多酶级联催化合成(R)-β-酪氨酸

目前报道的β-酪氨酸生产方法需要较为复杂的底物而且大多依赖于贵金属催化剂。为了实现生物法绿色合成β-酪氨酸,通过人工设计的级联反应,将酪氨酸酚裂解酶和酪氨酸氨基变位酶进行级联,以苯酚、丙酮酸和铵盐等廉价化合物为底物合成(R)-β-酪氨酸。通过基因挖掘筛选了所需的酶元件,并采用蛋白质工程改造,提升了限速酶的催化效率。在大肠杆菌宿主中对所筛选的酶进行共同表达,经优化获得了(R)-β-酪氨酸合成菌株E.coli S10。在1 L规模反应中,菌株E.coli S10合成(R)-β-酪氨酸的转化率达到78%,ee值>99%。利用高分辨质谱(HRMS)和核磁共振图谱(NMR)分别鉴定了纯化产物的分子量和结构,结果表明通过该级联路径可成功合成目标产物(R)-β-酪氨酸。研究工作可为(R)-β-酪氨酸的绿色酶法生产提供理论指导。

丝状自组装蛋白支架介导的双酶级联催化体系构建促进D-塔格糖合成

D-塔格糖是一种稀有的己酮糖,具有低能量、高甜度,在食品领域具有广泛的应用。目前,D-塔格糖的生物合成大多聚焦于异构酶途径及关键酶L-阿拉伯糖异构酶的挖掘与改造,多酶级联催化的应用较少,且受热力学平衡影响转化率较低。该研究首先构建并表征了来源于Methanocaldococcus jannaschii的丝状自组装蛋白支架EE/KK,结果显示,其在胞内外均可实现有效的荧光蛋白级联互作。其次,在大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)中应用EE/KK蛋白支架级联组装D-木糖还原酶(SsXR,Scheffersomyces stipitis来源的NAD(P)H-dependent D-xylose Reductase)和半乳糖醇脱氢酶(RlGDH,Rhizobium leguminosarum来源的SDR Family Oxidoreductase),强化基于氧化还原酶途径合成D-塔格糖的效率。相较于游离体系,EE/KK级联体系的D-塔格糖产量提高50%。进一步对级联体系重组菌株BL21-EX/KG(EX和KG分别为EE-SsXR和KK-RlGDH蛋白复合体的缩写)发酵条件进行优化,结果表明:以Luria-Bertani(LB)培养基为发酵培养基,温度20℃,0.1 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropyl-β-D-Thiogalactopyranoside,IPTG)下,以10 g/L乳糖为底物,D-塔格糖产量可达3.93 g/L,对乳糖转化率为0.39 g/g,为理论转化率(0.53 g/g)的74%,高于大多数以乳糖为底物合成D-塔格糖的报道。该研究为D-塔格糖生物合成提供潜在的高效菌株以及多酶级联组装提供有效的工具。

解纤维素热酸菌来源的耐热磷酸酶的酶学性质与应用

卤代酸脱卤酶(HAD)超家族的磷酸酶,其底物谱广泛,催化功能多样,因此鉴别和表征耐热的磷酸酶对于其在生物制品生产中的应用具有重要意义。对解纤维素热酸菌(Acidothermus cellulolyticus)来源的磷酸酶(AcPase)进行研究,将其基因经密码子偏好性优化后,在E.coli Rosetta(DE3)中进行异源表达,并由HisTrap树脂柱分离纯化重组蛋白,研究其酶学性质。结果发现,该酶属于Mg^(2+)依赖型的磷酸酶,最适温度为65℃,最适pH为6.0。AcPase在45~65℃的条件下稳定,在45℃的半衰期为17.4 h,展现出很好的热稳定性。AcPase在50℃下对D-葡萄糖-6-磷酸有较高的催化活性,比酶活为0.68 U/mg。由于AcPase对D-葡萄糖-6-磷酸具有较高的催化活性,笔者进而构建了一个基于该磷酸酶的纤维素磷解多酶催化系统,通过4个酶的体外多酶级联催化将纤维素转化成葡萄糖,底物转化率达到97.6%。该研究通过对一个偏好D-葡萄糖-6-磷酸的磷酸酶的表征,为纤维素完全转化提供了新的研究思路。

Conjugated microporous polymers-scaffolded enzyme cascade systems with enhanced catalytic activity

Enhancing catalytic activity of multi-enzyme in vitro through substrate channeling effect is promis-ing yet challenging.Herein,conjugated microporous polymers(CMPs)-scaffolded integrated en-zyme cascade systems(I-ECSs)are constructed through co-entrapping glucose oxidase(GOx)and horseradish peroxidase(HRP),in which hydrogen peroxide(H_(2)O_(2)) is the intermediate product.The interplay of low-resistance mass transfer pathway and appropriate pore wall-H_(2)O_(2) interactions facilitates the directed transfer of H_(2)O_(2),resulting in 2.4-fold and 5.0-fold elevation in catalytic activ-ity compared to free ECSs and separated ECSs,respectively.The substrate channeling effect could be regulated by altering the mass ratio of GOx to HRP.Besides,I-ECSs demonstrate excellent stabili-ties in harsh environments and multiple recycling.

亮氨酸脱氢酶C端Loop区域的理性设计及多酶级联高效合成L-2-氨基丁酸

亮氨酸脱氢酶(Leucinedehydrogenase,LDH)是制备L-2-氨基丁酸的关键限速酶,针对该酶的Loop区域进行改造以提高关键酶的酶活及稳定性从而高效合成L-2-氨基丁酸。通过亮氨酸脱氢酶的分子动力学模拟分析均方根涨落(Root mean square fluctuation,RMSF)值,对其波动非常明显的Loop区域合理设计以得到比酶活提高的截短突变体EsLDHD2,其比酶活为野生型的123.2%;此外,由于L-2-氨基丁酸制备过程中苏氨酸脱氨酶催化L-苏氨酸制备2-酮丁酸的速率过快导致多酶催化不平衡,因此双拷贝亮氨酸脱氢酶及甲酸脱氢酶以平衡多酶催化速率,构建多酶级联催化的单细胞E.coliBL21/pACYCDuet-RM,其摩尔转化率相较于E.coliBL21/pACYCDuet-RO提高74.6%;对菌株E. coli BL21/pACYCDuet-RM的全细胞转化条件进行优化,其最适pH、温度、底物浓度分别为7.5、35℃和80 g/L,此时摩尔转化率大于99%;在1 L转化体系和最适转化条件下分批加入L-苏氨酸80 g和40 g,L-2-氨基丁酸的产量达97.2g。总之,该策略为L-2-氨基丁酸的制备提供了绿色、高效的合成方法,具有工业化制备药物前体的巨大潜力。