多重反转录聚合酶链式反应检测H5、H7和H9亚型禽流感病毒的研究

利用多重反转录聚合酶链式反应同时检测H5、H7和H9亚型禽流感病毒.在GenBank中搜索H5、H7和H9亚型禽流感病毒(AIV)的血凝素基因序列,并利用DNAStar软件分析其相似性,利用Primer Premier 5.0软件设计3对分别针对AIV H5、H7和H9亚型的特异性引物.这3对引物所扩增的cDNA片段大小分别为427、228和830 bp.结果表明,通过对多重RT-PCR扩增条件的优化,建立了同时检测H5、H7和H9亚型AIV的多重RT-PCR技术.该多重RT-PCR对H5、H7和H9亚型AIV能同时扩增出3条大小分别为427、228和830 bp的cDNA片段,与其他常见禽病病原的核酸不存在交叉反应.该多重RT-PCR对H5、H7和H9亚型AIV cDNA的最低检出量分别为10 pg、1 ng和10 pg.

多重实时荧光定量聚合酶链式反应在芝麻酱掺假鉴别中的应用

目的研究基于分子生物学技术,建立多重实时荧光定量聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)技术检测芝麻酱中的植物源性成分,实现芝麻酱的快速掺假鉴别,突破单标准单物种检测的局限性。方法该研究以芝麻2S albumim mRNA基因、花生Ara b2基因、大豆Lectin基因、玉米adh1基因设计特异性引物和探针,优化反应体系,建立多重实时荧光定量PCR技术检测芝麻酱中的芝麻源性成分、花生源性成分、大豆源性成分、玉米源性成分,并应用于市售的芝麻酱样本检测分析。结果该方法高效低成本,特异性好,对小米、绿豆等10种非目标源性成分无特异性扩增;对芝麻源性成分、花生源性成分、大豆源性成分、玉米源性成分的最低检出限为100 pg/μL,具有较高的灵敏度;应用建立的方法,对市售21份芝麻酱样本进行检测分析,检测结果与标签标注不符合的有4份,标签标注符合率为80.95%,与参比方法检测结果一致。结论建立的多重实时荧光定量PCR技术对加工成品的检测具有较好的适用性,为芝麻酱的掺假鉴别提供了一种新的分子生物学方法。

双重荧光逆转录-聚合酶链式反应与荧光逆转录-重组酶介导等温扩增快速检测食源性GⅠ型、GⅡ型诺如病毒

目的建立双重荧光逆转录-聚合酶链式反应(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)与荧光逆转录-重组酶介导等温扩增(reverse transcription recombinase-aided amplification,RT-RAA)快速有效地检测食品中食源性GⅠ型和GⅡ型诺如病毒的方法。方法根据GⅠ型、GⅡ型诺如病毒基因组保守序列设计引探,经过一系列引探浓度筛选,建立了双重荧光RT-PCR和恒温荧光RT-RAA两种检测方法,分别从敏感性、特异性、稳定性、重复性等方面进行了比较研究;同时将这两种方法应用于实际临床样本检测中,并与GB4789.42—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验诺如病毒检验》进行比对验证。结果建立的两种方法特异性良好,敏感性均可达10 copies/μL;双重荧光RT-PCR方法质粒梯度变异系数(coefficient of variation,CV)值在0.1%~1.5%区间,恒温荧光RT-RAA方法CV值在1.0%~10.0%区间,稳定性和重复性显示双重荧光RT-PCR优于恒温荧光RT-RAA检测方法;31份诺如病毒阳性食品核酸样本均能检出,且50份食品盲样检测结果与国标一致。结论本研究成功建立了双重荧光RT-PCR与恒温荧光RT-RAA快速检测食源性GⅠ型、GⅡ型诺如病毒方法,两种方法各有优缺点,双重荧光RT-PCR稳定性和重复性好,恒温荧光RT-RAA检测时间短,仅20 min就能完成扩增,可根据不同需求选择一种或两种作为食源性GⅠ型、GⅡ型诺如病毒的检测方法。

H5、H7和H9亚型禽流感病毒多重反转录聚合酶链式反应检测方法的建立

参考GenBank登录的H5、H7和H9亚型禽流感病毒(AIV)的血凝素基因序列,利用DNAStar软件分析其同源性,利用Primer Premier5.0软件设计3对分别针对AIVH5、H7和H9亚型的特异性引物。3对引物所扩增的cDNA片段大小分别为427、228、830bp。结果显示,利用3对引物,通过对多重RT-PCR扩增条件的优化,建立了同时检测H5、H7和H9亚型AIV的多重RT-PCR技术。该方法对H5、H7和H9亚型AIV能同时扩增出3条大小分别为427、228、830bp的cDNA片段,与其他常见禽病病原不存在交叉反应。该方法对H5、H7和H9亚型AIVcDNA的最低检出量分别为10-4、10-2和10-4。结果表明,本试验建立了可同时检测鉴别H5、H7和H9亚型AIV的多重RT-PCR技术。

多重聚合酶链式反应技术检测罗非鱼5种常见食源性致病菌

目的 建立一种可同时检测无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、大肠杆菌(Escherichia coli)和沙门菌(Salmonella) 5种罗非鱼常见食源性致病菌的多重聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)方法。方法 根据5种致病菌特异性基因片段设计并合成引物,优化多重PCR体系条件,并对多重PCR体系的特异性、灵敏度以及人工模拟样品进行检测。结果 建立的多重PCR方法可同时扩增5种目的菌株的特异性条带,且不与非靶标细菌发生交叉反应。敏感性实验结果显示,该方法对无乳链球菌、嗜水气单胞菌、沙门菌、霍乱弧菌、大肠杆菌纯培养物基因组DNA的检出限均为0.4 ng/μL。人工模拟样品检测结果显示,该方法可以快速且准确地检测上述5种食源性致病菌,且检出限可达到2×10^(1)CFU/g。结论 本研究建立了一种可同时检测无乳链球菌、嗜水气单胞菌、霍乱弧菌、大肠杆菌和沙门菌5种罗非鱼常见食源性致病菌的多重PCR检测方法。该方法的建立为罗非鱼常见食源性致病菌的快速检测提供了重要的技术手段。

反转录巢式多重聚合酶链式反应体系检测单细胞中时钟基因表达

目的建立一种高度灵敏的能够在单细胞水平检测时钟基因表达的反转录巢式多重聚合酶链式反应(multiplex nestedreverse transcription-polymerase chain reaction,multiplex nested RT-PCR)体系。方法选取核心时钟基因bmal1,clock,per1,per2,cry1和cry2,以及看家基因β-actin,分别设计和优化巢式引物对。以基因质粒为模板,检测巢式多重PCR体系的灵敏度。体外转录得到各个基因的RNA模板,并检测反转录巢式多重PCR体系的灵敏度。使用手动微操作器,显微镜下负压获取悬浮单个NIH/3T3细胞,使用反转录巢式多重PCR体系检测其中目的时钟基因。应用实时定量PCR检测整体水平时钟基因表达情况,与单细胞水平进行比较。结果巢式多重PCR检测体系可以检测出单拷贝质粒DNA。反转录巢式多重PCR能够检测出4拷贝RNA模板。利用上述体系发现,NIH/3T3单细胞中时钟基因环路表达存在很大差异,同时发现群体水平per1和per2表达的高峰和低谷间差异有统计学意义,而单细胞水平per1表达则差异无统计学意义。结论建立了高度灵敏的用于检测时钟基因表达的反转录巢式多重PCR体系,揭示了单细胞水平时钟基因表达的异质性,也验证了整体水平与单细胞水平时钟基因表达的差异。

鉴别猪瘟强毒和弱毒的反转录-复合套式聚合酶链式反应(RT-nPCR)检测方法的建立

【目的】建立一种能区分猪瘟病毒(classicalswinefever,CSFV)强毒和弱毒的反转录-复合套式聚合酶链式反应(RT-nPCR)检测方法。【方法】根据GenBank上登录的现有CSFV基因组全序列,选择高度保守区设计了一对CSFV通用引物,并在该对引物跨越区域的内部设计了猪瘟兔化弱毒疫苗和强毒特异性引物,建立了一种能区分猪瘟强毒和弱毒的RT-nPCR鉴别诊断方法。【结果】应用该方法从猪瘟兔化弱毒疫苗和石门强毒株基因组中扩增出了大小分别为447和343bp的一条特异性片段,从两种病毒基因组混合物中扩增出了大小为447和343bp的两条特异性片段,但对牛病毒性腹泻病毒和其它常见猪源病毒细胞培养物以及正常细胞基因组进行检测时均为阴性。该方法可以检测出0.04pg的CSFVRNA。对从黑龙江省采集的15份疑似猪瘟病料进行了检测,结果表明,有14份类似猪瘟强毒,1份类似弱毒疫苗。限制性片段长度多态性和种系发生分析证实了RT-nPCR的检测结果。【结论】本研究建立的RT-nPCR可以有效区分猪瘟强毒和弱毒,减少了未感染的免疫猪被误杀的可能性。

逆转录-聚合酶链式反应检测果树RNA病毒

为调查主要果树携带苹果褪绿叶斑病毒 (ACLSV)、苹果茎沟病毒 (ASGV)、苹果茎痘病毒 (ASPV)和李属坏死环斑病毒 (PNRSV)的情况 ,以指示植物为试材 ,优化了四种病毒的逆转录 -聚合酶链式反应 (RT—PCR)检测体系。使用该优化体系检测了苹果树、樱桃树、桃树中携带上述四种病毒的情况。结果 :建立了特异性强、灵敏度高、成本低的RT—PCR检测体系 ;同时又证明主要果树被这几种病毒单独感染和复合感染的程度均较高。

逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测5种养殖石斑鱼的神经坏死病毒

神经坏死病毒(Nervousnecrosisvirus)是导致多种海水鱼类神经性病害的致病原。发病及死亡的石斑鱼除了表现神经异常症状外,无明显的临床病症,体表及内脏组织也未发现明显病变及寄生虫感染。2003年4～8月,应用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术从福建南部人工养殖的5种石斑鱼即紫石斑鱼(Epinepheluslanceolatus)、马拉巴石斑鱼(E.malabaricus)、青石斑鱼(E.awoara)、赤点石斑鱼(E.akaara)和云纹石斑鱼(E.moara)中检出5个神经坏死病毒分离株。检测了76份石斑鱼样品,这些石斑鱼NNV病毒的平均感染率约为90%。对这些病毒的RT-PCR产物421bp核酸进行了测序和序列分析,其相同的序列超过99%。将这些序列与GenBank的石斑鱼(Epinephelusspp.)神经坏死病毒相关基因序列作比较,同源性在97%以上。对神经坏死病毒在石斑鱼体内的分布也进行了分析,在脑和眼组织的检出率最高,部分病鱼的肝、脾和肾组织也能检出病毒。结合流行病学特征,可确认神经坏死病毒为该传染病的主要致病原。RT-PCR方法是检测NNV等病原的一种理想的诊断方法。

反转录聚合酶链式反应检测猪繁殖与呼吸综合征持续性感染

猪繁殖与呼吸综合征感染的特点之一是持续性的感染和病毒血症。本研究利用反转录聚合酶链式反应检测了PRRSV BJ- 4株单独感染 SPF仔猪和接种 PRRSV BJ- 4后再接种猪瘟疫苗不同时间的血清中病毒的存在。结果显示在感染2 4h后的血清样品中就发现有病毒 RNA存在 ,病毒血症至少持续到感染后 37天 ,到第 5 0天时已经消失。 PRRSV BJ- 4感染后再接种猪瘟疫苗的仔猪的 PRRSV病毒血症没有受到影响。这些结果提供了 PRRSV持续性感染的直接证据 ,解释了实际生产中通过引进临床正常但已经感染了猪繁殖与呼吸综合征病毒的猪群造成猪场内病毒的传播和长期感染的存在 。

一种基于多重实时荧光聚合酶链式反应熔解曲线分析的肉及肉制品掺假鉴别方法

为实现肉及肉制品掺假快速鉴别,分别以猪、牛线粒体DNA的COXⅠ,绵羊、山羊、狗、狐狸、貉线粒体DNA的16S rRNA及鸡、鸭线粒体DNA的12S rRNA基因为靶位点,设计扩增产物熔解温度(T_m值)具有显著性差异的特异性引物,建立一种用于快速鉴别肉或肉制品中猪、牛、绵羊、山羊、鸡、鸭、狗、狐、貉9种源性成分的5重实时荧光聚合酶链式反应熔解曲线分析方法,通过特异性、灵敏度及市售样品的检测,对该方法进行检验和评价。结果表明:方法具有良好的特异性及灵敏度,单物种DNA检出限为0.001~1 ng,多物种混合DNA检出限均为0.1 ng,通过市售样品检测表明该方法可用于实际样品(包括生鲜样品和熟制样品)掺假的快速鉴别。

应用反转录聚合酶链式反应快速检测蕃茄环斑病毒

应用反转录聚合酶链式反应快速检测蕃茄环斑病毒陈京，胡伟贞，于嘉林，韩成贵关键词反转录聚合酶链式反应，蕃茄环斑病毒近年来发展起来的分子生物学新技术一聚合酶链式反应（ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ，ＰＣＲ）已在检测和分子生物学研究等许多领...

应用多重聚合酶链式反应检测鸡毒支原体、鸡滑液囊支原体和禽衣阿华支原体的研究

根据鸡毒支原体 (MG)、禽衣阿华支原体 (MI)、鸡滑液囊支原体 (MS)的基因文库 ,设计了 3对分别与MG、MI、MS某段基因序列互补的引物。用这 3对引物对同一样品中的MG、MI、MSDNA模板进行多重聚合酶链式反应 (PCR)扩增 ,结果均同时得到了 3条特异性的大小与实验设计相符的 732bp (MG)、 2 99bp (MI)、 2 0 7bp (MS)多重的PCR扩增带 ,而对其他 6种禽病病原的PCR扩增结果均为阴性 ;敏感性测定结果能同时检出 1pg的MG。

微流控振荡流反转录聚合酶链式反应快速检测烟草花叶病毒

建立了一种基于毛细管的振荡流反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)的微流控装置检测烟草花叶病毒(TMV)的新方法。根据TMV移动蛋白基因设计一对PCR引物,对粗提纯TMV颗粒直接进行RT-PCR。用0.025%小牛血清蛋白(BSA)对反应毛细管内壁进行静力学和动力学钝化,提高了PCR效率。在此微流控装置上进行RT-PCR,流速为70μL/min时,检出限为0.01μg cDNA;可以在17min内成功扩增出179bp的目的DNA片段。

H5和H7亚型禽流感病毒多重反转录聚合酶链反应快速检测及鉴别方法的建立

参考禽流感病毒(AIV)M基因和HA基因序列设计了3对引物,其中1对为针对不同HA亚型AIV的通用引物,另外2对为分别针对AIVH5和H7亚型的特异性引物。这些引物所扩增的cDNA片段大小分别为244、860和634bp。利用这3对引物,通过对多重RTPCR扩增条件的优化,成功建立了快速检测鉴别AIVH5、H7亚型的多重RTPCR技术。特异性和敏感性试验结果表明,该技术对AIVH5亚型同时扩增出2条大小分别为244bp和860bp的cDNA片段;对AIVH7亚型同时扩增出2条大小分别为244bp和634bp的cDNA片段;对AIVH5和H7亚型混合样品能同时扩增出3条大小分别为244、860和634bp的cDNA片段;对其他AIVHA亚型只扩增出1条244bp的cDNA片段;对其他常见禽病病原扩增均为阴性;该多重RTPCR对AIVRNA、AIVH5和AIVH7亚型RNA的最低检出量分别为10、100和100pg。

常见转基因大米数字聚合酶链式反应多重定量检测方法研究

目的建立4种转基因(geneticallymodified,GM)大米成分多重定量检测方法,解决混合转基因产品和多品系杂交的多价转基因产品高通量精准定量难题。方法采用Raindrop微滴式数字聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)方法对4种常见转基因大米TT51-1、克螟稻、科丰6号、M12品系特异性基因和大米蔗糖磷酸合成酶基因逐一进行拷贝数分析,并将其转化为含量百分比。结果转基因含量在0.1%~100.0%范围内的4个品系转基因大米混合样品的定量体系线性关系良好,标准曲线r2值均在0.99以上,定量相对灵敏度可达0.1%,相对误差和相对标准偏差值均小于25%,定量准确性和精密度符合国际通用要求。结论本研究成功建立了4种常见转基因大米成分的多重定量检测方法,解决了常规方法一次只能定量分析单一样品的缺点,为大米、稻谷及其初加工产品中多种转基因成分的高效定量提供了新的技术手段。

检测和鉴别犬瘟热病毒强、弱毒株的复合反转录-套式聚合酶链式反应(RT-nPCR)的建立及初步应用

根据GenBank上登录的犬瘟热病毒(Canine distemper virus,CDV)基因组全序列,选择CDV强、弱毒株间有区别保守区设计了一对通用引物P1和P4,并在该对引物跨越区域的内部设计了CDV强毒株特异性引物P2及弱毒株特异性引物P3,用引物P1/P4进行RT-PCR,然后用引物P2/P3/P4进行复合套式PCR,建立了一种能区分CDV强、弱毒株的复合反转录-套式聚合酶链式反应(RT-nPCR)的鉴别诊断方法。应用该方法从CDV强、弱毒株的基因组中分别扩增出了大小为247bp和177bp的特异性片段,从两种病毒基因组混合物中扩增出了大小为247bp和177bp的两条特异性片段,与犬细小病毒、犬腺病毒、犬冠状病毒、狂犬病病毒、新城疫病毒的细胞培养物以及正常细胞对照组进行复合RT-nPCR扩增时均为阴性。对从黑龙江省和吉林省采集的20份疑似CDV病料进行的检测结果表明,有15份类似CDV强毒,5份类似CDV弱毒。本研究建立的复合RT-nPCR可以有效检测CDV感染,能够将强、弱毒株区分开,可用于临床快速检测、流行病学监测以及追踪疫苗免疫效果等。

多重逆转录聚合酶链反应检测主要上呼吸道病毒

目的 建立用多重逆转录聚合酶链反应 (mRT -PCR)检测甲 1型、甲 3型、乙型流感病毒以及呼吸道合胞病毒 (RSV)A型、B型等主要上呼吸道病毒的方法 ,以快速检测上呼吸道感染主要病毒及对甲型、甲亚型、乙型流感病毒在上海地区人群感染、流行情况调查。方法 采用经MDCK细胞接种培养的甲 3型、乙型流感病毒和Hep - 2细胞接种培养的RSVA型、B型标准毒株病毒液 ,以及甲 1型、甲 3型、乙型流感病毒和RSVA型、B型混合毒株病毒液 ,使用 5组引物 ,分别为HA1- 5a1和HAl- 3a1(甲 1型流感病毒 )、HA3 - 5a1和HA3 - 3a1(甲 3型流感病毒 )、NP- 5b1和NP - 3b1(乙型流感病毒 )、RSVAF和RSVAR(RSVA型 )、RSVBF和RSVBR(RSVB型 ) ,经mRT -PCR ,琼脂糖凝胶电泳 ,于紫外灯下观察上述病毒特异核苷酸条带。结果 甲 1型、甲 3型、乙型流感病毒 ,RSVA型、B型分别在 43 1,2 10 ,3 90 ,3 3 4,183bp处出现清晰的 5条DNA条带。 结论 应用 5组引物 ,mRT -PCR可用于快速检测临床上呼吸道感染标本中的流感病毒和RSV ,并可对其进行分型 。

多重反转录聚合酶链反应快速检测鉴别H9亚型禽流感病毒方法的建立

目的参考AIV M基因和HA基因序列,设计了两对引物。其中XZ145-2和XZ146为通用引物,可以检测所有亚型AIV,跨幅244 bp;XZ H9-1和XZ H9-2为H9亚型特异性引物,跨幅488 bp。方法利用这两对引物,通过对多重RT-PCR扩增条件的优化,成功建立了快速检测鉴别H9亚型AIV的多重RT-PCR技术。结果与结论特异性和敏感性试验结果表明,该技术对H9亚型AIV同时扩增出两条大小分别为244 bp和488 bp的cDNA片段,对其他亚型AIV只扩增出244bp的cDNA片段,对其他常见禽病病原无特异性扩增,结果为阴性;该多重RT-PCR的通用引物对AIV RNA的最低检出量为1pg,对H9亚型RNA的最低检出量为10 pg。

实时荧光反转录聚合酶链式反应检测甲型H1N1流感病毒RNA

目的 快速准确检测甲型H1N1流感病毒,提高流感亚型鉴别诊断水平.方法 采用实时荧光反转录聚合酶链式反应（real-time FQ RT-PCR）检测385例流感患者鼻咽拭子标本和血浆H1N1-RNA.结果 68例患者鼻咽拭子甲型H1N1-RNA阳性率为17.66%,治疗第3、5、7天后甲型H1N1流感患者鼻咽拭子甲型H1N1-RNA阳性阴转率分别为20.51%、66.67%和91.02%,鼻、咽拭子标本检测H1N1-RNA有差异（P〈0.01）,血浆H1N1-RNA检出1例阳性.结论 real-time FQ RT-PCRneng能快速准确检测甲型H1N1流感病毒核酸,有利于早期治疗和疫情控制.