化酶基因的克隆与序列分析

多酚氧化酶(PPO)在高等植物中广泛存在,其利用分子氧催化氧化酚类物质为醌,对植物的抗虫和抗病起着一定的作用,同时它介导的酶促反应也是烤制中烟草褐变的主要原因。本文采用RT-PCR,成功地从野生烟草(Nicotiana tabacum)叶片中克隆出了PPO c DNA序列。序列分析表明,烟草PPO基因ORF长为1773 bp,编码590个氨基酸,基因登陆号为KC540916,烟草与其他物种PPO的核苷酸序列与氨基酸序列同源性达80%以上,并包含两个高度保守的铜离子结合区域。烟草PPO基因的克隆为烟草的抗性研究和褐化反应的控制研究提供了良好的理论基础。

巴西蕉多酚氧化酶的基因克隆及序列分析

基于香蕉基因组的信息,利用电子克隆方法获得巴西蕉PPO基因,结合RT-PCR验证,并通过生物信息学软件对巴西蕉PPO进行序列分析。结果表明,成功获得编码巴西蕉PPO的新基因,序列长度为1 767bp,编码588个氨基酸（Gen Bank登录号：KF900300.1）。巴西蕉PPO基因与禾本科植物PPO基因有着较高的同源性,相似度在82%~85%,与蔷薇科鸡麻亲缘关系最近。巴西蕉PPO最有可能存在于叶绿体中,不具有信号肽,含有一个长度为47个氨基酸的叶绿体转运肽。巴西蕉PPO蛋白属于酪氨酸酶基因家族蛋白,具有酪氨酸酶超级家族、PPO1_DWL和PPO1_KFDV3个保守结构域。巴西蕉PPO分子量为65.6 KDa,等电点为6.32,为亲水性蛋白质。巴西蕉PPO二级结构中无规则卷曲占的比例最高为57.31%,成功预测得到巴西蕉PPO的三级结构模型。

大劣按蚊前酚氧化酶基因部分序列的克隆与序列分析

目的 克隆大劣按蚊 (Anophelesdirus)前酚氧化酶 (Prophenoloxidase,PPO)基因部分序列。 方法 根据已报道的多种昆虫 PPO的保守氨基酸序列设计简并引物 ,以大劣按蚊总 RNA为模板进行 RT- PCR扩增 ,目的片段经 TA克隆后测定其核酸序列 ,然后进行序列查询与比对。 结果 大劣按蚊 PPO基因 (Ad PPO)部分序列长 5 98bp,编码 199个氨基酸 ;Ad PPO与冈比亚按蚊 PPO5基因的核酸和氨基酸序列同源性分别达 84 .2 3%和 88.89%。 结论 成功克隆出Ad PPO部分序列 ,其与冈比亚按蚊 PPO基因序列具有很高同源性。

中华按蚊前酚氧化酶基因部分序列的基因结构和功能预测

前酚氧化酶是一种黑色素合成酶，是节肢动物体内的一种重要免疫蛋白。为了克隆中华按蚊Anophelessinensis前酚氧化酶（Prophenoloxidase，PPO）基因部分序列，根据已报道的多种昆虫PPO氨基酸的保守序列设计简并引物，以中华按蚊总RNA为模板进行RT—PCR扩增，目的片段经TA克隆后测序。所得中华按蚊PPO基因（ASPPO）部分序列长597bp，编码199个氨基酸；与几种近缘蚊种的PPO基因序列同源性分别达57％～100％不等。经在线比对，该序列在基因组中分属两个外显子区域，中间含有一个内含子。推导的氨基酸序列含有两个铜离子结合位点，与目标序列相符，表明成功克隆出ASPPO部分序列。所得序列登录GenBank，登录号：JX295575，JX295576。推导的氨基酸序列提交瑞士蛋白质空间构象模拟平台Swiss-model，以冈比亚按蚊免疫相关前酚氧化酶为模板进行空间3D构象模拟，SPDview软件分析拉氏构象图。结果显示拉氏构象得分较高而QMEAN得分较低，近似跨膜蛋白值，提示该该蛋白是否为中华按蚊中肠和血淋巴疟原虫免疫蛋白尚不确定，需进一步研究。

桐花树多酚氧化酶同源基因片段的克隆及序列分析

以桐花树(Aegiceras corniculatum(L.)Blanco)叶为材料,采用同源PCR克隆策略,扩增桐花树多酚氧化酶(Polyphenol Oxidase,PPO)铜结合区之间的cDNA序列。该序列长度597 bp(Genbank accessionNo.GQ404509),编码了一段由199个氨基酸残基组成的多酚氧化酶保守区片段。桐花树PPO保守区片段具有PPO铜结合区A(CuA)的特征信号序列Hnswl.FFp FHRyyLyff E。同源比对表明,该序列与GenBank上其他已有的植物多酚氧化酶氨基酸序列的同源性都在65%以上。

无核白葡萄多酚氧化酶基因的克隆与序列分析

为获得无核白葡萄中多酚氧化酶(PPO)的基因序列,以无核白葡萄果实为试材,进行基因同源克隆,得到多酚氧化酶基因CDS全长序列,其完整的编码框为1 824 bp,编码607个氨基酸(GenBank登陆号为KP271928);系统进化分析可知,其与葡萄科植物PPO基因同源性最高;生物信息学方法发现该蛋白分子量为67 392.44 Da,等电点为6.42,具典型的酪氨酸家族结构域,无信号肽结构,但有一个跨膜结构域,为亲水性蛋白;二级结构预测发现,PPO具有CuA与CuB两个结合区,分别嵌入蛋白活性腔中。该研究为进一步从分子水平探讨多酚氧化酶与褐变的关系奠定理论基础。

水稻多酚氧化酶基因功能标记的开发与应用

水稻酚反应是水稻分类的重要依据。控制水稻酚反应的多酚氧化酶基因(PPO)已经克隆,根据其等位基因的DNA序列差异设计了InDel功能标记FMppo-18和FMppo-29。利用这两个标记对45份材料进行了标记基因型分析和酚反应鉴定。结果发现3份普通野生稻为非缺失带型;8份籼稻材料中6份为非缺失带型,而Dular为缺失29 bp带型,龙晴为缺失18bp带型,表明Dular和龙晴分别携带29 bp和18 bp缺失的PPO等位基因;11份粳稻材料中9份携带18 bp缺失的PPO等位基因,2份携带29 bp缺失的PPO等位基因。对23份杂草稻鉴定的结果表明,7份早年发现的杂草稻,即3份江苏省连云港穞稻和4份安徽省怀远、来安、全椒、肥东的塘稻为非缺失带型;而16份近年来发现的杂草稻中14份不缺失,2份表现为18 bp缺失的PPO等位基因,与江苏省大面积推广的栽培粳稻品种携带相同的PPO基因。酚反应结果表明带29 bp或18bp缺失的PPO等位基因的材料酚反应呈阴性,而不缺失的材料酚反应呈阳性。标记基因型与酚反应表现型完全对应。表明这两个功能标记可用于水稻种质资源鉴定、进化研究以及多酚氧化酶基因的分子标记辅助选择育种。

中国明对虾酚氧化酶原基因cDNA的克隆与表达特征

利用3′和5′RACE技术从中国明对虾血细胞中克隆了一个酚氧化酶原基因FCproPO,FCproPO基因cDNA全长为2311bp,其中开放阅读框2061bp,编码687个氨基酸,预测分子量为78.71ku。推测的序列与凡纳滨对虾同源性为84%,与日本囊对虾同源性为71%。RT-PCR实验结果表明,FCproPO在血细胞中的相对表达量最高,在心脏和精巢中几乎不表达。序列分析发现FCproPO含有两个保守的铜离子结合位点;进化分析发现FCproPO与斑节对虾、日本囊对虾、凡纳滨对虾等海水虾的酚氧化酶原亲缘关系最近。该基因在被鳗弧菌和对虾白斑病毒(WSSV)感染后的对虾肝胰腺中的表达量显著增加,并具有不同的时空表达趋势,提示中国明对虾FCproPO基因在免疫反应中具有重要作用。

鸭梨多酚氧化酶基因CDS区的克隆及表达

以鸭梨(Pyrus bretschneideri Rehd.)果皮基因组DNA为模板,根据已经发表的多酚氧化酶(polyphenol oxidase,PPO)基因保守序列设计引物,利用PCR技术,克隆得到鸭梨多酚氧化酶编码区序列,将此核酸序列克隆到载体pGEM-T,酶切鉴定后测序,结果表明该段序列含有1782个核苷酸,编码593个氨基酸。对鸭梨多酚氧化酶基因片段的一致性分析和进化树分析表明,该片段与沙梨(Pyrus pyrifolia,AB056680)、苹果(Malus domestica,L29450)、李(Prunuss alicina,AY866432)以及杏(Prunus armeniaca,AF020786)的一致性分别为99%、96.3%、82%和51.4%,绘制的进化树和形态学分类地位相一致。将该片段连接到表达载体pET39b上,获得的重组子命名为pET39b-PPO,热激法转化表达受体大肠杆菌BL21(DE3)菌株,用IPTG进行诱导。SDS-PAGE分析表明,PPO基因在大肠杆菌中被诱导表达蛋白质相对分子质量约66ku,检测表明具有多酚氧化酶的活性。

日粮添加酵母硒和茶多酚对团头鲂幼鱼肝抗氧化酶活性及其基因表达的影响

酵母硒和茶多酚都是优质的天然抗氧化剂。酵母硒作为有机硒源,兼有抗氧化和免疫增强的双重功效。茶多酚是茶叶中多酚类物质的总称,具有清除体内自由基、抗菌消炎和免疫调节等多种功效。为探讨酵母硒和茶多酚及其配伍对团头鲂(Megalobrama amblycephala)组织硒沉积量,肝中抗氧化酶活性及其基因m RNA表达的影响,本试验采用二因素三水平设计,在团头鲂幼鱼基础饲料中分别添加酵母硒(按硒计)3个水平(分别为0,0.25 mg/kg,0.50 mg/kg),茶多酚3个水平(分别为0,50 mg/kg,100 mg/kg),进行排列组合后得到9组日粮。选用体重为(1.75±0.01)g团头鲂1 350尾,随机分为9组,每组3个重复,每个重复50尾,进行为期8周的饲养试验。结果表明:1)日粮中添加酵母硒和茶多酚均能显著提高团头鲂幼鱼的增重率和特定生长率(P<0.05),当日粮中硒缺乏时,两者互作效应显著(P<0.05);而当硒适量或过量时,两者交互作用不显著(P>0.05)。2)日粮中单独添加酵母硒能显著提高团头鲂肌肉和肝中硒含量(P<0.01),而茶多酚对组织硒含量无显著影响(P>0.05),两者对硒在肝中沉积的交互作用显著(P<0.05)。3)酵母硒和茶多酚均能够通过诱导抗氧化酶基因表达来提高机体抗氧化酶性能,不同的是酵母硒主要上调Ma GPx1和Ma Cu/Zn-SOD基因m RNA表达,茶多酚主要上调Ma CAT基因。4)酵母硒和茶多酚具有协同抗氧化作用,两者配伍上调了Ma GPx1基因m RNA表达量(P<0.05),对Ma Cu/Zn-SOD和Ma CAT基因表达有促进作用,结果两者配伍显著提高了肝总抗氧化能力(T-AOC)而显著降低肝丙二醛(MDA)含量(P<0.05)。综合分析,建议当基础日粮中添加0.50 mg/kg酵母硒和50 mg/kg茶多酚时,即在提高生长指标的同时较好的提高各抗氧化物酶的活性,降低肝中MDA的含量。

茶树多酚氧化酶基因的SNP分析

选取有代表性的40个茶树品种(系)为材料,先采用PCR-SSCP-银染检测技术,对供试材料的多酚氧化酶(PPO)基因进行SSCP分析,对PPO基因作初步基因分型;根据分型分析结果,对每一类型选择典型品种的PPO基因作进一步的DNA序列分析,用DNASTAR Program进行单核苷酸多态性(SNP)搜寻.结果表明,茶树PPO基因存在丰富的SNP,其类型包括:转换(AG,CT)、颠换(AT,GC,G→T,A→C)与杂合子(C/T,A/G,G/T,A/T,A/C,G/C).在发现的37个SNPs中,有13个SNPs发生在核酸内切酶酶切位点,有10个错义SNPs位点导致氨基酸的改变.在PPO基因的保守序列区,出现SNP的频率较低.

基因型和地点对小麦品种面粉多酚氧化酶活性的影响研究

试验对1999年度种植在长江中下游11个代表性试点的22个小麦主栽品种进行了面粉多酚氧化酶(PPO)活性影响因素研究。结果表明,基因型、环境及其互作对PPO活性的影响达到1%显著水平。面粉L*值与PPO活性呈1%显著负相关,r值为-0.55,容重和淀粉糊化品质指标与PPO活性呈5%或1%显著负相关,籽粒硬度、面粉b*值、沉降值以及吸水率、稳定时间与PPO活性呈5%正相关,r值分别为0.57、0.69、0.46、0.42和0.46,而千粒重、籽粒直径、出粉率、灰分和蛋白质含量以及面团拉伸特性与PPO活性相关不显著。