多重逆转录聚合酶链反应和半巢式多重聚合酶链反应快速检出含漱液中的乙型流感病毒

目的建立特异敏感的快速检测含漱液中的流感病毒的分子生物学方法。方法用多重逆转录聚合酶链反应和半巢式多重聚合酶链反应扩增甲１、甲３和乙型流感病毒ＨＡ基因的ＨＡ１片段，得到各病毒与特异性大小的扩增产物的对应关系。用同样的方法扩增含漱液中流感病毒的ＨＡ基因的ＨＡ１片段。根据这对应关系检测含漱液中的流感病毒。结果以流感病毒的ＨＡ基因为模板设计的三对引物，用多重逆转录聚合酶链反应能特异性地扩增出９４２ｂｐ、１１１７ｂｐ和 ７５１ｂｐ的核酸片段，它们分别和甲１、甲３和乙型流感病毒有稳定对应关系。用多重逆转录聚合酶链反应和半巢式多重聚合酶链反应扩增含漱液中流感病毒ＨＡ基因的ＨＡ１片段，根据扩增产物的大小检出含漱液中的乙型流感病毒。结论 多重逆转录聚合酶链反应和半巢式多重聚合酶链反应能特异敏感地检出含漱液中的乙型流感病毒。

逆转录-多重巢式聚合酶链反应技术在骨髓增殖性疾病PDGFRB基因重排检测中的应用

本研究旨在探讨逆转录-多重巢式PCR技术在骨髓增殖性疾病(MPD)PDGFRB基因重排检测中的应用价值。利用逆转录-多重巢式PCR技术对146例MPD患者骨髓或外周血标本进行与PDGFRB基因重排相关的融合基因定性检测。结果显示,146例MPD患者骨髓或外周血标本中有8例出现PDGFRB基因重排,阳性率为5.5%。其中3例为TEL-PDGFRB融合基因,2例为HIP1-PDGFRB融合基因,1例为GIT2-PDGFRB融合基因,1例为TP53BP1-PDGFRB融合基因,1例为WDR48-PDGFRB融合基因。结论:运用逆转录-多重巢式PCR方法进行MPD患者PDGFRB基因重排检测,对于疾病诊断有一定指导意义,且可以为药物靶向治疗提供理论依据。

逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术同时检测水中多种肠道病毒

建立了一种利用通用引物RT-PCR技术检测水中肠道病毒的方法.利用脊髓灰质炎病毒1～3型,柯萨奇病毒B3型作为参考病毒株,根据肠道病毒RNA5′非编码区中具有高度同源性的序列来设计通用引物.比较了M-MLV酶和AMV酶的逆转录效果,AMV酶能够成功地从地表水和生活污水中逆转录病毒RNA,更适于实际应用.对比研究了PCR过程中的退火温度,c(Mg2+)等因素对RT-PCR检测结果的影响,选择退火温度55℃,c(Mg2+)为2 mmol/L的反应条件,优化了RT-PCR检测方法.通过检测水样中接种的连续稀释的病毒,确定了该检测方法的灵敏度为38 CCID50.考察人工污染的地表水、污水、二级处理出水样品发现,检测灵敏度基本一致.该方法可应用在实际环境的肠道病毒检测中.

巢式多重聚合酶链反应快速诊断儿童脑膜炎/脑炎

目的探讨巢式多重聚合酶链反应(PCR)在儿童脑膜炎/脑炎诊断中的价值。方法采用回顾性病例对照研究。收集2017年5月—2020年5月上海市儿童医院82例确诊或疑似中枢神经系统感染患儿的脑脊液样本。收集患儿临床资料,了解患儿抗菌药物使用情况。采用巢式多重PCR检测病原体,并同步进行细菌培养、脑脊液常规和生化检测。结果82例脑脊液样本中,有31例检出病原体,其中20例检出病毒、11例检出细菌。细菌组脑脊液样本白细胞计数、蛋白、乳酸脱氢酶和患者抗菌药物使用天数、住院天数均显著高于病毒组(P<0.05);葡萄糖水平低于病毒组(P<0.05);阿昔洛韦使用例数少于病毒组(P<0.05)。巢式多重PCR与培养法判断细菌性脑膜炎/脑炎的一致性较好(Kappa=0.659,P<0.001),与实验室指标判断病毒性脑膜炎/脑炎的一致性亦较好(Kappa=0.737,P<0.001)。结论巢式多重PCR可以作为辅助诊断中枢神经系统感染患儿脑脊液样本病原体感染的新方法,可提高儿童脑膜炎/脑炎的诊断效率。

应用巢式逆转录聚合酶链反应检测鱼类病毒性出血性败血症病毒(VHSV)

参照鱼类病毒性出血性败血症病毒序列,根据PCR引物设计的原则,设计巢式PCR引物,采用巢式逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法,对如何快速检测鱼类病毒性出血性败血症病的方法进行了较为系统的研究,并对RT-PCR的反应条件进行了优化。结果表明,巢式RT-PCR扩增获得279bp的特异性片断,阴性对照无扩增条带。巢式RT-PCR扩增出的特异性片段经测序分析,结果证实与报道的序列完全一致。该方法最低可检测出0.1pg的鱼类病毒性出血性败血症病毒RNA。初步建立了VHSV的巢式RT-PCR检测方法,该方法灵敏、特异,可为VHSV的检测提供一个快速、有效的手段。

多重逆转录聚合酶链反应检测主要上呼吸道病毒

目的 建立用多重逆转录聚合酶链反应 (mRT -PCR)检测甲 1型、甲 3型、乙型流感病毒以及呼吸道合胞病毒 (RSV)A型、B型等主要上呼吸道病毒的方法 ,以快速检测上呼吸道感染主要病毒及对甲型、甲亚型、乙型流感病毒在上海地区人群感染、流行情况调查。方法 采用经MDCK细胞接种培养的甲 3型、乙型流感病毒和Hep - 2细胞接种培养的RSVA型、B型标准毒株病毒液 ,以及甲 1型、甲 3型、乙型流感病毒和RSVA型、B型混合毒株病毒液 ,使用 5组引物 ,分别为HA1- 5a1和HAl- 3a1(甲 1型流感病毒 )、HA3 - 5a1和HA3 - 3a1(甲 3型流感病毒 )、NP- 5b1和NP - 3b1(乙型流感病毒 )、RSVAF和RSVAR(RSVA型 )、RSVBF和RSVBR(RSVB型 ) ,经mRT -PCR ,琼脂糖凝胶电泳 ,于紫外灯下观察上述病毒特异核苷酸条带。结果 甲 1型、甲 3型、乙型流感病毒 ,RSVA型、B型分别在 43 1,2 10 ,3 90 ,3 3 4,183bp处出现清晰的 5条DNA条带。 结论 应用 5组引物 ,mRT -PCR可用于快速检测临床上呼吸道感染标本中的流感病毒和RSV ,并可对其进行分型 。

逆转录多重套式聚合酶链反应在儿童病毒性脑炎病原学研究中的应用

目的探讨早期同步检测病毒性脑炎(VE)主要病原新方法.方法应用逆转录多重套式聚合酶链反应(RT-M-nPCR)对100例VE患儿及73例对照组脑脊液(CSF)标本进行单纯疱疹病毒(HSV)DNA与肠道病毒(EV)RNA同步检测.结果整个过程约需5 h.该法与ELISA及经典nPCR方法比较,符合率分别为96%及100%.100例VE患儿CSF标本中,HSV阳性18例,EV阳性17例,在100例VE中,有26例重症,其中HSV感染14例(53.85%),EV感染7例(26.92%),不明病原5例(19.23%).不同病原检出率与年龄的关系:年龄～3岁、～7岁、～14岁HSV分别检出7.4%、11.9%、35.5%,EV分别检出25.9%、19.05%、6.5%.结论RT-M-nPCR是一种能在早期同步检测HSV及EV的具有巨大潜在应用价值的病原检测技术;在VE重症中HSV感染最常见;HSV感染在年长儿发病率高,而EV感染在学龄前及婴幼儿中多见.

微流芯片检测流感病毒多重逆转录聚合酶链反应产物的实验研究

[目的 ] 建立应用微流芯片检测甲 1型、甲 3型、乙型流感病毒多重逆转录聚合酶链反应 (mRT -PCR)产物的方法 ,在mRT -PCR扩增核酸的基础上自动化灵敏的定量检测扩增产物 ,快速检测甲亚型、乙型流感病毒 ,帮助临床快速诊断和鉴别诊断其他呼吸道病毒感染 ,以及明确流感病毒在人群中感染、流行情况。 [方法 ] 采用经MDCK细胞分离培养的甲 1型、甲 3型、乙型流感病毒毒株病毒液 ,使用 3组特异引物经mRT -PCR扩增核酸 ,扩增产物分别采用毛细管电泳技术经Caliper10 0 0微流芯片分析仪自动化检测和经 2 %琼脂糖凝胶电泳法检测。 [结果 ] 设计三组引物对相应甲 1型、甲 3型、乙型流感病毒靶基因的mRT -PCR扩增产物片段分别为 43 0bp、2 10bp、3 91bp ,本实验mRT -PCR扩增产物经 2 %琼脂糖凝胶电泳 ,与Marker比照 ,DNA条带基本在此位点附近 ;产物采用毛细管电泳法经Caliper10 0 0微流芯片分析仪后 ,分别于 413bp、2 0 3bp、3 79bp处出现陡峭的峰 ,如图所示。 [结论 ] 应用微流芯片采用毛细管电泳法可对流感病毒mRT -PCR产物进行定位及相对定量 ,有助于快速诊断流感病毒感染 ,有助于对流感的监测。

用改良的巢式逆转录聚合酶链反应技术检测血中CK20mRNA

目的建立一种简便、快速的检测血中微量大肠癌细胞CK20mRNA的方法。方法用改良的巢式逆转录聚合酶链反应技术检测血中大肠癌标准细胞株VoLo的CK20mRNA。结果浓度分别为1、10、100、1000个/mL的大肠癌标准细胞株LoVo的每份标本,均扩增出了符合所设计片段大小的303bp的目的产物条带。结论用改良的巢式逆转录聚合酶链反应技术检测血中微量存在的大肠癌细胞CK20mRNA具有简便、快速、灵敏的优点,可以大力地推广于临床。

巢式逆转录聚合酶链反应检测肝癌患者外周血AFP mRNA的临床意义

目的 评估肝细胞癌 ( HCC)患者外周血甲胎蛋白 m RNA( AFP m RNA)检测的临床意义。方法 采用巢式逆转录聚合酶链反应技术 ,对肝癌患者外周血 AFP m RNA进行检测。结果 37例肝癌患者中 AFP m RNA阳性 16例 ( 4 3.2 % ) ,2 5例肝硬变患者中 AFP m RNA阳性 2例 ( 8.0 % ) ,2 0例正常对照无 1例阳性 ;AFP m RNA阳性的 HCC患者肝外转移发生率 ( 87.5 % )显著高于 AFP m RNA阴性的 HCC患者 ( 33.3% ) ,差异有显著性 (χ2 =10 .85 6 ,P≤ 0 .0 0 1,OR=14 .0 0 ,95 %可信区间 CI=2 .4 6 4～ 79.5 5 0 ) ;不同临床分期的 HCC患者其 AFP m RNA检出率不同 , 期患者检出率 ( 6 1.9% )明显高于 、 期检出率 ( 18.8% ) ;AFP m RNA的检出率与血清 AFP水平不同无明显相关。结论 巢式 RT- PCR方法是检测外周血残癌细胞 AFP m RNA的一种灵敏可靠技术 ,检测外周血中的 AFP m

多重逆转录聚合酶链反应检测流感病毒

目的 :建立特异敏感的快速检测流感病毒的分子生物学方法。方法 :用多重逆转录聚合酶链反应连接多重聚合酶链反应扩增甲 1 、甲 3和乙型流感病毒的 HA基因的 HA1 片段。根据扩增产物的大小检测流感病毒。结果 :以流感病毒的HA基因为模板设计的三对引物能特异性地扩增出 94 2 bp、 1117bp和 75 1bp的核酸片段 ,它们分别和甲 1 、甲 3和乙型流感病毒有稳定对应关系。根据扩增产物的大小可以检测流感病毒。用这个方法能检测病毒浓度为 0 .1TCID5 0的样品。还可直接从疑似流感病人的含漱液中检测到乙型流感病毒。结论 :多重逆转录聚合酶链反应连接多重聚合酶链反应是检测流感病毒的特异敏感的方法 。

改良巢式逆转录聚合酶链反应检测大肠癌血中微转移

目的探讨改良巢式RT-PCR法检测大肠癌患者外周血中CK20mRNA的表达情况,并分析其与微转移的关系,建立一种简便、快速的检测血中癌细胞微转移的方法。方法采用改良的巢式RT-PCR技术检测大肠癌患者及正常对照组外周血CK20mRNA的表达。结果CK20mRNA在正常对照组中均无表达,在大肠癌患者中阳性表达率为55.4%(62/112)。不同细胞分化程度大肠癌患者其外周血中CK20mRNA阳性表达率无显著性差异(P>0.05);而不同Dukes分期大肠癌患者其外周血中CK20mRNA阳性表达率有显著性差异(P<0.05)。结论改良的巢式RT-PCR技术检测血中微转移大肠癌细胞的CK20mRNA具有简便、快速、灵敏的优点,有助于癌细胞微转移的早期诊断,有助于指导辅助化疗和监测疗效。

用逆转录-聚合酶链反应检测乳腺癌患者骨髓微转移30例报道

目的 :通过分子生物学技术检测乳腺癌患者的微转移灶。方法 :患者常规行乳癌根治术 ,在完成皮瓣游离后 ,于胸骨柄处行骨穿 ,吸取骨髓 3～ 4ml,所采骨髓行RT -PCR检测其细胞角蛋白 19(KT19)含量。切除标本常规送病理。结果 :30例患者临床病理汇报同侧腋窝淋巴结转移阳性 17例 ,胸骨骨髓KT19阳性 7性 ,占4 1.12 % ,其中 3例肿块直径≥ 5 .0cm ,位于内乳内 ,临床未触及锁骨上淋巴结肿大 ;同侧腋窝淋巴结转移阴性13例 ,胸骨骨髓KT19阳性 3例 ,占 2 3.0 7%。总阳性率 33.33%。结论 :在术中游离皮瓣后于胸骨柄处进行骨穿获取骨髓 ,并转应用逆转录 -聚合酶链反应 (RT -PCR)检测细胞角蛋白 19(KT19)在胸骨骨髓中的表达 ,可以早期诊断乳腺癌的微转移。

巢式逆转录多聚酶链反应检测大肠癌外周血中CK20m RNA

目的 :研究大肠癌患者外周血中 CK 2 0 m RNA作为大肠癌细胞微转移的标志。方法 :巢式逆转录多聚酶反应 (RT- PCR)法。结果 :CK2 0 m RNA巢式 RT- PCR最低可检测到每 5 ml血液中仅存 5个结肠癌细胞的存在 ;大肠癌组 32例 ,外周血中 CK 2 0 m RNA阳性率 5 6 .2 6 % (18/32 ) ;对照组中 CK 2 0 m RNA均为阴性。结论 :CK 2 0m RNA巢式 RT- PCR可作为大肠癌细胞微转移的敏感而特异的检测方法。

实时荧光定量逆转录聚合酶链反应检测火器伤骨折愈合过程中骨形态发生蛋白的表达

目的应用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测兔火器伤骨折愈合过程中骨形态发生蛋白(BMP)-2mRNA水平。方法建立外固定架固定一期治疗兔股骨火器伤骨折的动物模型和BMP-2 mRNA表达水平的SYBR G reenⅠ荧光定量RT-PCR方法,分别于术后第1、2、3、4周取断端组织,通过实时荧光定量RT-PCR检测标本标本中BMP-2 mRNA水平。结果在对照组,创伤后的兔骨组织BMP-2 mRNA表达水平在1周开始增高,在第2周达到高峰后下降,第4周即可恢复正常。而实验组,受枪伤的兔骨组织BMP-2 mRNA表达水平在第3周表达最高,与对照组相比,升高较慢,表达量也偏低(P<0.05)。结论BMP-2mRNA SYBR G reenⅠ荧光定量RT-PCR可以很好地反应枪击伤对兔骨组织BMP-2 mRNA表达水平的影响。枪击伤后的兔骨组织BMP-2 mRNA表达水平与对照组相比升高较慢,表达量也偏低。

逆转录-聚合酶链反应检测鼠肝炎病毒方法的建立

建立特异、灵敏的逆转录聚合酶链反应（RT－PCR）技术，结合碱性磷酸酶标记的探针杂交检测鼠肝炎病毒（MHV），采用MHV－3，MHV－A59病毒株感染DBT细胞，37℃培养，待细胞出现病变时收集提取病毒RNA。依据MHV基因序列设计一对高度保守区特异性引物，进行RT－PCR扩增，结果可见147bp的鼠肝炎病毒产物特异扩增带。敏感性实验检测到10pg的鼠肝炎病毒RNA，同时用ELISA方法对照。结果提示应用RT—PCR技术结合探针杂交检测鼠肝炎病毒。具有简便、快速、灵敏等优势。本研究在国内尚未见报道。

逆转录-巢式聚合酶链反应检测庚型肝炎病毒RNA的方法建立及初步应用

庚型肝炎病毒(HGV)基因组为单链,正股RNA,全长9,392Bp。根据5＇-非编码区基因序列设计合成两对引物。随机选取酶联抗-HGV阳性病人血清3份,阴性病人血清6份,应用逆转录-巢式聚合酶链反应进行检测。结果2份抗-HGV阳性血清可见较强的特异扩增带,1份抗-HGV阳性血清可见较弱的特异扩增带。

逆转录聚合酶链式反应检测胎盘多药赖药基因与胎盘胆汁酸排泌的相关性

目的探讨胎盘多药赖药(MDR3)基因与妊娠期肝内胆汁淤积症(ICP)胎盘胆汁酸排泌的相关性。方法收集妊娠晚期ICP患者(ICP组)和正常晚孕妇女(对照组)各30例,分别采集母体静脉血和新生儿脐静脉血及胎盘组织,采用放射免疫分析方法检测母血及脐血中的甘胆酸(CG)含量;采用逆转录聚合酶链式反应法(RT-PCR)测定两组胎盘组织中多药赖药基因mRNA的相对表达量。结果 (1)ICP组母血、脐血中CG水平均高于对照组(28.86±8.51vs2.70±2.19;19.97±8.80vs5.83±5.06μg/ml),以上差异均有统计学意义(P<0.001);ICP组母血CG含量高于脐血中的含量,两者之间存在正相关(r=0.588);对照组脐血CG含量高于母血中的含量,两者之间无直线关系(r=0.212)。(2)两组胎盘组织中均检测到MDR3基因的mRNA,与对照组相比,ICP组胎盘组织中MDR3基因的mRNA水平下降(3.33±1.03vs6.85±1.26),差异有统计学意义(P<0.001);且MDR3-mRNA相对量与脐血甘胆酸和母血甘胆酸水平呈负相关性(r=-0.627;r=-0.795)。结论 MDR3基因可能参与了胎盘胆汁酸的排泌。

应用MAGE A1～6普通引物的逆转录巢式聚合酶链反应技术检测肺癌Sanghoon Jheon, et al. Lung cancer

背景由于肺癌患者的死亡率仍在很高水平，开发敏感的检测方法仍是一项迫切的任务。本文作者设计了普通黑素瘤抗原基因(MAGE)引物用以同时检测出MAGE A1-6亚型。这些引物应用于经痰标本检测肺癌。方法这一研究包括了53例癌症患者组和3个非癌症组(193位健康人，

联合常规细胞遗传学技术、多重巢式聚合酶链反应技术检测120例急性白血病患者遗传学异常

探讨如何提高急性白血病患者染色体/特异融合基因异常的检出率与准确率。联合常规细胞遗传学技术、多重巢式聚合酶链反应技术对120例急性白血病患者进行检测。结果表明:应用常规细胞遗传学检测出82例核型异常,占68.3%,而应用多重巢式聚合酶链反应技术检测出54例融合基因异常,占45%。联合这两种技术,120例急性白血病患者的遗传学异常检出率为:75%(90/120),其中有65例明确了具体染色体改变或特异性融合基因异常。30例患者经常规细胞遗传学检测出具有t(8;21)(q22;q22)或t(15;17)(q22;q12),多重巢式聚合酶链反应技术检测出39例患者具有AML1/ETO、PML/RARA或CBFB/MYH11融合基因异常。当存在染色体数目异常,或者不存在19种融合基因之一时多重巢式聚合酶链反应结果为阴性。提示常规细胞遗传学技术联合多重巢式聚合酶链反应技术可以有效地提高急性白血病患者染色体异常/特异性融合基因的检出率。