多重引物等位特异PCR法快速检测ApoE基因型的研究

目的建立多重引物等位特异PCR方法结合内参照基因对ApoE基因型进行分析,并与PCR-RFLP法和直接测序结果进行比较.方法以基因组DNA为模板,用多重引物等位特异PCR法、PCR-RFLP检测了158例体检者的APOE基因型,典型基因型用直接测序法检测并通过GeneBank对比.结果共检测出5种常见的基因型:ε2/2(0%),ε3/3(77.2%),ε4/4(0.6%),ε3/2(13.3%),ε4/3(7.0%),ε4/2(1.9%),两种方法结果一致,测序结果与GeneBank对比一致.结论多重ASP-PCR检测ApoE基因型具有快速简便、准确可靠和经济、适用的特点,有一定的推广价值.

淋巴瘤克隆性TCRγ基因重排的多重引物分析

目的探讨TCRγ多重引物检测淋巴瘤克隆性基因重排的功效及意义。方法引物分为两组扩增淋巴瘤DNA,PCR产物用于琼脂糖电泳和单链构象多态性分析(SSCP)检测。结果两组多重引物PCR的阳性率高于通用引物阳性率;B细胞淋巴瘤组织中存在一定比例克隆性TCRγ基因生重排;部分淋巴瘤中存在两种TCRγ基因重排。结论多重引物和降落式PCR适于淋巴瘤TCRγ基因重排研究,可提高检出率、判断淋巴瘸组织中不同TCRγ基因重排情况;SSCP可排除假阳性。

Jurkat细胞株TCRγ基因重排及多重引物扩增分析

目的分析Jurkat细胞株TCRγ基因重排特点,观察多重引物PCR扩增Jurkat细胞株TCRγ基因重排的效果。方法 TCRγ基因重排正向、反向引物配对组合,分别扩增Jurkat细胞株DNA,阳性PCR产物测序并比对分析;多重引物组合、降落式PCR扩增Jurkat细胞株TCRγ基因重排,比较多重引物与单对引物扩增效果。结果两组单对引物扩增产物电泳出现强阳性条带,测序并比对证实为TCRγ基因重排;与胚系基因比对发现,重排后TCRγ基因存在删除和增加的碱基序列;多重引物扩增产物中出现阳性条带的组合,其引物与单对引物组合一致。结论 Jurkat细胞中存在两种不同的TCRγ基因重排,重排序列体现了基因重排多样性。多重引物结合降落式PCR扩增TCRγ基因重排,扩增效果与单对引物一致。

应用多重引物RT-PCR快速诊断禽流感亚型

将本实验室分离保存、已经过PCR扩增、核酸测序鉴定的三种不同亚型禽流感病毒(AIVH5N1、H6N2、H9N2)分别接种鸡胚,收集尿囊液,分离提取AIV总RNA。参考H1￣H15亚型禽流感病毒的核蛋白(NP)基因序列以及H5、H6、H9亚型AIV血凝素(HA)基因序列,设计四对引物:NP1,NP2;H5P1,H5P2;H6P1,H6P2;H9P1,H9P2,混合为PCR扩增多重引物MP1,下游引物NP2、H5P2、H6P2,、H9P2混合为逆转录反应多重引物MP2。AIV总RNA在相同反应条件下经MP2逆转录,用MP1进行PCR扩增,AIVH5亚型材料得到205bp,563bp两条扩增带,AIVH6亚型材料得到205bp,233bp两条扩增带,AIVH9亚型材料得到205bp,690bp两条扩增带,都与实验设计相符合,阴性材料没有扩增带。该方法成功实现四对引物进行RT-PCR反应同时检测出AIV,准确诊断H5、H6、H9三种禽流感亚型,检测时间短,特异性强,能及时检测出AIV亚型。

多重引物SSR技术鉴定玉米杂交种子纯度的研究

采用热碱法提取玉米种子DNA,并且运用多重引物(3对SSR引物)PCR对其进行SSR扩增,进行种子纯度鉴定。结果表明:①利用热碱法可以实现玉米种子的DNA快速提取,同时降低了检测成本;②利用三重引物PCR技术降低了检测结果的误差,提高了检测结果的准确性。因此,将这两种技术结合起来,将极大地推动SSR技术在玉米种子纯度鉴定中的推广和应用。

多重引物HRMA对成骨不全患者COL1A1/2基因突变的筛查与分析

目的建立多重引物高分辨熔解曲线分析(high resolution melting analysis,HRMA)方法并运用该方法筛查两例成骨不全(osteogenesis imperfecta,OI)COL1A1/2的突变基因。方法收集两例OI患者临床资料,采集患者及50例正常对照的血液标本。设计COL1A1、COL1A2基因103个外显子所对应的引物,将满足一定条件的两对引物相互配对,与单份样本DNA混合作为扩增体系。运用HRMA筛查产物突变情况,基因测序确定突变位点。结果本研究中共涉及到COL1A1和COL1A2的103个外显子,其中成功配对39对,未配对成功的有3个COL1A1外显子和22个COL1A2外显子,成功率为75.73%。先证者1筛查结果HRMA熔解曲线在COL1A141号外显子上存在异常,测序结果为c.2877delT杂合突变,即cDNA2877位碱基T缺失,编码的缬氨酸变成色氨酸。先证者2筛查结果HRMA熔解曲线在COL1A116号外显子上存在异常,测序结果为c.1028delC杂合突变,即cDNA1028位碱基C缺失,编码的脯氨酸变成亮氨酸。两种突变类型在中国人群中均未见报道,为新发现的两种剪切突变,且与传统HRMA筛查结果一致。结论多重引物HRMA方法在传统HRMA基础上进行了创新,将两对引物与单份样本DNA混合作为扩增体系,HRMA筛查产物突变情况,且与传统HRMA筛查结果一致,具有一定创新性和可行性,为成骨不全患者基因突变及其他遗传病致病基因的筛查提供了新的思路。

锁核酸和不对称扩增辅助的等位基因多重引物识别KRAS基因突变的研究

RAS突变的检测为指导结直肠癌的预测和预后提供了有力的工具。探讨一种简洁、低成本的用于检测KRAS基因突变的多重引物等位基因识别方法(multiplex primer allelic discrimination,MP_(m) AD)。利用不对称扩增和含锁定核酸(locked nucleic acid,LNA)的等位基因特异性引物、以及共同的反向引物和探针,进行多重孔检测和参考孔检测,以多重检测和参考检测的扩增循环数值差(ΔC_(q))来判定结果。同时使用福尔马林固定石蜡包埋组织(Formalin Fixed and Paraffin Embedded Tissues,FFPET)样本或在野生型基因组DNA背景下混合质粒进行非临床性能评价,并采用Kappa检验比较MP_(m) AD与Sanger测序的结果一致性。该方法对KRAS热点突变检测灵敏度至少为3%;凝胶电泳也验证了方法的特异性;重现性的变异系数(coefficient of variation,CV)<15%;同源基因检测未观察到交叉反应。通过分析115例FFPET标本,MP_(m) AD法与Sanger测序结果之间无统计学差异(k>0.9;p<0.001)。MP_(m) AD方法可以简洁、低成本地检测KRAS热点突变。

多重PCR检测猪瘟病毒、猪细小病毒和猪伪狂犬病病毒的研究——猪瘟病毒、猪细小病毒和猪伪狂犬病病毒多重PCR引物设计

在GeneBank中查出CSFV、PPV、PRV的所有已知序列。对病毒各基因区进行同源性分析 ,确定CSFV的E2 基因 ,PPV的VP2 基因和PRV的 gⅡ基因为各病毒扩增的靶序列。利用DNAsis对上述保守区进行引物设计 ,对设计出来的 3种病毒引物利用DNAstar进行引物二聚体分析 ,以避免引物之间形成稳定的引物二聚体。选出扩增序列为CSFV 2 88bp、PPV575bp和PRV 70 0bp的 3对引物 ,并对每对引物扩增序列的同源性或互补性进行分析。避免它们之间有较高的同源性或互补性 ,从而确定了

多重嵌合引物对四引物扩增受阻突变体系PCR的改进及在卵巢癌相关位点中的应用

目的:建立一种简单快速的方法,可同时检测两个卵巢癌相关单核苷酸多态性位点rs608995和rs749292。方法:采用多重嵌合引物策略改进四引物扩增受阻突变体系聚合酶链式反应(PCR),通过设计rs608995和rs749292的特异性嵌合引物,经单管一次PCR,琼脂糖电泳分析产物长度。结果:对46份全血样本,电泳结果均与测序一致,可准确分型。结论:经多重嵌合引物策略改进的四引物扩增受阻突变体系PCR可简便、快速、准确的获得2个位点的分型结果。

多价抗虫水稻外源Bt基因的多引物多重PCR检测方法

旨在研究多价Bt抗虫转基因水稻的简便有效的检测方法。根据3个Bt转基因事件的插入位置,设计引物,通过多重引物PCR技术,利用9条引物得到6条大小存在明显差异的条带,同时检测3个Bt基因的转基因情况。水稻3个Bt抗虫基因(cry1Ab/Ac、cry2A、cry1C)分别来源TT51-1、T2A-1和T1C-19,其中代表TT51-1事件插入的阳性、阴性条带大小分别为937 bp、718 bp;代表T2A-1事件插入的阳性、阴性条带大小分别为600 bp、434 bp;代表T1C-19事件插入的阳性、阴性条带大小分别为495 bp、792 bp;通过琼脂糖凝胶电泳能快速对转Bt基因插入事件水稻的纯合、杂合、阴性进行检测。该技术克服了多重引物之间可能存在的引物间的相互干扰的技术难度,对不同的PCR试剂有很好的兼容性,可配合水稻DNA的快速提取,迅速对大量选育后代进行分析。该方法的建立为利用多价Bt基因进行抗螟虫水稻分子育种提供了一个简便高效的基因检测技术,有助于提高Bt基因检测效率,加快抗螟虫水稻的育种进程。

基于PrimerHunter的多重PCR引物设计系统的构建与应用

PrimerHunter是一款多重PCR引物设计软件,该软件能够高效地设计出具有特异性的多重引物,但是只能在Linux系统的命令行中运行,而且没有考虑引物二聚体的问题。针对这些问题,文章建立了基于PrimerHunter的多重PCR引物设计系统,实现了PrimerHunter的界面化,完成了C/S模式向B/S模式的转换,同时增加了原软件不具备的引物二聚体检测模块,能够有效检测引物对之间的二聚体情况,为相关生物学领域研究提供了一种高效的多重PCR引物设计工具。

套式/多重PCR检测疟疾感染的应用研究

目的了解标签引物-套式/多重PCR技术在检测疟疾感染中的现场应用价值。方法随机采取我省疟疾流行区有发热症状的居民及家庭成员的耳垂血79份,同时制作厚血片和滤纸血样本各1份,用标签引物-套式/多重PCR检测所采集滤纸血样本中的疟原虫,并与镜检法进行比较。结果79份样本中,用标签引物-套式/多重PCR技术检出间日疟原虫阳性6例,镜检初检出10例间日疟原虫阳性,经复查血片后有4例排除了疟疾感染。镜检复核阳性的6例样本PCR均为阳性。以镜检复核为标准,两法阳性和阴性符合率为100%。结论标签引物-套式/多重PCR检测疟疾感染具高度敏感性和特异性,对疟疾鉴别诊断和明确诊断具有重要价值。

浙江省2005年鼠疫病原和血清学检测结果分析

目的了解我省鼠疫历史流行区是否存在动物鼠疫的流行。方法在监测区内捕获活鼠并收集死鼠,活鼠采血用放免、血凝、酶标及胶体金方法检测鼠疫F1抗体;鼠脏器用压印法分离鼠疫菌,用多重引物PCR的方法检测鼠疫的基因片段。结果我省首次用间接血凝试验(微量法)从3份鼠血清中检出鼠疫F1抗体,用多重引物PCR的方法从3头鼠脏器中检出鼠疫菌caf 1基因片段。结论我省的部分鼠疫历史流行区存在动物鼠疫复燃的可能,要加强鼠疫的监控工作。

多重特异性引物扩增技术鉴定小儿肺咳颗粒中鸡内金成分

建立多重PCR分子技术鉴定小儿肺咳颗粒中鸡内金真伪的方法。方法 采用甲醇预沉淀与CTAB结合法提取DNA,根据家鸡、麻鸭、家鹅的线粒体基因序列设计和筛选引物,建立基于特异性引物检测鸡内金的多重PCR方法,并进行方法学考察,用于市售小儿肺咳颗粒中鸡内金的真伪鉴别。结果 筛选得到的鸡、鸭、鹅内金DNA分别在94 bp,123 bp和155 bp处产生清晰明亮条带且未发现非特异性扩增,引物最佳组合浓度PGD: PAP: PAA为0.28: 0.16: 0.08 μM,PCR循环33次得到的条带清晰且无非特异性扩增,该方法特异性良好,灵敏度达1 ng/μL,该方法检测不同厂家10个批次小儿肺咳颗粒样品,发现1个批次检出有鹅内金掺伪,检出率为10.0%。结论 多重PCR分子技术鉴定方法可以很好地监控含鸡内金成方制剂的质量。

利用M-RAPD技术绘制不同病原微生物基因指纹图

目的 探讨一种多重随机引物 PCR方法 (M- RAPD)对不同种株病原微生物进行鉴定的可能性。方法 将 1 0个碱基的随机引物进行随机组合 ,利用三条组合的随机引物在较高的退火温度下对不同种株病原微生物染色体 DNA进行扩增 ,通过 1 5 g/L 琼脂糖凝胶电泳获得不同种株病原微生物的扩增图谱 ,并用软件 Gelworks1 d Intermediate进行分析。结果 初步实验表明 ,M- RAPD技术可以得到稳定的种株特异的 DNA指纹图谱 ,其条带清晰、数目较多、片段大小分布均匀。三引物的扩增产物包含了其中任意两引物的绝大多数扩增产物 ,大、小片段均可出现增减 ,但小片段更易增加 ;对同一种病原微生物三引物所提供的基因信息要远多于两引物所提供的信息 ,增加的信息量约为原来的 5 0 % ;不同耐药菌株间及其与相应标准株间差异亦很明显 ,但同种不同株间相同的扩增产物要多于不同的扩增产物。软件 Gelworks1 d Interm ediate的分析数据亦支持我们的实验结果。结论 M- RAPD技术对不同种株病原微生物染色体 DNA扩增时 ,能获取较丰富的遗传信息 ,可迅速、简便地鉴定不同种株的病原微生物。

儿童病毒性脑炎124例临床及病毒病原学分析

目的分析不同年龄段病毒性脑炎患儿的临床表现及脑脊液(CSF)病毒病原学特点。方法选取124例病毒性脑炎患儿,据年龄分为A组(<3岁)52例、B组(3～6岁)26例、C组(>6岁)46例。分析不同年龄段患儿的临床表现特点;应用多重引物聚合酶链式反应(PCR)方法对CSF进行病毒病原学检测,包括肠道病毒(EV)和疱疹病毒(HSV)I、II型及EB病毒(EBV)、巨细胞病毒(CMV),分析各病毒的季节与年龄分布的特点。结果 3组患儿均有发热、嗜睡、烦躁、淡漠等症状;A、B组伴有惊厥48例(61.5%),C组伴头痛44例(95.7%)。CSF病毒病原学检测阳性者78例(62.9%),其中以EV为主[36例(46.2%)],其次为HSV-Ⅱ型[18例(23.1%)],HSV-Ⅰ型未检出,CMV及EBV主要分布于4～9月;B组患儿病原检出率最高(76.9%)。结论 (1)除发热、嗜睡外不同年龄段病毒性脑炎患儿伴随症状不同;(2)应用多重引物PCR方法早期检测CSF病毒病原阳性率较高。

多重PCR在快速检测常见假丝酵母菌中的应用

目的建立临床常见感染假丝酵母菌多重PCR快速检测法。方法根据假丝酵母菌r DNA序列,设计光滑假丝酵母、白念假丝酵母和近平滑假丝酵母的种特异性引物,并应用真菌通用引物ITS1和ITS4,以白念假丝酵母、光滑假丝酵母、热带假丝酵母、克柔假丝酵母、近平滑和季也蒙假丝酵母共6种菌的DNA为模板,进行多重PCR,2%琼脂糖凝胶电泳检测结果。大肠杆菌,金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌为阴性对照。同一PCR反应均重复2次。实验室保存的77株假丝酵母菌(25株白念假丝酵母,15株光滑假丝酵母,15株热带假丝酵母,8株克柔假丝酵母,8株近平滑假丝酵母,6株季也蒙假丝酵母)检测其重复性和稳定性。结果得到3条种特异性引物,扩增出种特异性条带和ITS区域片段。重复2次均得出同样大小的产物片段。阴性对照均未扩增出条带。结论该方法能快速准确检测6种常见感染的假丝酵母菌,具有高特异性。与传统培养方法相比,提高了非白假丝酵母鉴定的准确性,缩短了检测时间,具有一定的临床应用价值。

儿童病毒性脑炎62例临床及病毒病原学分析

目的 探讨不同年龄组儿童病毒性脑炎临床表现差异及脑脊液病毒病原学特点。方法 选取首都儿科研究所2 0 0 2年 1月至 2 0 0 3年 2月收治的 6 2例病毒性脑炎患儿 ,根据年龄分为A组 ( <3岁 )、B组 ( 3～ 6岁 )、C组 ( >6岁 ) 3组。 ( 1)分析不同年龄组临床表现特点。 ( 2 )应用多重引物PCR方法对脑脊液进行病毒病原学检测 ,包括肠道病毒 (EV)、疱疹病毒 (HSV)Ⅰ、Ⅱ型、EB病毒、巨细胞病毒 (CMV) 5种。结果 ( 1) 3组患儿均有发热、嗜睡、烦躁、淡漠等症状 ;其他伴随症状 :A、B两组患儿中 2 4例 ( 6 2 5 % )伴有惊厥 ,C组中 2 2例 ( 95 7% )伴随头痛。 ( 2 )脑脊液病毒病原检测阳性者 39例 ( 6 2 9% ) ,其中EV 18例 ( 4 6 2 % ) ,HSVⅡ型 9例 ( 2 3 1% ) ,CMV、EB病毒各 6例 (各 15 4 % ) ,HSVⅠ型未检出。结论 ( 1)除发热、嗜睡以外不同年龄组病毒性脑炎患儿伴随症状不同。 ( 2 )

对孕妇外周血中胎儿细胞进行基因检测的三种方法比较

目的 建立用孕妇外周血中胎儿细胞进行基因分析的技术。方法 采用引物延伸预扩增(primed extension preamplification,PEP)法加 PCR、多重引物原位合成技术 (primed in situ labeling,PRINS)和巢式聚合酶链反应 (nested PCR)检测孕妇外周血中单个胎儿细胞的性别决定区 Y基因 (sex- de-termination region Y gene,SRY)基因片段。结果 PEP加 PCR方法检测 SRY基因的敏感性为 97.39%(14 9/ 15 3) ,特异性为 99.17% (119/ 12 0 )。PRINS技术检测 SRY基因的敏感性为 97.5 6 % (40 / 4 1) ,特异性为10 0 % (35 / 35 )。巢式 PCR检测 SRY基因的敏感性为 80 .0 0 % (2 4 / 30 ) ,特异性为 87.5 0 % (14 / 16 )。结论 PEP加 PCR技术和 PRINS技术是对孕妇外周血中单个胎儿细胞进行基因诊断的可靠技术 ,其敏感性高、特异性强 ,有望成为利用孕妇外周血中单个胎儿细胞进行非创伤产前诊断的常规方法。

利用母血中胎儿有核红细胞结合血清筛查和三维超声无创性产前诊断唐氏综合征

目的:利用母外周血中胎儿有核红细胞结合血清三联筛查及三维超声,建立快速无创性产前诊断唐氏综合征的有效模式。方法:早、中期孕妇共670例,采取血清三联筛查结合三维超声和病史选取唐氏高危孕妇,抽取高危孕妇的外周血,流式细胞术富集母血中的胎儿有核红细胞(Fetal Nucleated Red Blood Cells,FNRBCs);次日进行多重引物原位杂交(muti-primed in situ labeling,multi-PRINS)检测胎儿细胞21号染色体与Y染色体。结果:通过血清三联筛查和三维超声结合病史筛选出高危孕妇24例,高危孕妇在两日内即可确诊,24例中诊断23例染色体正常胎儿,包括男胎12例、女胎11例;诊断1例男性唐氏综合征胎儿。24例标本检测结果和实际胎儿核型符合。结论:血清三联筛查、超声检查结合病史筛选出高危孕妇,然后利用母血中胎儿有核红细胞进行多重引物原位杂交检测细胞染色体,可作为快速、无创性产前诊断唐氏综合征的有效模式,并可为其他胎儿染色体基因异常或者宫内感染的无创性产前诊断提供参考。