锁核酸和不对称扩增辅助的等位基因多重引物识别KRAS基因突变的研究

RAS突变的检测为指导结直肠癌的预测和预后提供了有力的工具。探讨一种简洁、低成本的用于检测KRAS基因突变的多重引物等位基因识别方法(multiplex primer allelic discrimination,MP_(m) AD)。利用不对称扩增和含锁定核酸(locked nucleic acid,LNA)的等位基因特异性引物、以及共同的反向引物和探针,进行多重孔检测和参考孔检测,以多重检测和参考检测的扩增循环数值差(ΔC_(q))来判定结果。同时使用福尔马林固定石蜡包埋组织(Formalin Fixed and Paraffin Embedded Tissues,FFPET)样本或在野生型基因组DNA背景下混合质粒进行非临床性能评价,并采用Kappa检验比较MP_(m) AD与Sanger测序的结果一致性。该方法对KRAS热点突变检测灵敏度至少为3%;凝胶电泳也验证了方法的特异性;重现性的变异系数(coefficient of variation,CV)<15%;同源基因检测未观察到交叉反应。通过分析115例FFPET标本,MP_(m) AD法与Sanger测序结果之间无统计学差异(k>0.9;p<0.001)。MP_(m) AD方法可以简洁、低成本地检测KRAS热点突变。

31个SNP位点多重PCR扩增和芯片分型技术的建立及其法医学应用

目的对SNP基因分型芯片在个体识别中的应用价值进行研究。方法根据SNP不同等位基因的序列设计探针,制成分型芯片。采用4个复合PCR体系,用末端标记了Cy5的引物进行复合PCR扩增,产物与寡核苷酸探针进行杂交,根据杂交产生的荧光信号值确定样品在各SNP位点的基因型。将这一方法应用于109份样本的分型,根据基因型分布统计分析31个SNP位点的法医学应用价值。同时,进行家系调查和方法灵敏度分析。结果方法的灵敏度为1ng;所检测的31个SNP位点的累积个体识别率为0.9999999999979(偶合率为2.13×10-12),二联体亲子鉴定中累积非父排除率为0.9609,三联体亲子鉴定中累积非父排除率为0.9970。家系调查的结果表明,这些位点等位基因由亲代向子代的传递符合孟德尔遗传定律。结论上述31个SNP位点为中高信息量位点,适用于法医学个体识别,可作为当前STR系统的补充。

15个STR位点在潮汕地区人群的群体遗传学分析

〔目的〕分析潮汕地区汉族人群15个STR位点遗传多态性。〔方法〕利用五色荧光标记多重PCR和全自动毛细管电泳技术对STR位点进行基因分型。〔结果〕统计分析346例无关个体15个位点的基因频率,所有位点均符合Hardy-Weinberg平衡。经计算,FGA、D2S1338和D18S5 1属于高度多态性位点,D8S1179、D2 1S11、D19S4 33、D13S317、vWA、D5S818和D16S5 39属于中高度多态性位点,而D37S82 0、CSF1PO、D3S135 8、TH0 1和TPOX多态性方面相对稍差。15个位点个体识别能力累积值>0 .999999999,三联体非父排除概率的累积值>0 .99999、二联体非父排除概率>0 .999,平均杂合度为0 .777,累积偶合率为1.2 6×10 -17。〔结论〕获得的潮汕地区汉族人群15个STR位点的等位基因频率,为将这些位点成功应用于本地区的亲子鉴定和个体识别提供依据。