多重不对称PCR探针熔解曲线法在一管中检测多个肥胖易感基因方法的建立

目的针对中国人群4个常见的肥胖易感基因位点(FTO基因rs1421085位点、APOA5基因rs662799位点、FABP2基因rs1799883位点、ADRB3基因rs4994位点),建立一种方便、精准、低成本的检测方法。方法结合前期研究中发现的与中国人群肥胖密切相关的4个基因位点,设计引物对、荧光探针以及对应等位基因的靶序列,通过熔解曲线法,验证荧光探针与对应等位基因的靶序列的工作效果,确认不同基因型的熔解温度。采用PCR-Sanger测序法为金标准,对收集的人唾液样本进行检测,选取12个基因型的样本,开发多重不对称PCR荧光探针熔解曲线法进行检测。随后,使用多重不对称PCR探针熔解曲线法与PCR-Sanger测序法分别对200例志愿者的唾液样本进行基因分型检测,比较两种方法的结果与优缺点。结果多重不对称PCR探针熔解曲线法可以在一管中同时对4个常见的肥胖易感基因位点进行检测,准确度与PCR-Sanger测序法相同,且与PCR-Sanger测序法需有扩增、电泳、纯化、s测序的复杂步骤相比,可在一管中一次完成检测,操作更为便捷,且成本更加节省。结论本研究建立了一种针对4个常见肥胖易感基因位点的方便、精准、低成本的基因分型方法,为人群肥胖易感基因的批量筛查提供了一种有效的检测手段。

荧光定量PCR探针熔解曲线法在结核分枝杆菌耐药基因检测中的应用研究

探讨在结核分枝杆菌耐药基因检测中,对其予以荧光定量PCR探针熔解曲线法,观察分析应用价值。方法 本研究的时长段在2022年6月到2023年6月,统共1000例结核患者接受治疗,所有病患都拓展了抗结核药物的测验,且每一位患者的标本均予以荧光定量PCR探针熔解曲线法检测,药物敏感性测定结果为黄金基准,考察判辨荧光定量PCR探针熔解曲线法对利福平医药品、异烟肼医药品、乙胺丁醇医药品、链霉素医药品的诊断效能。结果 针对1000例的标本中,经过液体药敏试验检测显示对利福平药物耐药例数250例,役使溶解曲线观察耐药性包含了240例患者;对异烟肼医药有耐药性的液体药敏试验500例,应用溶解曲线检测耐药性包含了470例;经过液体药敏试验检测显示对乙胺丁醇药物耐药例数170例,予以熔解曲线法显示耐药140例。经过液体药敏试验检测显示对乙胺丁醇药物耐药例数300例,役使溶解曲线观察耐药性包含了240例患者。熔解曲线法对利福平医药品、异烟肼医药品、乙胺丁醇医药品、链霉素医药品的灵敏度分别为84.00%、84.00%、47.06%、66.67%;特异度分别为96.00%、90.00%、84.34%、94.29%;准确度分别为93.00%、97.00%、91.00%、86.00%。结论 在结核分枝杆菌耐药基因检测中,对其予以荧光定量PCR探针熔解曲线法,可得到较高的应用价值,灵敏度、特异度、准确度较高,可筛查结核病患者对利福平、异烟肼、乙胺丁醇等药物的耐药性,为临床治疗疾病提供可靠的依据。

PCR探针熔解曲线法在对肺结核患者进行结核分枝杆菌耐药基因检测中的应用效果

目的 :探讨PCR探针熔解曲线法在对肺结核患者进行结核分枝杆菌耐药基因检测中的应用效果。方法 :将2018年1月至2018年3月期间在青海省第四人民医院门诊或住院部接受治疗的20例肺结核患者作为研究对象。使用PCR探针熔解曲线法对这20例患者体内结核分枝杆菌对利福平、异烟肼、乙胺丁醇和链霉素的耐药性进行耐药基因检测。然后,以药敏试验的结果为金标准,观察这些患者体内结核分枝杆菌的耐药基因检测结果与利福平、异烟肼、乙胺丁醇和链霉素耐药表型的一致性。结果 :这20例患者体内结核分枝杆菌的耐药基因检测结果与利福平、异烟肼耐药表型的一致性较高,其体内结核分枝杆菌的耐药基因检测结果与乙胺丁醇、链霉素耐药表型的一致性较低。结论 :PCR探针熔解曲线法在对肺结核患者进行结核分枝杆菌耐药基因检测中的应用效果显著,可迅速地筛查出患者体内结核分枝杆菌对利福平等常用一线抗结核药的耐药情况。

基于探针熔解曲线分析技术的非缺失型地中海贫血基因检测方法的建立

目的结合多重不对称PCR技术和荧光探针熔解曲线法,建立一种快速、准确、简便的非缺失型地中海贫血基因检测方法。方法设计针对9个常见非缺失型地中海贫血基因位点(αWSα、αQSα、αCSα、βIVSⅡ654、βCD-17、β-28、βCD41-42、βCD-71-72、βCD-26)的引物对、荧光探针以及对应等位基因的靶序列;使用熔解曲线法验证荧光探针与对应等位基因的靶序列的工作效果,确认不同基因型的熔解温度;使用30份已知基因型别的临床样本,提取全血样本的DNA并PCR扩增其9个等位基因目标片段,利用对应荧光探针的熔解温度变化区分不同位点的基因型;收集疑似地中海贫血病例的血液样本200例,按照双盲对照实验原则,分别用反向斑点杂交法试剂盒和多重不对称PCR探针熔解曲线法对这200例样本进行基因分型检测,比较两种方法的结果是否一致,并对两种方法的优缺点进行比较。结果多重不对称PCR探针熔解曲线法可以同时对9个非缺失型地中海贫血的基因位点进行检测,并通过对应荧光探针的熔解温度的变化区分不同位点的基因型,检测结果与反向斑点杂交法相比较有相同的准确度,且有操作简便、耗时短、成本低、污染风险低等优势。结论本研究建立了一种基于多重不对称PCR探针熔解曲线的基因分型方法,并成功用于9个非缺失型地中海贫血基因位点的诊断,该方法是一种简便、快速、低成本的检测方法,在地中海贫血筛查中有较好的应用前景。

不同原理的PCR方法用于地中海贫血产前诊断的验证应用

目的:评估两种不同技术原理的PCR方法用于地中海贫血(下称"地贫")产前诊断的必要性和可行性。方法 :采用双盲法,对509份产前诊断标本分别采用单管多重PCR法(single-tube multiplex PCR,STMP)+反向点杂交法(reverse dot blot,RDB)、探针熔解曲线法(probe melting curve assay,PMCA)检测常见α-地贫和β-地贫基因突变。两种方法所得结果不一致或少见类型地贫突变时,采用DNA测序分析法确诊。所有产前诊断结果均进行验证或随访。结果 :经STMP+RDB、PMCA检测突变谱不同,α-地贫和β-地贫各有1例结果不同。另STMP+RDB检测灵敏度高于PMCA,其差异性在标本受母血污染时有提示作用。结论:两种不同技术原理的PCR方法进行地贫产前诊断,是必要和可行的,两者具有互补性,可确保结果的可靠性和减少单一技术的缺陷。

2种结核分枝杆菌耐药基因突变检测方法诊断利福平耐药结核病的评估研究

目的评价荧光定量PCR探针熔解曲线法(简称Melt PCR法)和Gene Xpert MTB/RIF技术(简称Xpert法),用于临床涂阳标本诊断利福平耐药结核病(Rifampicin resistant tuberculosis,RR-TB)的检测效能及应用价值。方法随机收集2016年2月至2018年6月在河北省胸科医院就诊肺结核患者结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)涂阳标本278例,应用传统的结核菌比例法药敏试验(对照检测方法)、Melt PCR法和Xpert法同时进行RR-TB情况的检测,分析Melt PCR法和Xpert法检测RR-TB的效能。结果3种方法同时对278例MTB阳性标本的利福平耐药进行检测,耐药检出结果差异无统计学意义(P>0.05)。与传统药敏试验结果相比,Melt PCR法和Xpert法的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、准确度和约登指数分别为97.96%、98.25%、92.31%、99.56%、98.20%、96.21%和95.92%、97.38%、88.68%、99.11%、97.12%、93.30%,Kappa值分别为0.940和0.904(P<0.05),均为高度一致。3种方法在痰液中的利福平耐药均显著高于支气管肺泡灌洗液,且差异具有统计学意义(P<0.05)。不同带菌量样本的利福平耐药检出结果差异无统计学意义(P>0.05)。结论Melt PCR法和Xpert法用于临床涂阳标本中检测RR-TB具有相似的高灵敏度和特异度等检测性能,可结合实际需求在耐多药结核病防治中推广和应用。

海口地区新生儿G6PD基因突变分析

目的了解海口地区新生儿葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)缺乏症的发生率及基因突变特点。方法用荧光斑点法对2016年1月1日至2016年2月24日出生于海口的5 295例新生儿进行G6PD活性筛查,对173例初筛阳性的标本用多色探针荧光PCR熔解曲线法(MMCA)进行基因分型。结果本次筛查发现海口地区新生儿群体的G6PD缺乏症发生率为3.87%(205/5 295),其中男女发生率分别为4.99%(142/2 848)和2.57%(63/2 447)。173例初筛阳性标本中检出142例(82.08%)有基因突变,基因携带率为3.18%(142/5 295/84.39%)。共检出6种基因突变类型,含74例(52.11%)c.1376 G>T,33例(23.24%)c.1388 G>A,13例(9.15%)c.95 A>G,8例(5.63%)c.1024 C>T,4例(2.82%)c.871 G>A,5例(3.52%)c.392 G>T,并检出3例(2.11%)c.1376 G>T复合c.1388 G>A突变、1例(0.71%)c.392 G>T复合c.517 T>C突变、1例(0.71%)c.95 A>G复合c.1388 G>A突变。结论海口地区是G6PD缺乏症高发地区,c.1376G>T、c.1388G>A和c.95 A>G是主要的3种基因突变型。

中国西南三区216例儿童葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症基因型分布和临床特征分析

目的了解葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)缺乏症患者基因突变型在四川(川)、云南(滇)、贵州(黔)三地区的分布情况及临床特征,为该病的临床诊治提供实验室依据。方法对来自川滇黔疑似G6PD缺乏症的汉族患者450例(男342例,女108例),采用多色探针荧光PCR熔解曲线法进行G6PD基因型别检测,并分析基因突变类型与临床表型之间的关系。结果450例可疑样本中,检出215例(男172例,女43例)单基因突变和1例含1388G>A和1004C>A复合型突变。11种单基因突变型所占比例分别为:1388G>A型29.78%;1376G>T型24.65%;1024C>T型22.33%;95A>G型12.09%;871G>A型4.05%;392G>T型2.33%;517T>C型1.39%;487G>T型0.93%;1004C>A型0.93%;1387C>T型0.47%;1360C>T型0.47%。川、滇和黔三地优势基因均为1388G>A、1376G>T和1024C>T型。男女患儿前两位突变位点均为1388G>A(26.7%,41.9%)和1376G>T(26.2%,18.6%),1024C>T(25.0%)居男性患儿第3位,女性第3位则为95A>G(14.0%)。<1岁的患儿以1024C>T(28.0%)、1388G>A(25.6%)和1376G>T(25.0%)型为主,>1岁的患儿以1388G>A(43.1%)、1376G>T(23.5%)和95A>G(15.7%)为主。男性患儿酶活性明显低于女性患儿,各基因突变型在同一性别之间酶活性差异无统计学意义(F=0.680、1.629,P=0.666、0.177)。肝肿大、贫血、黄疸和尿色改变为主要的临床表现,不同基因型与临床表现之间差异无统计学意义(P>0.05)。结论川、滇、黔三地区汉族人群中G6PD缺乏症患儿基因突变型以1388G>A、1376G>T和1024C>T为优势突变基因,呈多样化分布。突变型可能与性别和首次发病年龄有关,各突变型之间没有明显的临床表现和酶活性差异。

鲁东南地区317681例新生儿葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症筛查及基因型调查

目的调查鲁东南地区新生儿葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症的患病率及基因突变类型。方法荧光分析法检测2016年5月—2017年12月在鲁东南地区出生的317681例新生儿葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性,对检测阳性标本,用多色探针荧光PCR熔解曲线法进行基因分型。结果荧光分析法检测出109例阳性患儿,患病率为0.343‰。男性患儿107例,患病率为0.337‰,女性患儿2例,患病率为0.063‰,男患儿的患病率显著高于女患儿。调查并获得患儿母亲的籍贯和民族:汉族母亲97例;壮族母亲4例;黎族和傣族母亲各2例;景颇族母亲1例;另有3例患儿母亲民族不明。山东籍母亲60例;广西籍母亲12例;云南籍母亲10例;广东籍母亲6例;缅甸、贵州和海南籍母亲各3例;江苏、河南、越南和四川籍母亲各2例;柬埔寨、泰国和福建籍母亲各1例。荧光PCR熔解曲线法检测出66例患儿的10种基因突变类型,分别是c.1388G>A、c.1376G>T、c.487G>A、c.1024C>T、c.95A>G、c.1360C>T、c.871G>A、c.592C>T、c.392G>T和c.1004C>A,其中1388G>A(25.8%)、c.1376G>T(21.2%)和c.487G>A(13.6%)是主要的突变类型。结论鲁东南地区G6PD缺乏症患病率较低,基因突变类型及比例有其自身特点,有必要建立本地区基因突变数据库。

利用分子方法鉴别白花蛇舌草及其伪品伞房花耳草

目的:建立一种鉴别白花蛇舌草及其常见伪品伞房花耳草的分子方法,确保临床用药安全。方法:根据白花蛇舌草和伞房花耳草内转录间隔区2(ITS2)序列的差异设计特异探针,采用多重连接探针扩增(MLPA)技术和实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,qPCR)技术,建立了一种能够鉴别白花蛇舌草、伞房花耳草的多重连接探针扩增-实时荧光定量PCR(MLPA-qPCR)方法。结果:对扩增产物进行熔解曲线分析,结果显示,所设计的MLPA探针具有良好的特异性,探针之间不存在交叉反应,白花蛇舌草探针的特异性熔解曲线T_(m)值为(81.8±0.2)℃,伞房花耳草探针的熔解曲线T_(m)值为(84.0±0.2)℃;灵敏度分析结果表明,该方法检出白花蛇舌草和伞房花耳草的最低模板量均为0.1 ng;掺伪检测试验结果表明,当白花蛇舌草探针与伞房花耳草探针比例为1.0∶0.6时,白花蛇舌草中掺杂1%的伞房花耳草仍可被有效检出。对收集的39份样品进行检测,成功鉴别白花蛇舌草25份、伞房花耳草12份、白花蛇舌草与伞房花耳草混合样品2份。结论:本研究所建立的MLPA-qPCR方法特异性强,灵敏度高,可作为鉴别白花蛇舌草及其常见伪品伞房花耳草的特异性鉴别方法。

346例海南黎族新生儿G6PD基因突变分析

为了解海南黎族新生儿G6PD基因突变的流行情况以及为本地区该民族G6PD缺乏症的防治提供参考,本研究对滤纸干血斑进行了G6PD基因突变检测,即用多色探针荧光PCR熔解曲线法对中国人群常见的16种基因突变进行检测。结果表明:在海南黎族667例新生儿样本中检出G6PD基因突变样本346例,总突变率51.9%(346/667),以保亭县黎族的突变率(61.5%)最高,其次是白沙县57.0%、琼中县54.5%。本研究共检出11种G6PD基因突变和3种复合突变,以c.1376G>T、c.1388G>A和c.95A>G这3种基因突变型为主,分别占61.85%、23.41%和4.34%,同时发现1例c.86C>T突变。这说明海南黎族存在G6PD缺乏症的高发人群。海南黎族人群中最常见的G6PD基因突变型是G6PD基因c.1376G>T、c.1388G>A和c.95A>G突变。G6PD基因突变的研究有利于G6PD缺乏症高发地区对新生儿溶血、黄疸、蚕豆病的确诊与防治,并能为此类病情的治疗提供参考数据。

海南省妇女儿童医学中心5246名女性新生儿葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因型与酶活性分析

目的分析海南省妇女儿童医学中心女性新生儿葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)缺乏症的基因突变特点,探讨基因型与酶活性的关系。方法以2017—2019年在海南省妇女儿童医学中心新生儿疾病筛查中心完成G6PD初筛的女性新生儿血样本为研究对象,收集G6PD酶缺乏的干血斑样本2153份,同时为提高女性杂合子的检出率,随机抽取酶活性正常的干血斑样本3093份,共计5246份样本纳入研究。提取脱氧核糖核酸(DNA),采用多色探针荧光聚合酶链反应(PCR)熔解曲线法(MMCA法)检测G6PD基因突变。结果在5246份女性新生儿样本中共检出基因突变2801份,总检出率为53.39%(2801/5246),其中酶活性正常者占26.24%(735/2801)。发现13个突变位点的变异,有32种突变基因型,包括杂合突变型12种,纯合突变型6种和复合突变型14种。前7位最常见的突变位点依次是c.1376G>T、c.1388G>A、c.871G>A、c.95A>G、c.1024C>T、c.392G>T、c.519C>T,其中c.871G>A的检出率高于c.95A>G。同时发现1例罕见的突变位点c.593G>A。女性新生儿中复合突变和纯合突变与严重的G6PD缺乏症有关,它们的酶活性均明显低于单杂合突变的活性(P<0.001),而单杂合突变女性的G6PD活性分布非常广泛,无明显可分辨的界限值。结论海南省妇女儿童医学中心女性新生儿G6PD缺乏症的基因突变型复杂多样,热点突变是c.1376G>T、c.1388G>A、c.871G>A,其中c.871G>A具有海南地区的地域特性和女性特征。结合酶活性检测和MMCA法分析DNA,能有效提高女性G6PD缺乏症的检出率。该研究数据可为基因型和临床表型之间关系的研究以及群体遗传学的研究提供参考。