多重实时荧光串联PCR技术高通量检测生蚝中9种致病菌

大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌、铜绿假单胞菌、产气荚膜梭菌、单增李斯特菌和创伤弧菌是贝类食品中常见的食源性致病菌。该文通过设计特异性引物,优化反应参数以建立多重实时荧光串联PCR(multiplexed tandem PCR,MT-PCR)方法,进一步评估方法的特异性和灵敏度,并用于检测生蚝样品。优化后的MT-PCR方法与常规qPCR具有相同定量能力,可同时检测上述9种致病菌。在对混合菌液的检测中,MT-PCR方法的检测灵敏度最低可达10~2 CFU/mL,且此法对其中6种致病菌的检测灵敏度高于qPCR。应用该技术检测人工染菌的生蚝样品,检测灵敏度为10~2~10~3CFU/g。该研究建立的MT-PCR方法可实现高通量、快速准确地检测生蚝中这9种常见的食源性致病菌,对保障食品安全和评估食源性致病菌污染风险具有重要意义。

蜂蜜中转基因成分启动子和终止子的多重实时荧光PCR法检测

为能高效率定位蜂蜜中的转基因可疑阳性样品,以10种转基因启动子和终止子(花椰菜花叶病毒35S启动子(pCaMV35S)、农杆菌的胭脂碱合成酶基因终止子(tNOS)、玄参花叶病毒的35S启动子(p FMV35S)、农杆菌的胭脂碱合成酶基因启动子(pNOS)、玉米泛素基因的启动子(pUbi)、烟草的花蕊特异性TA29的基因发育调节启动子(pTA29)、豌豆二磷酸核酮糖羧化酶基因的终止子(tE9)、章鱼碱合成酶终止子(t OCS)、谷氨酰胺转移酶7终止子(tg7)、花椰菜花叶病毒终止子(tCaMV35S))为研究靶标,进行10种启动子和终止子的引物和探针组合筛选、反应条件优化、灵敏度测定、质控品测试比对等实验,建立3组多重实时荧光PCR反应体系,并将其应用于市售蜂蜜的检测。结果表明:建立的3组多重实时荧光PCR反应体系能精准检出目的基因,其灵敏度分别为0.01、0.04、0.04 ng/μL;14种转基因质控品的测试显示多重实时荧光PCR和单重实时荧光PCR的检测结果一致;40份市售蜂蜜的筛查中,有两份蜂蜜检出pCaMV35S和tNOS,其余未检出,该方法大大提高了检测效率。该方法为蜂蜜中转基因成分的检测提供了快筛快检技术,同时也适用其它产品转基因成分的检测。

基于多重实时荧光定量PCR技术检测高危型人乳头瘤病毒E6/E7 mRNA的临床研究

目的 研究基于多重实时荧光定量PCR技术检测高危型人乳头瘤病毒(HPV)E6/E7 mRNA的价值。方法 选择2022年1月至2022年7月我院进行宫颈癌筛查的患者60例,分别采取多重实时荧光定量PCR技术测定高危型人乳头瘤病毒E6/E7 mRNA情况,并将病理学检查结果作为金标准,分析基于多重实时荧光定量PCR技术检测高危型人乳头瘤病毒E6/E7 mRNA的价值。结果 HPV 16、18、31、33等九类型的最低检测为10 copies/μL,但HPV 51、52、56、58等五类型最低检测是100 copies/μL。另外通过多重实时荧光定量PCR检测高危HPV E6/E7 mRNA和生殖道内常见病原菌例如大肠埃希菌、取淋病奈瑟菌、梅毒螺旋体、金黄色葡萄球菌等,其结果均显示阴性,且检测结果的特异性良好。薄层液基细胞学的检查结果与病理学检查并无差别(P>0.05)。多重实时荧光定量PCR技术的符合率91.67%(55/60),灵敏度83.33%(15/18),特异度95.24%(40/42)。结论 基于多重实时荧光定量PCR技术在HPV E6/E7 mRNA检测中意义重大,存在较高的灵敏度及特异度,可成为宫颈病变筛查的主要方式。

3种常见金银花致病菌多重实时荧光定量PCR检测方法研究

为了建立可同时检测炭疽病病原菌(Colletotrichum gloeosporioides)、白粉病病原菌(Erysiphe lonicera)和褐斑病病原菌(Cercospora rhamni)3种金银花重要叶部病原菌的多重实时荧光定量PCR快速检测方法,本试验基于3种病原菌ITS片段序列分别设计特异引物和TaqMan荧光探针,并制备重组质粒建立标准曲线;对建立的多重实时荧光定量PCR检测方法进行特异性、灵敏度、准确性验证。结果表明,本研究建立的多重实时荧光定量PCR快速检测方法仅针对金银花炭疽病、白粉病和褐斑病病原菌有特异性扩增;最低检测限为2.94×10^(2)copies/μL,比普通PCR法高100倍;利用本方法检测15份有叶部病害症状的金银花病叶,与DNA测序结果完全一致。综之,本研究建立的多重实时荧光PCR检测方法特异性强、灵敏度高,为金银花炭疽病、白粉病和褐斑病的早期诊断提供了技术支持。

肉串制品中猪牛羊源性成分多重荧光PCR检测方法研究

[目的]建立畜类肉串产品中常见的黄牛、绵羊和猪源性成分的多重荧光PCR检测方法,实现肉串制品中动物源性成分的快速鉴别。[方法]比较磁珠法和柱膜法对肉糜组织中DNA的提取效果,优化实时荧光PCR多重检测方法,比较58、60℃2个退火温度下黄牛、绵羊、猪源性成分扩增效果。[结果]试验采用的2种DNA提取方法效果相似,DNA溶液的A_(260)/A_(280)值均能满足PCR检测要求;58℃为最优退火温度,此时黄牛、绵羊、猪源性成分均能有效扩增,且最低检出的DNA浓度均为10^(-3) ng/μL。方法中用到的引物和探针特异性较好,均未产生非特异性扩增。[结论]试验建立的黄牛、绵羊和猪源性成分的多重PCR检测方法能为肉制品中动物源性成分的快速定性分析提供方法参考。

多重耐药基因lsa(E)实时荧光定量PCR检测方法的创新

【目的】创新多重耐药基因lsa(E)实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,qRT-PCR)的检测方法,为lsa(E)基因流行和传播的监测提供参考。【方法】根据GenBank中lsa(E)基因的参考序列设计特异性引物,通过纯化、连接和转化等步骤,提取含有lsa(E)基因片段的重组质粒DNA为标准品进行检测,绘制标准曲线,验证其特异性和重复性,从而对多重耐药基因lsa(E)qRT-PCR检测方法进行创新;使用该检测方法对牛场粪便、土壤、淤泥和卧料等环境样品中lsa(E)基因的拷贝数量和相对丰度进行检测。【结果】该多重耐药基因lsa(E)qRT-PCR检测方法熔解曲线均为平滑单峰,特异性强;扩增效率良好(101.56%);标准曲线呈现良好的线性关系(r^(2)≥0.997);检测拷贝数量范围广(1.71×10^(2)~1.71×10^(8) copies·μL^(-1))且灵敏度高,组内组间变异系数范围为0.45%~1.66%,重复性强;使用该方法检测牛场环境样品,lsa(E)基因拷贝数量范围为2.54×10^(4)~1.52×10^(8) copies·μL^(-1),相对丰度范围为9.39×10^(-4)~1.20×10^(3),而普通PCR方法仅能在拷贝数量大于1×10^(6) copies·μL^(-1)的环境样品中检测到lsa(E)基因。【结论】本研究创新了多重耐药基因lsa(E)的qRT-PCR检测方法,特异性强,灵敏度高,检测范围广,且能应用于不同养殖环境样品(粪便、土壤和淤泥等)中lsa(E)基因的定量检测,为lsa(E)基因流行和传播的监测提供技术支持和理论指导。

多重实时荧光PCR TaqMan-MGB杂交探针标记法快速鉴定转基因玉米MIR162

为对转基因玉米MIR162的进口实行监测、规范转基因玉米在国内市场中的流通,建立一种转基因玉米MIR162准确快速的检测方法,通过设计转基因玉米MIR162品系特异性序列的引物和探针,摸索和优化多重荧光PCR体系和参数,开发建立多重实时荧光PCR TaqMan-MGB杂交探针标记法快速鉴定转基因玉米MIR162。结果表明,转基因玉米MIR162品系标准品和平行样品中内标基因和品系特异性基因均出现明显扩增曲线,其他转基因玉米品系标准品仅内标基因有扩增曲线,空白对照无扩增曲线,说明该TaqMan-MGB探针对转基因玉米MIR162品系具有扩增特异性。该方法可作为鉴定筛查转基因玉米MIR162品系及其转化体成分的有效方法,用于规范管理转基因产品在市场上的流通。

基于实时荧光定量PCR的番木瓜多重PCR高效检测方法

以pCaMV35S基因核酸检测试剂盒反应体系为基础,添加多重PCR反应所需的目标基因引物和番木瓜(Carica papaya L.)DNA,进行多重PCR反应,同时考察不合成荧光探针的情况下对目标基因进行实时荧光定量检测。结果表明,在实时荧光定量PCR反应体系中,多重PCR扩增的基因条带比常规PCR扩增的基因条带更亮,在不合成荧光探针的情况下实现目标基因的实时荧光定量PCR反应,以期建立一种基于实时荧光定量PCR的多重PCR检测方法。

禽流感H5、H7、H9亚型多重实时荧光RT-PCR检测方法的建立

为了对致病性强、危害性大的H5、H7、H9亚型禽流感病毒进行同时集成化快速检测,通过对GenBank已报道的禽流感病毒的HA基因进行序列分析比较,设计了H5、H7、H9 3个亚型的特异性引物和分别用3个荧光基团标记的Taqman MGB核酸探针。将各个亚型引物与探针优化组合,筛选出能够同时检测禽流感病毒H5、H7、H9 3个亚型、且对Ct值和扩增效率影响不大的3组引物和探针,建立了三重实时荧光RT-PCR方法。该方法特异性好,在我们检测的样品中,没有发现假阳性和假阴性现象。同时敏感性高,检测禽流感病毒H5、H7、H9亚型的敏感性分别达到1 0001、000、500个模板拷贝数;此外抗干扰能力强,对禽流感H5、H7、H9 3个亚型的不同模板浓度进行组合,仍可有效地同时检测3个病毒亚型。所建立的方法对保存的89个禽流感病毒样品进行检测,结果与经典检测方法(病毒分离鉴定、HA、HI)的符合率达100%。用上述建立的方法与鸡胚分离法同时对新鲜采集的4 000多份临床样品进行检测,两种方法的检测结果符合率为100%。

应用含内参的多重实时荧光RT-PCR方法快速检测登革病毒和基孔肯雅病毒

目的建立一种登革病毒、基孔肯雅病毒并含人类基因内参检测的多重实时荧光RT-PCR方法,能在同一反应管内同时检测目前发现的所有来源的登革病毒或基孔肯雅病毒。方法针对登革病毒3′端非编码区和基孔肯雅病毒结构蛋白E2-6K-E1区以及人体各类组织细胞中均能稳定表达的RNAse P基因,设计了3套特异性引物和探针,建立了1套能同时检测登革病毒、基孔肯雅病毒及含有人类基因检测内参的多重实时荧光RT-PCR方法,对其灵敏性和特异性进行了验证,并对临床发热病人标本进行了应用评估。结果该方法对检测体外转录合成的登革病毒和基孔肯雅病毒RNA的灵敏性可达最低每个反应10～100拷贝,对检测登革1型病毒和基孔肯雅病毒的灵敏性分别可达最低每个反应0.1TCID50/mL和1TCID50/mL。用20株登革病毒、4株基孔肯雅病毒和日本脑炎病毒、西尼罗病毒、黄热病毒、盖塔病毒、辛德毕斯病毒各1株进行检测,方法的特异性均为100%。方法应用于189份发热病人血清标本检测,可准确地鉴定出其中登革病毒或基孔肯雅病毒核酸阳性的标本,且所有血清标本均能被内参引物和探针有效地扩增和杂交。结论本研究建立了一种高灵敏性、高特异性且含人类基因内参检测的登革病毒和基孔肯雅病毒多重实时荧光RT-PCR检测方法,可作为登革热或基孔肯雅热病人早期快速鉴别诊断的有效工具,也可用于蚊媒携带登革病毒或基孔肯雅病毒的高通量快速筛查。

PRRSV和PCV-2以及PRV多重SYBR Green-Ⅰ实时荧光PCR检测方法的建立

根据GenBank中登录的猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)N蛋白基因、猪圆环病毒2型(PCV-2)rep蛋白基因和猪伪狂犬病病毒(PRV)gE基因的核苷酸序列分别设计了3对特异性引物,成功建立了同时检测PRRSV、PCV-2、PRV的多重SYBR Green-Ⅰ实时荧光PCR方法。敏感性试验结果显示,PRRSV、PCV-2的敏感性可达250拷贝/μL,PRV的敏感性可达500拷贝/μL。表明,该方法具有较好的特异性、重复性和敏感性,可以用于PRRSV、PCV-2和PRV的快速检测。

应用多重实时荧光PCR方法对8种动物毛纤维种类鉴别的研究

本研究旨在利用多重实时荧光PCR方法对水貂、狐狸、骆驼、兔、山羊、绵羊、鸭和鹅8种动物毛纤维进行物种鉴定研究。利用碱裂解法加入二硫苏糖醇,并结合硅珠吸附核酸法来优化动物毛纤维DNA的提取;根据8种动物16S rDNA基因特异核苷酸序列设计通用PCR引物和特异性TaqMan荧光探针;通过优化引物和探针浓度及退火温度等PCR反应体系和条件,建立了多重实时荧光PCR检测体系;并对多重PCR体系的特异性、灵敏度、重复性和适用性进行评估。结果表明,使用SDS-二硫苏糖醇DTT-蛋白酶K结合Chelex-100法,并利用硅珠纯化提取动物毛纤维DNA效果最佳,满足实时荧光PCR检测要求。本方法 DNA灵敏度为0.01ng,混合样本方法检出限为1.0%。因此本方法能够从动物毛纤维提取高质量DNA,建立的多重实时荧光PCR检测体系具有特异性强、重复性好和灵敏度高等优势。本方法可用于水貂、狐狸、骆驼、兔、山羊、绵羊、鸭和鹅8种动物及其混合物毛纤维的鉴定,为拓展动物毛纤维在物种识别、分子进化研究、分子标记辅助育种和遗传资源评价等领域中的应用奠定基础。

食源性致病菌多重实时荧光PCR检测扩增内标的构建及评价

多重实时荧光PCR在食源性致病菌检测中具有重要的作用,扩增内标(IAC)可用来指示其检测过程中可能出现的假阴性检测结果。采用来源于人类腺病毒基因的一段序列设计IAC,并对其检测特异性、扩增效率以及与目的致病菌基因组DNA的抗干扰扩增能力进行了评估。结果表明,本IAC引物在供试菌株中均没有非特异性扩增结果,扩增效率达99.44%,而且对供试沙门氏菌(Salmonella spp.)、大肠杆菌O157:H7(Escherichiacoli O157:H7)以及单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)的多重实时荧光PCR扩增没有任何干扰,在食源性致病菌多重检测技术的建立中具有广泛的应用前景。

肉制品中牛源性成分多重实时荧光PCR检测方法的建立及初步应用

目的建立肉制品中牛源性成分的荧光PCR检测方法。方法根据牛特异性线粒体DNA片段,设计合成两对引物,以生、熟牛肉及超市牛肉加工品为材料,建立肉制品中牛源性成分的多重实时荧光PCR检测方法,并用该法与国标法同时对市售的25份肉制品同时进行检测,通过对其他种类的肉源DNA进行扩增验证方法的特异性;对含有不同比例牛肉成分的DNA样本进行检测确定检出限。结果该方法可成功检测出肉制品中的牛源性成分。在25份肉制品检测中,与国标法检测结果一致。该法的特异性为100%,灵敏度检测线为1%。结论本研究成功建立牛源性肉制品的检测方法,该方法快速简便,且具有较高的特异性和灵敏度,可用于市售肉制品中牛源性成分的鉴定。

转基因食品多重定性PCR及实时荧光定量PCR检测方法的研究

多重PCR方法是建立在传统PCR检测技术基础上的快速简便的检测手段。本研究以国际市场上转基因食品的主流产品转抗除草剂大豆 (RR大豆 )、Bt176玉米及我国自行研发的抗菌肽辣椒为材料 ,以多重PCR方法为基础 ,通过基因片段筛选及引物比例调整 ,进行了转基因食品的调控元件、外源结构基因及物种内源特性基因三种片段的单管同时扩增。结果与常规PCR方法检测结果完全相符。同时 ,针对RR大豆 ,对几类大豆产品运用实时定量PCR方法进行定量分析 ,得到相应的转基因成分的含量。操作简便快速 ,检测结果与标准相符 ,检测灵敏度较常规PCR更高。

应用多重实时荧光PCR检测蜡样芽胞杆菌毒力基因

目的:建立一种快速、准确、简便的蜡样芽胞杆菌毒力基因检测方法,为蜡样芽胞杆菌更深入的研究提供依据和便利。方法:采用Taq Man探针法设计了三重hbl A,hbl C,hbl D基因,三重nhe A,nhe B,nhe C基因,三重ces,ent FM,bce T基因的多重实时荧光PCR体系检测蜡样芽胞杆菌毒力基因。结果:多重体系对蜡样芽胞杆菌毒力基因的检测具有良好的特异性和灵敏性,其最低检出限为63 CFU/m L。结论:利用上述体系对蜡样芽胞杆菌的毒力基因进行检测能够省时省力,特异性、灵敏性良好,具有实际应用价值。

化妆品中动物源性成分多重实时荧光PCR检测方法的研究

使用优化的Chelex-100结合玻璃奶法提取膏状、液态和固态化妆品中的动物源性DNA;根据驴、马和牛线粒体16S rRNA基因序列设计通用引物和特异性探针,建立了一次性检测化妆品中驴、马和牛3种动物源性成分的多重实时荧光PCR体系,检出限均为0.001 ng。并对市售的面霜、洗面奶和面膜进行盲样检测,验证了体系的可靠性和准确性。

一种从羊奶中检测牛奶和大豆成分多重实时荧光定量PCR方法的建立

羊奶制品因其良好的营养功效备受消费者的青睐,也是乳制品主要掺假对象。本研究参考市场可能掺假现状,分别根据羊和牛线粒体基因组16S rRNA基因序列和大豆的KTi-S基因(GI:510514)序列,设计一对牛和羊特异性引物、一对大豆特异性引物以及相应的Taq Man-MGB探针,建立羊奶中牛奶和大豆成分多重实时荧光定量PCR检测方法,并引入内标质控有效保证检测体系的准确性。本检测体系对羊奶、牛奶及豆浆的基因组DNA检测敏感度为0.01 ng;对羊奶中掺入牛奶和豆浆的体积掺假检测灵敏度均为0.1%。因此,本研究建立的羊奶中牛奶和大豆成分多重实时荧光定量PCR检测体系具有通量大、灵敏度高、特异性好等优点,实现了对羊奶中其他源性成分快速、准确的检测,对保障相关产品市场安全具有重要意义。

改良多重实时荧光定量PCR检测流感A型和B型病毒

目的：建立改良多重实时荧光定量PCR体系快速检测流感A型和B型病毒。方法根据生物信息学分析结果选定流感A型和B型病毒的靶序列，建立MRT－PCR检测体系。构建质粒标准品，评估所建立体系的灵敏度、特异性和重复性。结果成功建立了基于同源加尾系统和Taqman－分子灯标探针的改良多重实时荧光定量PCR检测体系；该方法最低检测限为102 copies／μl，特异性良好，重复性良好，变异系数（CV）为0．99％～2．50％。结论建立了快速、敏感、特异、稳定地改良多重实时荧光定量PCR（ MRT－PCR）检测体系，具有良好的临床应用前景。

长沙市食品从业人员致泻大肠埃希菌实时荧光多重PCR检测结果分析

目的了解长沙市食品从业人员致泻大肠埃希菌感染、分布及毒力基因携带情况。方法抽取长沙市9个单位258例食品从业人员为研究对象,采用实时荧光多重聚合酶链反应(PCR)检测致泻大肠埃希菌。结果致泻大肠埃希菌感染率为15.5%(40/258),其中肠聚集性大肠埃希菌(EAEC)占10.9%(28/258),肠致病性大肠埃希菌(EPEC)占3.1%(8/258),肠出血性大肠埃希菌(EHEC)占1.6%(4/258),未检出肠侵袭性大肠埃希菌(EIEC)和肠产毒性大肠埃希菌(ETEC)。28株EAEC携带uidA基因26株,aggR+pic基因13株,astA基因27株,携带率分别为92.9%、46.4%、96.4%;8株EPEC全部携带eae和uidA基因;4株EHEC中3株携带eae基因,且都携带stx1+stx2基因。结论建立持续监测致泻大肠埃希菌的机制和深入研究其分子流行病学理论,除了为监管部门制订和评价公共卫生措施提供基础数据,对评价食品安全状况,有效控制传染源、保护人民群众健康具有重要意义。