多重寡核苷酸连接-聚合酶链式反应-通用基因芯片检测食源性致病菌方法的建立

目的建立一种基于多重寡核苷酸连接-聚合酶链式反应(MOL-PCR)的食源性致病菌通用基因芯片检测方法。方法针对细菌性食物中毒8种常见致病菌,在各自特异性引物之间设计一对首尾相接的上、下游检测探针。采用多重PCR富集靶序列并作为模板,通过多重连接酶检测反应及通用不对称PCR标记,获得大量含标签互补序列(Anti-tag)的荧光标记单链产物,可与芯片上固定的标签序列(Tag)进行杂交检测。结果该方法能特异性地鉴别单一和多重目标菌感染。纯培养物的检测灵敏度为(1.1~8.5)×10~2CFU/mL。对96份食物中毒和临床腹泻样本检测,芯片结果与常规分离与生化鉴定及荧光定量PCR结果一致。结论该方法为快速、准确、灵敏、高通量地鉴定食源性疾病的病原菌提供了一种新型检测平台。

双启动寡核苷酸聚合酶链式反应法检测食品中的沙门氏菌

目的建立检测食品中沙门氏菌的双启动寡核苷酸-聚合酶链式反应(dual priming oligonucleotide-polymerase chain reaction,DPO-PCR)方法。方法以沙门氏菌invA基因为靶基因设计一对DPO引物,优化条件,对180份熟肉样本同时进行DPO-PCR和细菌分离鉴定。结果 DPO-PCR方法退火温度在52、57、62℃均可对靶基因高效扩增。方法特异性好,仅对沙门氏菌为阳性结果,而对金黄色葡萄球菌、志贺氏菌、大肠杆菌O157:H7、β溶血性链球菌、铜绿假单孢菌无交叉反应。方法灵敏度可达4.3×10~2 CFU/mL。与细菌分离鉴定相比,两者检测结果完全一致。结论该方法快速、精准,可作为食品中沙门氏菌的快速检测方法。

多重聚合酶链反应在α-珠蛋白生成障碍性贫血诊断中的应用

目的探讨应用多重聚合酶链反应(PCR)技术在缺失型α-珠蛋白生成障碍性贫血(HbH)患者基因类型快速诊断中的价值。方法选择沈阳医学院奉天医院2006年1月至2012年1月收治入院,采用多重PCR进行HbH检测的疑似HbH患者202例的临床资料进行回顾性分析,并对样本进行基因类型测序及血液实验学参数分析。结果本研究中疑似为HbH的202份临床标本,基因检测证实其中136例为HbH。与PCR检测相比,一管法红细胞脆性、平均红细胞容积、平均红细胞血红蛋白含量与红细胞分布宽度变异系数检测的灵敏度分别为85.29%、99.44%、73.53%和61.03%,特异性分别为69.70%、66.67%、62.12%和60.61%。在136例HbH患者中--SEA/αα104例、-α3.7/αα14例、-α4.2/αα4例、-α3.7/--SEA 11例和-α4.2/--SEA 3例,分别占76.47%、10.29%、2.94%、8.09%和2.21%。结论多重PCR方法能快速检测HbH基因型,尤其是HbH的双重HbH基因型,操作简便,结果准确,可应用于临床HbH的基因型检测,尤其适用于大规模人群的HbH基因型筛查。

TNF-α对肠上皮细胞紧密连接蛋白表达的作用

目的:研究肿瘤坏死因子α(TNF-α)对肠上皮细胞紧密连接蛋白claudin-1定位和表达的影响,探讨TNF-α增加肠上皮细胞屏障通透性的作用机制.方法:Caco-2细胞(20-30代)应用含有2 mmol/ L谷氨酰胺、20%胎牛血清的DMEM培养液培养7d,细胞生长达到融合后加入不同浓度的TNF-α(0,10,100μg/L)继续培养24h,提取细胞蛋白制备NP-40可溶性及不溶性蛋白框架,Western blot检测磷酸化和非磷酸化的claudin-1蛋白含量,并应用间接免疫荧光法检测claudin-1的定位,实时定量PCR技术检测claudin-1 mRNA的表达.结果:免疫荧光染色可见对照组claudin-1沿细胞膜分布,呈蜂巢状线性荧光,10μg/L TNF-α引起claudin-1荧光信号减弱,并呈锯齿状异常分布;Western blot分析显示claudin-1蛋白有两种表达形式,一种为20 kDa(非磷酸化claudin-1),主要存在于NP-40可溶性蛋白样品中;另一种为25 kDa(磷酸化claudin-1),只存在于NP-40不溶性蛋白样品中.TNF-α不影响20 kDa claudin-1蛋白的表达,但可使25 kDa claudin-1蛋白表达下降且具有浓度依赖性(10,100μg/L:0.31±0.02.0.24±0.05 vs 0.43±0.09 P>0.05,P<0.05);实时定量PCR结果显示不同浓度的TNF-α(10,100μg/L)作用24h或100μg/L TNF-α作用不同时间(4,8和24h)与正常对照组相比均不能引起claudin-1 mRNA的改变.结论:TNF-α对Caco-2细胞紧密连接蛋白claudin-1 mRNA的表达没有影响,但可以引起有功能的磷酸化claudin-1蛋白表达减少.

基于多重逆转录-聚合酶链式反应和毛细管电泳的腹泻病原体多重检测体系建立

目的为患者提供一种新型的多重(19种)腹泻病原体的检测方案,用于临床快速诊断。方法利用NCBI数据库设计19种腹泻病原体及内参的特异性引物;建立多重逆转录-聚合酶链式反应(mRT-PCR)体系;用GeXP遗传分析系统对PCR产物进行毛细管电泳分离,从而对19种腹泻病原体进行鉴别。结果 100例腹泻样本中阳性样本为85例,阴性样本为15例,共出现单病原体感染32例,混合感染53例,与测序结果一致。19种病原体特征峰均有出现,且各个峰之间分离良好,未见交叉现象。结论利用GeXP分析平台联合mRT-PCR技术同时检测19种腹泻病原体的方法,具有高通量、灵敏度高、特异性强且检验速度快等优点,此方法有可能满足临床医生对腹泻病原体检测的需求,从而指导临床治疗。

多重聚合酶链反应结合反向线性点杂交技术检测新生儿化脓性脑膜炎的病原及其耐药基因

目的探讨多重聚合酶链反应结合反向线性点杂交(multiplex polymerase chain reaction-based reverse line blot hybridization, mPCR/RLB)技术在检测新生儿化脓性脑膜炎病原及其耐药基因中的作用. 方法回顾性收集2012年1月1日至2018年12月31日在首都医科大学附属北京儿童医院临床诊断为新生儿化脓性脑膜炎患儿(n=80)的病例资料及脑脊液标本(100份).入院首次采集脑脊液标本80份(使用抗生素前12份,使用抗生素后68份),另20份为治疗后复查脑脊液标本.脑脊液标本分别采用细菌培养和药敏鉴定,以及mPCR/RLB技术检测病原及其耐药情况,采用χ^2检验比较2种方法的检测阳性率. 结果(1)80例患儿入院首次脑脊液检测:mPCR/RLB 检测阳性率明显高于细菌培养 [26.3%(21/80)与 7.5%(6/80),χ^2 =10.025, P=0.002].使用抗生素前的脑脊液标本mPCR/RLB检测阳性率与细菌培养差异无统计学意义(9/12与5/12,χ^2 =1.543,P=0.214);使用抗生素后的脑脊液标本mPCR/RLB检测阳性率高于细菌培养[17.6%(12/68)与1.5%(1/68),χ^2=13.176,P<0.001].(2)复查脑脊液标本:细菌培养均阴性, mPCR/RLB阳性4例.该4例患儿首次脑脊液细菌培养阳性,mPCR/RLB结果亦阳性,且mPCR/RLB病原结果与细菌培养结果相符.(3)病原:细菌培养检出大肠埃希菌3例,B族链球菌2例,李斯特菌1例;mPCR/RLB技术在首次脑脊液标本中检出大肠埃希菌4例,B族链球菌5例,李斯特菌4例,脑膜炎奈瑟球菌4例,流感嗜血杆菌b型、革兰阴性菌和革兰阳性菌各1例,李斯特菌和流感嗜血杆菌b型混合感染1例.(4)耐药基因:1例大肠埃希菌药敏结果为超广谱β-内酰胺酶阳性.mPCR/RLB检出acrA阳性3例,acrB阳性2例,TetM阳性1例,CTX-M阳性1例(与药敏结果相符). 结论mPCR/RLB与细菌培养相比阳性率高,一致性好,且可同时检测耐药基因,具有临床应用价值.

市售食品21种动植物过敏原成分的检测分析

为进一步明确市售食品动植物过敏原标注情况,该研究建立一种可同时检测21种动植物过敏原成分的多重连接依赖性探针扩增(MLPA)技术,并对其进行灵敏度实验,并结合实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-fqPCR)检测技术对38种市售预包装食品中动植物过敏原成分进行比较分析。结果表明,采用MLPA检测技术可同时对21种动植物过敏原成分进行检测,扩增峰之间不存在交叉干扰,扩增峰实际大小和理论大小相差≤3 bp,检出最低脱氧核糖核酸(DNA)质量浓度为1 ng/μL;RT-fqPCR、MLPA技术检测标注过敏原成分食品的检出率分别为51.5%、44.1%,此外,MLPA检测法检出了6个标注可能含有过敏原成分样品中的过敏原成分,10个样品中未标记的过敏原成分。因此,采用MLPA技术检测21种动植物过敏原成分的灵敏度更高。

MLPA技术在α-珠蛋白生成障碍性贫血罕见基因型患者及家系分析中的应用

目的探讨多重连接探针扩增(MLPA)技术在α-珠蛋白生成障碍性贫血(简称地贫)患者罕见基因型及家系分析中的应用价值,为临床检测工作提供帮助。方法采用血细胞分析仪和血红蛋白电泳技术对患者进行地贫表型分析,运用PCR-反向斑点杂交技术进行常规α-珠蛋白基因和β-珠蛋白基因检测,采用MLPA技术对α-珠蛋白基因进行检测,运用Gap-PCR和一代测序的方法对罕见缺失突变进行扩增并测序验证。结果先证者为--^(SEA)缺失复合-α^(27.6)大片段缺失,罕见-α^(27.6)大片段缺失源自患儿父亲。结论家系分析对发现和诊断地贫的罕见基因型尤为重要;MLPA技术是检测罕见缺失型α-珠蛋白基因突变的有效手段。

MDA在PCR-RFLP基因分型中的实用性

目的:评估多重置换扩增(MDA)在聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)基因分型中的实用性。方法:用MDA法对50例样本进行了全基因组扩增,并用扩增后的DNA作为模板,对两个单核苷酸多态性(SNP)进行了PCR-RFLP基因分型。结果:对于所检测的两个SNP,以经MDA扩增的基因组DNA为模板,与未经MDA扩增的基因组DNA为模板进行的PCR-RFLP基因分型,结果完全一致。结论:MDA可用于PCR-RFLP等遗传分析。

SSOP基因分型对HLA-AB血清学纯合型结果的校证

目的 建立快速、准确的人类白细胞抗原 (HLA)基因分型技术 ,解决血清学分型局限性。方法 选择HLA -A、B血清学分型纯合型标本 ,应用聚合酶链式反应 -序列特异性寡核苷酸探针杂交 (PCR -SSOP)技术进行基因分型。结果 4 2例HLA -A、4 5例HLA -B血清学纯合型标本 ,经SSOP基因分型 ,其中分别有 3例和 8例为杂合型。结论 SSOP基因分型具有特异性更强、灵敏度更高、结果更为准确可靠等优点 ,是取代传统血清学分型方法较为优越的技术之一。

基于多重PCR-质谱微测序技术的结核分枝杆菌对一线治疗药物耐药性检测系统构建

目的构建一种基于多重聚合酶链式反应-质谱微测序技术的结核分枝杆菌耐药基因多位点检测方法和检测模块,实现结核分枝杆菌对一线抗结核药物的高通量快速检测,为结核病诊疗提供一种新型技术支撑。方法通过对5个单核苷酸多态性位点靶基因进行多重PCR扩增、单碱质量探针延伸及分子质量测定,同时完成16个突变位点、26种突变型的检测,实现结核分枝杆菌对利福平、异烟肼、吡嗪酰胺和乙胺丁醇等一线治疗药物抗性的通量检测。采用40例结核分枝杆菌样本、50例呼吸道感染患者咽拭子样本进行检测体系准确性及特异性验证。结果本研究构建了基于5重PCR-质谱联用的结核分枝杆菌对一线治疗药物的泛耐药检测方法,并开发了质谱配套检测系统。采用该系统,结核分枝杆菌对利福平、异烟肼、吡嗪酰胺、乙胺丁醇抗性检测的准确率和特异性均为100.00%,且具有7 h内完成96个样本的检测通量。结论本研究构建的方法有操作简便、低成本、高通量特点,耐药位点检测全面且准确,并具扩展性,可根据需要增添新突变位点,在结核分枝杆菌耐药性检测中具有良好应用前景。

转化生长因子-β1反义寡核苷酸减轻环孢素A对大鼠的慢性肾毒性

目的以阳离子脂质体介导的转化生长因子-β1(TGF-β1)反义寡核苷酸(AODN)阻止TGF-β1的表达,观察其对大鼠使用环孢素A(CsA)后慢性肾毒性的防治作用。方法低盐饮食条件下,给SD雄性大鼠腹腔注射CsA 15 mg·kg-1·d-1,持续28 d;另两组在腹腔注射CsA的同时,于第15、20 d分别予以TGF-β1硫代磷酸AODN和阳离子脂质体包裹的TGF-β1硫代磷酸AODN尾静脉注射。检测各组血清肌酐的改变,组织形态学的变化;免疫组织化学法及聚合酶链式反应(RT- PCR)检测TGF-β1蛋白及其mRNA在组织的表达。结果成功地模拟了CsA对大鼠慢性肾毒性的病理改变。阳离子脂质体介导的TGF-β1硫代磷酸AODN可以显著抑制TGF-β1的表达,减轻CsA 所致慢性肾毒性的病理改变,并能改善肾功能。结论阳离子脂质体介导的TGF-β1硫代磷酸AODN通过抑制TGF-β1的表达,有效防治CsA对大鼠的慢性肾毒性。

溴氰菊酯对大鼠脑组织某些抗氧化酶、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶和NF-E2相关因子2基因表达的影响

目的研究溴氰菊酯(DM)对大鼠大脑皮层和海马组织铜锌超氧化物歧化酶(CuZn- SOD)、谷胱苷肽还原酶(GR)、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)轻亚单位(GCSl)重亚单位(GCSh)基因和红系核因子2(NF-E2)相关因子2(Nrf2)基因表达的影响。方法将18只大鼠随机分为3组,每组6只,对照组腹腔注射橄榄油,低剂量DM染毒组(3．125 mg／kg体重)和高剂量DM染毒组(12．500 mg／kg体重)大鼠染毒5 d。分别用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法测定CuZn-SOD、GR、GCSI、GCSh和Nrf2基因mRNA表达的相对量。12只大鼠随机分为3组,用免疫组织化学方法检测海马和大脑皮层中γ-GCS重亚单位蛋白(GCS-HS)和Nrf2蛋白水平。结果DM染毒大鼠大脑皮层和海马组织中的CuZn-SOD、GR、GCSh和Nrf2基因mRNA水平均未见明显改变;12．500 mg／kg组大脑皮层、3．125 mg／kg组大脑皮层和海马组织中的GCSl基因mRNA水平低于对照组中各相应组织的水平,分别降低至对照组mRNA水平的71．1％、63．6％和75．2％,差异均有统计学意义(P<0．01);DM染毒的大鼠海马CA1、CA2、CA3、齿状回和大脑皮层中的GCS-HS和Nrf2蛋白水平均未见明显改变。结论DM对GR及CuZn-SOD基因,mRNA表达未见影响;DM抑制大鼠海马和脑皮层中GCSl基因mRNA表达,而未见影响GCSh基因mRNA的表达;本实验条件下DM对大脑皮层和海马组织中的Nrf2表达无明显影响。

胰高血糖素受体基因多态性与2型糖尿病相关性研究

目的 探讨中国汉族人群中胰高血糖素受体 (GCGR)基因Gly4 0Ser多态性与 2型糖尿病的相关性。方法 采用聚合酶链反应 寡核苷酸连接测定方法 ,对北京地区 10 2对病例 对照配偶对进行GCGR基因Gly4 0Ser多态性基因型检测。结果 病例组和对照组共 2 0 4例样本中均未发现GCGR基因Gly4 0Ser突变。 结论 在中国汉族人群中GCGR基因Gly4 0Ser多态性对 2型糖尿病的发生可能影响不大。

葡萄糖转运蛋白4基因与2型糖尿病相关性研究

目的 探讨中国汉族人群中葡萄糖转运蛋白 4 (GLUT4 )基因Val3 83Ile突变与 2型糖尿病的相关性。方法 采用聚合酶链反应 寡核苷酸连接测定方法对北京地区 2 0 4例患者 配偶进行GLUT4基因Val3 83Ile多态性基因型检测。结果 病例组中发现 2例为GLUT4基因Val3 83Ile突变的杂合携带者 ,对照组中未发现GLUT4基因Val3 83Ile突变。结论 GLUT4基因Val3 83Ile突变在北京地区汉族人群中不常见 ,可能为 2型糖尿病某种亚型的致病因素。

盐皮质激素受体基因多态性与妊高征相关性研究

目的 探讨中国人群中盐皮质激素受体基因 (MR)外显子 3上A76 0G多态性与妊高征的相关性。方法 以人外周血DNA为模板 ,通过聚合酶链式反应 -等位特异性寡核苷酸杂交 (PCR -ASO)方法测定 95例随机妇女、10 1例正常孕妇、6 0例妊高征妇女的MR外显子 3上A76 0G多态性频率。结果 MR外显子 3上A76 0G多态性位点中A等位基因和C等位基因在正常孕妇组中分别为 83.17%与 16 .83% ,在妊高征组中分别为 84 .17%与 15 .83% ,在随机人群组中分别为 86 .84 %与 13.16 %。结论 中国人群中MR基因外显子 3上存在A76 0G多态性 ,该多态性与妊高征不存在相关性。

伴有脑干听觉诱发电位异常的腓骨肌萎缩症发现连接蛋白32基因新突变

目的 报告一个脑干听觉诱发电位有异常改变的腓骨肌萎缩症 (Charcot- Marie- Tooth dis-ease,CMT)家系 ,并探讨与连接蛋白 32 (connexin32 ,Cx32 )基因突变的关系。方法 对整个家系进行临床检查 ,对先证者进行肌电图及脑干听觉诱发电位检查 ,并应用聚合酶链式反应 -单链构象多态 (polymerasechain reaction- single strand conformation polymorphism,PCR- SSCP)技术结合 DNA序列分析方法检测了先证者、家系内 8人及家系外 5 0名无血缘关系的正常人。结果 先证者肌电图检查示神经传导速度明显减慢 ,脑干听觉诱发电位示中枢传导延长 ,该家系中先证者及另 3人均出现异常 SSCP条带 ,经测序证实为392 T→ C(L eu131Pro)突变。结论 L eu131Pro是未报道过的突变 ,腓骨肌萎缩症患者可以出现脑干听觉诱发电位异常。

汉族人载脂蛋白E基因多态性与脑梗死部位及梗死灶体积的相关性研究

目的探讨载脂蛋白E（ApoE）基因多态性与脑梗死发生部位及梗死灶体积的相关性。方法采用病例-对照研究设计，对自2011年9月至2012年11月泸州医学院附属医院神经内、外科收治的162例脑梗死患者（脑梗死组）和同期体检的120例健康人（对照组）的血样采用多重聚合酶连接反应-连接酶检测反应分型法（PCR-LDR）测定ApoE基因的多态性，分析不同脑梗死部位ApoE基因型分布及各等位基因频率的差异，以及各基因型与梗死灶体积的关系。结果脑梗死组和对照组之间ApoE基因型分布和等位基因频率比较差异均无统计学意义（P〉02．05）。各脑梗死部位间ApoE基因型分布和等位基因频率比较差异均无统计学意义（P〉0．05）。脑梗死组中E4／）（基因型（E4／3基因型和E4／4基因型合并）的平均梗死灶体积[（15．7±2．3）cm^3]与E3／3基因型[（10．2±2．1）cm^3]及E2／）（基因型（E2／2基因型和E2／3基因型合并）[（9．5±1．8）cm^3]比较差异具有统计学意义（P〈0．05），且E4／X基因型中大面积脑梗死比例（56％）较E3／3基因型（28．1％）及E2／X基因型（26．3％）更高，差异具有统计学意义（P〈0．05）。结论ApoE基因多态性与脑梗死发生部位无相关性，而与梗死灶体积相关，其中携E4等位基因者较易发生大面积脑梗死。

人冠状病毒HKU1重症肺炎病原检测及鉴定

目的对内蒙古自治区赤峰市重症肺炎病例进行病原检测鉴定,分析pol基因的同源性并确定其病原学分类地位。方法采集10例重症肺炎患者的咽拭子样本,采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)进行流感病毒核酸检测,采用多重PCR方法进行呼吸道病毒鉴定,采用RT-PCR法特异性扩增人冠状病毒OC43、299E、NL63和HKU1的pol基因,阳性样本进行pol基因序列测定及同源性分析。结果检出1份人冠状病毒HKU1阳性样本,RT-PCR法扩增到长度约440 bp的特异性目的片段;其pol基因与人冠状病毒HKU1参比毒株的pol基因的同源性最高达99.7%以上。结论 1例重症肺炎患者因感染人冠状病毒HKU1而发病,其他患者的病原学鉴定有待进一步研究。