多重富集定量PCR(ME-qPCR)同时检测4种食源性病原弧菌

【目的】溶藻弧菌、副溶血弧菌、创伤弧菌、霍乱弧菌是4种重要的食源性病原弧菌,能够造成人类多种疾病,建立同时检测这4种食源性病原弧菌的检测方法是保障食品安全的基础。本研究旨在建立同时检测溶藻弧菌、副溶血弧菌、创伤弧菌、霍乱弧菌的多重富集定量PCR(multiplex enrichment quantitative PCR,ME-q PCR)方法,并含扩增内标用于指示PCR反应的假阴性,创新一种高通量、高灵敏度、具备定量能力的检测方法,为这4种食源性病原弧菌的检测提供新方法。【方法】以细菌16S r RNA为扩增内标靶序列设计引物,并针对副溶血弧菌的collagenase、溶藻弧菌的gyr B、霍乱弧菌的omp W、创伤弧菌的vvh A,分别设计内、外2对特异性引物,首先将所有内、外引物混合,进行一个循环数较少(10—20 cycles)的高通量多重富集PCR将靶基因富集出来,由于循环数较少,各个基因得到均匀的扩增,每个基因均有4种可能的产物,每1种产物均能作为第二轮巢氏荧光定量PCR的模板,这增加了靶基因从模板中被富集出来的概率,然后将产物稀释后作为模板,利用内引物分别进行巢式荧光定量PCR检测各个基因,最后根据扩增曲线和熔融曲线分析结果。通过设置不同的第一轮多重富集PCR循环数(10、15和20个循环),优化ME-q PCR第一轮循环数。采用14株标准菌株的基因组DNA作为模板,评价ME-q PCR的特异性。并以4种弧菌基因组DNA混合物梯度稀释的样品(100、10、1、0.1、0.01和0.001 ng·μL-1)作为模板,对建立的ME-q PCR进行灵敏度和定量能力的评价。并将该方法应用于已分离到的69株疑似弧菌菌落的鉴定中,与传统生理生化鉴定结果进行对比。【结果】优化后,ME-q PCR的第一轮循环数确定为15,特异性评价结果显示该方法特异性强,灵敏度达0.001 ng,高于普通荧光定量PCR约1个数量级,并能有效指示PCR反应的假阴性,且拥有与普通荧光定量PCR相同的定量能力,扩增效率和R2符合定量的要求;将建立的ME-q PCR方法应用于69株疑似弧菌菌株的鉴定,24个绿色菌落为副溶血弧菌,22个黄色菌落为溶藻弧菌,1个黄色菌落为创伤弧菌,没有检出霍乱弧菌,其结果与生理生化鉴定结果一致。【结论】该方法能够定量、快速准确地检测副溶血弧菌、溶藻弧菌、霍乱弧菌和创伤弧菌这4种食源性病原弧菌,灵敏度高,并能有效指示PCR反应的假阴性,结果无需凝胶电泳,适用于食品中4种常见病原弧菌的快速筛检。

多重富集低NO_x燃烧器及其在65t/h锅炉上的应用实践

介绍了一种新型多重富集低NOx燃烧器的结构原理及其在一台65t/h锅炉上的应用情况。应用结果表明,该燃烧器保持了多重富集燃烧器的优良着火稳燃特性,并且有很好的低NOx燃烧性能。与原来的燃烧器相比,采用这种新型燃烧器后,炉膛结焦现象有所改善,飞灰含碳量略有下降,排烟温度没有明显变化。

多重（级）富集是工业富铁矿形成的核心机制──兼论长江中下游铁矿找矿

根据地质找矿实践结果和统计资料，证明我国多重（级）富集是工业富铁矿形成的核心机制，如：１．我国富铁矿的主要类型为矽卡岩型（接触交代－热液型）、多因复合－叠加型及火山岩型；２．以上三种类型铁矿探明富矿占全国富矿资源量的８９％。同时本文还简单阐述了长江中下游铁矿找矿的几个问题：１．铁矿类型；２．产出地区；３．地表矿化现象；４．弱磁异常及复杂磁异常。

靶序列富集多重PCR技术的发展及其应用

靶序列富集多重PCR(target enriched multiplex PCR,Tem–PCR)作为一种新型的分子生物学高通量检测技术,通过靶序列富集、靶序列加标签以及超级引物扩增3个阶段实现对靶标序列的大量扩增。靶序列富集多重PCR具有独特的反应过程,克服了常规多重PCR扩增条件不兼容、扩增具有偏爱性等缺点,实现了对同一反应体系多种病原的同步检测,为临床病原鉴别诊断、基因分型、耐药基因等领域的研究提供了新思路,具有较大的发展前景。笔者对Tem–PCR的研究背景、反应原理、技术应用及试剂盒开发等进行综述,旨在为Tem–PCR的研究和发展提供参考依据,为中国应对公共卫生危机提供新思路。

靶序列富集多重PCR-液相芯片联合检测4种常见呼吸道病毒的初步应用

目的呼吸道病毒是引起婴幼儿呼吸道感染的最主要病原体,为快速准确诊断其感染,文中建立一种基于液相芯片系统的4种常见呼吸道病毒快速分子检测方法,为有效防控其发生和流行提供有力手段。方法采集南京总医院儿科就诊的有急性呼吸道感染症状的患儿咽拭子标本120例及30例正常对照标本,分别纳入患儿组和对照组。针对A型流感病毒(Flu A)、B型流感病毒(Flu B)、呼吸道合胞病毒A型(RSVA)和B型(RSVB)的保守区序列分别设计并合成了特异性引物、探针和通用引物,构建4种病原体阳性参比品,通过对扩增和杂交条件的优化,建立了靶序列富集多重PCR(Tem-PCR)和Luminex液相芯片(x MAP)技术相结合的检测系统,并对该检测系统进行了特异性、灵敏度评价。收集以急性上呼吸道感染为主要表现的患儿咽拭子标本,用上述建立的方法进行检测分析,分别与单病毒基因荧光定量PCR检测方法及x TAG液相芯片法进行比对检测。结果建立了Flu A、Flu B、RSVA和RSVB4种呼吸道病毒的特异性快速分子检测方法且灵敏度可达10拷贝/μL。用快速分子检测方法和单病毒基因荧光定量PCR法对120例疑似患儿咽拭子标本进行检测,快速法阳性检出率为31.7%(38/120),荧光定量法阳性检出率为29.2%(35/120)。经一致性检验分析提示2种方法一致性较强(k>0.7)。部分标本同时采用x TAG液相芯片试剂盒进行检测,经一致性检验分析提示2种方法一致性较好(k>0.6)。结论临床的初步应用证实了4种常见呼吸道病毒快速分子检测方法具备灵敏、特异、快速等优点,为临床早期、准确判断呼吸道感染的病原体提供实验依据。

靶序列富集多重PCR结合DHPLC同时检测5种食源性致病菌

目的建立同时检测沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、大肠埃希氏菌O157、金黄色葡萄球菌和志贺氏菌5种食源性致病菌的简便、灵敏的高通量方法。方法根据GenBank公布的5种致病菌的特异性靶基因序列,设计5对特异性引物,与通用引物连接构成复合引物。经过反应条件的优化,建立了5种致病菌的靶序列富集多重PCR(target enriched multiplex PCR,Tem-PCR)扩增方法,扩增产物采用变性高效液相色谱(denaturing high-performance liquid chromatography,DHPLC)技术进行检测。结果采用Tem-PCR-DHPLC方法,检测48株试验菌株,未发现非特异性结果。对5种致病菌检测灵敏度,除金黄色葡萄球菌为620 cfu/mL外,其余都小于100 cfu/mL。对4种样品的检测结果与国家标准方法相符合。结论 Tem-PCR-DHPLC检测方法,相比传统多重PCR方法,能有效地解决引物扩增效率不均衡的问题,不需优化引物浓度,方法特异性强,灵敏度高,具有较好的实用性。

多重PCR靶向富集结合高通量测序在子宫内膜癌MMR基因突变筛查中的应用

目的探讨多重PCR靶向富集结合高通量测序在子宫内膜癌MMR基因的突变筛查中的应用。方法选择86例豫西地区子宫内膜癌患者的血液为研究对象,提取样本基因组DNA,应用多重PCR扩增技术靶向富集MMR基因的外显子序列,构建文库后采用高通量测序技术检测分析子宫内膜癌患者中的MMR基因突变情况,采用Sanger测序法验证高通量测序结果,并对有无家族史患者的复发例数、复发时间进行分析统计,对中位无瘤生存时间进行统计。结果86例样本中发生MMR基因突变的共有66例,总突变率为76.8%,共发现12种非同义单核苷酸变异(SNV)和2种同义SNV。Sanger测序验证结果与新一代高通量测序结果一致。随访结果表明,不同年龄段的中位复发时间差异无统计学意义(P>0.05);有家族史组复发率明显高于无家族史组(P=0.003);无家族史组、有家族史组中位无瘤生存时间分别为(52.33±0.58)月、(36.33±1.21)月,差异具有统计学意义(P<0.001)。结论多重PCR靶向富集结合高通量测序技术用于MMR基因的突变检测成本低、速度快、通量高,可用于对EC高风险女性的早期筛查,从而为EC临床规范化治疗提供更多资料。

我国燃煤电站锅炉NO_x排放的现状分析和应对措施

分析了我国电站锅炉NOx排放的现状,讨论了将低NOx燃烧器(LNB)与空气 燃烧分级相结合,以减少NOx排放的可行性。以清华大学最近开发成功的多重富集型LNB的结构原理和实践为例,阐述了LNB燃烧器的设计原则,强调了应当以系统的观念解决锅炉NOx的排放;分析了三次风对NOx排放的影响,指出现有三次风的使用和布置不利于降低NOx的排放,并对我国电站锅炉实现低NOx排放的研究工作提出了一些建议。

靶序列富集多重聚合酶链式反应在儿童细菌性肺炎病原体检测中的应用

目的分析靶序列富集多重聚合酶链式反应(Tem-PCR)在儿童细菌性肺炎病原体检测中的价值,为临床诊治工作提供客观研究依据。方法选取2015年6月-2016年6月212例社区获得性肺炎(CAP)患儿作为研究对象,采集所有纳入患儿的呼吸道深部吸引物,分别对其进行细菌培养和Tem-PCR检测。结果有123例患儿的呼吸道分泌物标本细菌培养检出病原菌,检出率为58.0%,共检出病原菌127株,其中,革兰阴性菌和革兰阳性菌分别占76.4%和23.6%,主要病原菌为流感嗜血菌、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌,分别占20.5%、14.2%、12.6%;有85例患儿的呼吸道分泌物标本Tem-PCR检测呈阳性,阳性率为40.1%,共检出105株病原菌靶基因,其中,流感嗜血菌、肺炎链球菌、鲍氏不动杆菌的比例最高,分别占40.0%、38.1%、10.5%;Tem-PCR检测对流感嗜血菌、肺炎链球菌、鲍氏不动杆菌、金黄色葡萄球菌等的诊断特异度均较高,对肺炎链球菌、铜绿假单胞菌的诊断敏感度和Youden指数均较高。结论 Tem-PCR检测在儿童CAP特定病原菌的早期诊断中具有一定的应用价值,可作为细菌感染性CAP病原学诊断的辅助手段。

4种常见呼吸道病毒快速分子检测方法的建立

目的建立一种基于液相芯片系统的4种常见呼吸道病毒快速分子检测方法,为有效防控其发生和流行提供有力手段。方法针对A型流感病毒(influenza A virus,FluA)、B型流感病毒(influenza B virus,FluB)、呼吸道合胞病毒A型(respiratory syncytial viruse types A,RSVA)和B型(respiratory syncytial viruse types B,RSVB)的保守区序列分别设计并合成了特异性引物、探针和通用引物,构建4种病原体阳性参比品,通过对扩增和杂交条件的优化,建立了靶序列富集多重PCR(target enriched multiplex PCR,Tem-PCR)和Luminex液相芯片(xMAP)技术相结合的检测系统,并对该检测系统进行了方法学评价。结果该检测方法可以特异性区分4种病毒的RNA靶标分子,检测下限均为10拷贝/μl。结论该种基于液相芯片系统的新方法灵敏度高、特异性好,为实现在临床呼吸道样品中同时快速检测4种常见呼吸道病毒提供了技术基础。

分子鉴别诊断领域的革命性技术——Tem-PCR

分子鉴别诊断由于其高效、快速的特点,在公共卫生领域和个体化医疗中将发挥越来越重要的作用。分子鉴别诊断需要敏感、特异、可靠的多重扩增技术作为支撑,靶序列富集多重PCR(Tem-PCR)正是这样一项技术,能在一个反应体系中同时对多种靶基因高度敏感和特异的扩增,为分子鉴别诊断在应对公共卫生危机、食品安全、病毒分型、细菌耐药性分析和个体独特型遗传背景检测等方面的应用带来革命性变化。

应用Tem-PCR技术同时检测3种致病菌的研究

应用靶序列富集多重PCR(target enriched multiplex PCR,Tem-PCR)技术建立同时检测沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、大肠埃希氏菌O157三种致病菌的高通量简易检测方法.实验分别以沙门氏菌的inv A基因、单核细胞增生李斯特氏菌的hly基因、大肠埃希氏菌O157 rfb E基因为靶基因,设计3对特异性引物,并与通用引物连接组成Tem-PCR引物,通过反应条件优化,建立了TemPCR检测方法.结果表明,建立的Tem-PCR方法特异性强,其检测灵敏度分别为沙门氏菌1.1×103CFU/m L、单核细胞增生李斯特氏菌5.6×102CFU/m L、大肠埃希氏菌O157 2.3×103CFU/m L.方法不需要优化调整各引物对的浓度,易于使用,有效地解决了传统多重PCR方法扩增效率不均衡的问题.

一种新型同时检测6种猪病毒病简化靶序列富集多重PCR的建立和初步应用

为建立一种新型同时检测6种猪常见病的方法,针对猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪乙型脑炎病毒(JEV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪细小病毒(PPV)的保守基因,设计6对特异引物,在引物的5′端加上一段非同源性标签序列,再设计1对可识别标签序列的超级引物。通过优化反应条件,建立了6种猪常见病毒的简化靶序列富集多重PCR(Tem-PCR)检测方法。灵敏度试验结果显示,该方法对PRV、JEV、CSFV、PCV2、PRRSV、PPV核酸的最低检测限度分别为4.36×103、2.21×103、2.69×103、3.18×103、2.63×104、3.12×104copies/L,而单重PCR检测的最低限度分别为1.3×101、2.59×102、8.03×101、3.29×101、2.65×101、2.45×102copies/L。该方法对54份临床样本的检测结果与国标单重PCR检测结果的一致性为94.9%。本试验建立的方法特异、灵敏、操作简便且成本低廉,对这6种猪病常见病原的同时检测有一定的参考意义。

3种食源性致病菌Tem-PCR检测方法的建立

应用靶序列富集多重聚合酶链式反应（t arget-enriched multiplex-polymerase chain reaction,Tem-PCR）技术建立金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和志贺氏菌3种食源性致病菌的快速检测方法。分别以金黄色葡萄球菌fem A基因、沙门氏菌inv A基因和志贺氏菌ipa H基因为靶基因,设计3对特异性引物,并与通用引物连接组成Tem-PCR引物,通过反应条件优化,建立了Tem-PCR检测方法。结果显示,建立的Tem-PCR方法特异性强,对沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和志贺氏菌的检测灵敏度分别为1.1×10^3、2×10^3 CFU/m L和1.2×10^3 CFU/m L。Tem-PCR检测方法有效地解决了传统多重PCR引物扩增效率不均衡的问题。

MRSA在ICU分布情况调查与随机扩增多态性DNA同源性分析

目的:监测ICU医护人员、住院患者,及环境中MRSA的携带及分布情况,以提出针对性预防与控制措施。方法:对本院ICU的20位医护人员、8例住院患者的手、咽和鼻前庭等部位,及ICU环境中的物体表面和空气同时进行采样,采用免疫富集-显色培养基分离MRSA,应用VITEK 32全自动微生物分析仪进行菌种鉴定和药敏试验;对MRSA进行随机引物扩增多态DNA检测并进行同源性分析;比较MRSA的耐药谱分型和随机扩增多态性DNA基因分型之间的差异,判断医护人员、住院患者及环境中分离的MRSA的相关性。结果:共检出31株MRSA,20位医护人员11位检出15株MRSA,8位患者5位检出9株MRSA,分离于同一个体不同部位的重复分离株经随机扩增多态性DNA同源性分析均为同一克隆菌株。52份环境物体表面检出7株MRSA。根据随机扩增多态DNA聚类分析可以将检出的MRSA分为3个类型。结论:医护人员MRSA带菌率较高,部分医务人员、住院患者和环境中分离的MRSA有较高的同源性,ICU存在人与人和人与环境之间的MRSA传播。