优化的多重扩增阻滞突变系统-PCR对载脂蛋白E基因的简易分型

目的通过改进和优化多重扩增阻滞突变系统-PCR(multi-ARMS-PCR)条件,建立载脂蛋白E(ApoE)基因的简易分型方法。方法基于multi-ARMS-PCR的原理和特点,针对文献报道方法中存在的缺陷和错误,重新设计或改进引物。以外周血白细胞基因组DNA为模板,应用4个等位基因特异性寡核酸上游引物、1个通用下游引物和一对内参引物,分A,B两个管同步进行多重PCR反应。PCR扩增产物经过琼脂糖凝胶电泳分离-EB染色,根据电泳带型的差异,实现对ApoE 6种基因型的判定。结果新引物显著提高了扩增效率和反应特异性,排除了非特异条带的干扰,减少了ApoE基因分型的错判。结论采用优化后的multi-ARMS-PCR方法对ApoE基因型进行鉴定,具有操作简便、时间短、效率高、成本低的优点,值得推广。

基于扩增阻滞突变系统-聚合酶链式反应法的A1/A2牛奶鉴别试剂盒的开发及应用

目的基于扩增阻滞突变系统-聚合酶链式反应(amplification refractory mutation system polymerase chain reaction,ARMS-PCR)技术,开发A1A2牛奶鉴别试剂盒,并对市场上A2牛奶产品进行检测应用,实现对A2牛奶的鉴别检测。方法本研究先利用D-loop基因片段设计了牛内参基因引物探针组(标记FAM荧光)。随后,在β-酪蛋白基因突变位点分别设计了A1基因引物探针组和A2基因引物探针组(均标记VIC荧光)。基于ARMS-PCR技术构建了双通道ARMS-PCR反应体系与程序,进而成功开发了A1A2牛奶实时荧光ARMS-PCR试剂盒。为进一步验证试剂盒性能,将其应用于市场上A2牛奶的检测,并将检测结果与DNA测序法结果对比。结果本试剂盒特异性强,检测DNA灵敏度为0.1 ng/L;10份市售实际样品的应用检测结果与测序结果一致。结论本试剂盒特异性好,灵敏度高、准度度高,适用于A2牛奶的真实性鉴别。

扩增阻滞突变系统快速检测H型高血压患者MTHFR C677T基因型的应用研究

目的通过扩增阻滞突变系统-聚合酶链反应(ARMS-PCR)检测H型高血压患者5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)C677T基因型,以期建立一种低成本、简单快速的MTHFR C677T基因分型方法。方法基于湖南省H型高血压危险因素研究的大型流行病调查的人群基础,采用单纯随机方法,选取94例H型高血压患者作为研究对象。设计阻滞度递减的系列错配引物,采用ARMS-PCR对94例患者外周血样本的MTHFR C677T基因型进行鉴定,并抽取不同基因型进行测序验证。结果 ARMS-PCR产物电泳后条带清晰,易于判读MTHFR C677T基因型。94例H型高血压患者共检出CC基因型42例、CT基因型24例和TT基因型28例。ARMS-PCR与DNA测序结果一致。结论 ARMS-PCR经阻滞度递减的系列错配引物能有效对MTHFR C677T基因型进行鉴定,此法具有成本低、操作简单、用时短的优点。适用于各类基因的多态性分析。

基于突变阻滞扩增系统的实时荧光PCR技术检测幽门螺杆菌23S rRNA基因突变及其评价

目的探索突变阻滞扩增系统(ARMS)联合实时荧光PCR技术用于检测幽门螺杆菌23S rRNA基因突变的可行性。方法以幽门螺杆菌23S rRNA基因2143位点的两种基因型(野生型为AAA,突变型为AGA)质粒DNA为研究模型,设计ARMS引物同时对实时荧光PCR体系进行优化,对突变阻滞扩增系统联合实时荧光PCR技术的基因分型特异性进行评价。结果在与模板匹配的ARMS引物3'端附近故意引入错配碱基,降低该ARMS引物浓度和镁离子浓度,并采用两步PCR循环的反应程序,使ARMS引物的特异性增强,能够得到清晰的基因分型结果。结论这种基于突变阻滞扩增系统的实时荧光PCR技术,实验设计简便,特异性较好,并有望在此基础上发展成为适合临床应用的突变检测方法。

北京协和医院病理科首先开展蝎形探针扩增阻滞突变系统检测石蜡切片基因突变

北京协和医院病理科在国内首次引入蝎形探针扩增阻滞突变系统（scorpions amplification refractory mutation system,Scorpions ARMS）进行石蜡切片基因突变检测,并证实该项新技术较之传统恶性肿瘤石蜡切片的基因突变检测具有高敏感性和特异性，可为非小细胞肺癌与结直肠癌检测提供可靠依据，为临床医师制定有效的治疗方案提供指导。

扩增阻滞突变系统用于ABO血型基因分型研究

目的建立一种快速、低成本的ABO血型基因分型方法。方法设计6对引物,建立扩增阻滞突变系统(ARMS),对30例中国汉族无关个体外周血样本的ABO基因型进行鉴定,并与血清学方法和直接测序结果进行比较。结果 ARMS技术检测30例样本结果同血清学方法、直接测序结果吻合率达到100%。结论该研究建立的ABO血型基因型鉴定方法可快速检测出28种ABO基因型,具有一定的临床应用价值。

肺泡灌洗液外泌体表皮生长因子受体基因突变检测对晚期非小细胞肺癌患者的临床意义

目的通过对比分析晚期非小细胞肺癌(NSCLC)患者支气管肺泡灌洗液(BALF)外泌体、血液和肺癌组织3种标本表皮生长因子受体(EGFR)基因突变情况,评估支气管肺泡灌洗液外泌体标本是否适合应用于临床靶向治疗前的患者筛检,为晚期NSCLC患者尽早个体化治疗提供新的思路和筛检方法。方法回顾性分析2021年5月至2023年5月贵州航天医院呼吸与危重症医学科78例晚期NSCLC患者利用扩增阻滞突变系统法(ARMS)检测支气管泡灌洗液外泌体、血液、肺癌组织标本EGFR基因突变的结果并以肺癌组织标本结果为标准进行相互比较。结果支气管肺泡灌洗液外泌体、血液、肺癌组织标本分别检出EGFR突变型33、25、38例,EGFR基因野生型分别42、53、40例,检测突变率分别为42.3%(33/78)、32.1%(25/78)、48.7%(38/78)。支气管肺泡灌洗液检测无结果3例,假阴性率6.4%(5/78),血液检测假阴性率16.7%(13/78)。支气管肺泡灌洗液外泌体标本EGFR基因突变的检测符合率86.8%(33/38),血液标本检测符合率65.8%(25/38)。结论支气管肺泡灌洗液外泌体标本检测EGFR基因突变与血液、肺癌组织标本检测具有一致性(P>0.05),优于血液标本,适用于临床靶向治疗前的患者筛选,为晚期NSCLC患者尽早个体化治疗决策提供了新的思路和筛检方法。

478例江西地区非小细胞肺癌患者EGFR基因突变状态研究

目的分析江西地区非小细胞肺癌患者表皮生长因子受体(EGFR)基因突变的特点及其与临床特征(组织学分型、有无吸烟史、年龄、性别)的相关性。方法运用ADx-ARMS■ EGFR基因突变试剂盒,检测478例江西地区非小细胞肺癌EGFR基因突变状态,分析EGFR基因突变与临床特征的相关性。结果478例NSCLC患者共检测出EGFR基因突变193例,突变率为40.4%(193/478)。其中外显子19和21突变分别占突变总数的50.8%(98/193)和39.9%(77/193);腺癌和腺鳞癌基因突变率分别为41.2%(189/459)和57.1%(4/7);无吸烟史EGFR突变率52.3%(102/195)显著高于有吸烟史患者32.2%(91/283)(P<0.05);女性EGFR突变率为56.9%(124/218)显著高于男性的26.5%(69/260)(P<0.05)。结论江西地区NSCLC患者EGFR突变主要为19-Del和L858R,且常见于腺癌或腺鳞癌、无吸烟史的女性患者。

Sanger测序和AMRS-PCR检测ALDH2基因突变结果的比较

目的比较Sanger测序法与扩增阻滞突变系统PCR(ARMS-PCR)在检测患者线粒体乙醛脱氢酶2(ALDH2)基因突变方面的差异。方法将2019年10月至2020年1月于陆军军医大学第一附属医院治疗的350例有冠心病、心肌梗死、心绞痛、原发性高血压病史的患者纳入研究,收集受试者外周血标本。用Sanger测序法与ARMS-PCR法检测ALDH2基因突变,分析两种方法检测结果的差异。结果两种方法检测ALDH2基因突变的总突变率均为33.1%,AA纯合型突变率为3.7%,GA杂合型突变率为29.4%。两种方法检测结果的总符合率为100.00%,突变型阳性符合率和阴性符合率均为100.00%,ARMS-PCR法与Sanger测序法对临床标本的检测结果一致性较好(Kappa≥0.7,P<0.05),具有等效性。另外,ARMS-PCR法检测出的ALDH2基因型分布情况与性别、年龄无关(P>0.05)。结论Sanger测序法和ARMS-PCR法均可准确、有效地检测ALDH2突变情况,但基于成本优势和操作简便的原则,ARMS-PCR法在临床实践中更具优势。

扩增阻滞突变系统在脊肌萎缩症快速诊断中的应用

儿童进行性脊髓肌肉萎缩症，简称脊肌萎缩症（spinal muscular atrophy，SMA），是一种以脊髓前角运动细胞变性为病理特征，临床上以近端肌无力、肌萎缩为主要表现的常染色体隐性遗传性疾病。根据SMA发病年龄和病程的不同将其分为3型：Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。该病的致病基因称运动神经元生存基因，即SMN基因（survival motor neuron gene），它在染色体5q区域内存在2个同源拷贝，即位于端粒端的SMN1和位于着丝粒端的SMN2，两者在编码区内仅存在1个碱基的差异，即位于第7外显子上的840位碱基在SMN1为C，在SMN2为T，但SMN1和SMN2的氨基酸序列相同。

突变阻滞扩增系统快速检测胃黏膜中幽门螺杆菌对克拉霉素耐药性的可行性

目的评价突变阻滞扩增系统（ARMS）联合实时荧光PCR技术快速检测胃黏膜中H.pylori对克拉霉素耐药性的可行性。方法150份体外H.pylori培养阳性胃黏膜样本来自2013年1月至8月根除H.pylori治疗失败的H.pylori阳性患者。采用基于ARMS的实时荧光PCR检测这些样本中H.pylori相关耐药基因的突变类型，并测序验证其准确性。采用药物敏感试验（E-试验法）确定H.pylori菌株对克拉霉素的耐药性。统计学分析采用卡方检验。结果149份胃黏膜样本（已排除1例未检测到野生型或突变型的样本）中，2份基于ARMS的实时荧光PCR检测结果与测序结果不相符，符合率为98.7%（147/149）。149份进行药物敏感试验的H.pylori培养阳性菌株中，104份（69.8%）对克拉霉素耐药。101份采用药物敏感试验与基于ARMS的实时荧光PCR均检测出克拉霉素耐药，符合率为97.1%（101/104）。药物敏感试验和基于ARMS的实时荧光PCR检测克拉霉素的耐药率分别为69.8%（104/149）和67.8%（101/149），差异无统计学意义（χ2＝0.141，P＝0.932）。结论采用ARMS联合实时荧光PCR技术快速检测胃黏膜中H.pylori对克拉霉素的耐药性具有较强的可行性，其与测序方法和药物敏感试验有较高的符合率。

扩增阻滞突变系统研究进展及其在中药鉴定中的应用

就近年来国内外对扩增阻滞突变系统(ARMS)的研究进行总结,阐述了ARMS技术的原理、特点和发展,着重介绍了其在中药鉴定中的应用。与其他分子标记相比,ARMS技术具有简单、高效、准确与省时等优点,为中药鉴定提供了一条新的途径。

应用双侧扩增阻滞突变系统排除肾上腺脑白质营养不良分子诊断中假基因的干扰

目的应用扩增阻滞突变系统(amplification refractory mutationsystem,ARMS)排除ABCD1假基因的干扰,对肾上腺脑白质营养不良(adrenoleukodystrophy, ALD)家系进行基因突变分析。方法按ARMS引物设计原则设计上游引物(正常引物、突变引物)和下游公共引物,对家系成员的基因组DNA分别进行PCR扩增。结果R617C突变患者及其母亲的突变引物均扩增出特异性条带(107 bp) ,患者父亲和对照则未见条带,在基因组DNA水平证实了R617C突变的存在。结论双侧ARMS方法可以快速、有效地排除假基因干扰。

扩增阻滞突变系统检测晚期非小细胞肺癌患者外周血游离DNA中EGFR基因突变

目的探究外周血游离DNA(cf DNA)检测非小细胞肺癌(NSCLC)患者表皮生长因子受体(EGFR)基因突变的可行性。方法收集2013年7月-2014年1月湖北省肿瘤医院收治50例确诊为晚期NSCLC患者的肿瘤组织及配对的外周血样本,分别提取肿瘤组织DNA及cf DNA,采用基于实时荧光定量PCR的扩增阻滞突变系统(ARMS)检测两类样本中EGFR基因突变。结果以肿瘤组织的结果为准,cf DNA中检出突变的特异性为97.2%(35/36),敏感度为78.6%(11/14),一致性为92.0%(46/50),且具有和肿瘤组织相同的EGFR基因突变类型。结论 cf DNA和肿瘤组织的EGFR基因突变类型相同,一致性、特异性和敏感度较高,对于晚期难以获得组织的NSCLC患者,外周血可代替肿瘤组织应用于临床EGFR基因突变检测。

扩增阻滞突变系统在脊肌萎缩症快速诊断中的应用

儿童进行性脊髓肌肉萎缩症，简称脊肌萎缩症（spinal muscular atrophy，SMA），是一种以脊髓前角运动细胞变性为病理特征，临床上以近端肌无力、肌萎缩为主要表现的常染色体隐性遗传性疾病。根据SMA发病年龄和病程的不同将其分为三型：Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。该病的致病基因称运动神经元生存基因，即SMN基因（survival motor neuron gene），它在染色体5q区域内存在2个同源拷贝，即位于端粒端的SMN1和位于着丝粒端的SMN2，两者在编码区内仅存在1个碱基的差异，即位于第7外显子上的840位碱基在SMN1为C，

非小细胞肺癌患者KRAS基因突变情况分析

目的探讨非小细胞肺癌患者KRAS基因突变情况与临床特征间的相关性。方法收集经病理确诊的454例非小细胞肺癌患者的肿瘤组织,采用突变扩增阻滞系统(ARMS)技术检测组织标本中KRAS基因外显子2第12、13位密码子突变状态,分析基因突变与临床特征间的相关性。结果 454例非小细胞肺癌患者中有17例(3.7%)存在KRAS突变,第12位密码子共检出5种突变类型,分别是G12A(1.1%,5/454)、G12C(1.1%,5/454)、G12D(0.4%,2/454)、G12V(0.4%,2/454)、G12S(0.2%,1/454);第13位密码子检出1种突变类型,为G13D(0.4%,2/454)。KRAS基因突变率男性(6.2%,17/273)高于女性(0,0/181),两者差异有统计学意义(P<0.05)。结论非小细胞肺癌KRAS基因突变与患者性别有关,与年龄、病理组织类型、标本类型无关。ARMS技术操作简便,可以快速进行KRAS基因突变检测,有利于指导患者的个体化分子靶向治疗。

基于ARMS法检测BRAF V600E突变在甲状腺乳头状癌中的临床价值

目的探讨扩增阻滞突变系统(amplification refractory mutation system,ARMS)法检测BRAF V600E突变的可行性,并评估BRAF V600E突变对鉴别甲状腺结节性质的临床价值。方法采用ARMS法检测并比较179例甲状腺乳头状癌(papillary thyroid carcinoma,PTC)和115例甲状腺良性病变组织的BRAF V600E突变状态,计算BRAF V600E突变对鉴别甲状腺结节性质的各项诊断指标,分析BR A F V600E突变与PTC临床病理特征的相关性。结果ARMS法检测甲状腺病灶组织中的BRAF V600E突变方法可行,结果可信。BRAF V600E在PTC中的突变率为82.68%,而在良性组织中的突变率仅为1.74%,两者差异有统计学意义(χ2=183.568,P<0.01)。利用BRAF V600E突变判定甲状腺结节性质的诊断敏感度为82.68%,特异度为98.26%,准确度为88.76%,约登指数为0.8094。BRAF V600E突变与PTC患者的性别、年龄、肿瘤大小、病灶数目、双侧病灶、腺外侵犯以及淋巴结转移等因素无关。结论 ARMS法检测BRAF V600E突变具有较高的诊断敏感度和特异度,其对鉴别甲状腺结节的性质具有重要的临床早期诊断价值。

ARMS技术联合Taqman探针检测100例非小细胞肺癌EGFR基因突变

背景与目的表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)基因突变是决定表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFR tyrosine kinase inhibitor,EGFR-TKI)疗效最重要的预测因子,对EGFR基因突变进行检测,对指导患者个体化治疗具有重要意义。EGFR基因突变检测方法有很多,每种方法各有优缺点,本研究拟采用扩增阻滞突变系统(ampli cation refractory mutation system,ARMS)技术与Taqman探针相结合的方法,建立一种能快速、敏感及特异检测非小细胞肺癌EGFR基因突变的方法。方法首先,应用Primer Premier5.0软件在EGFR基因E746_A750和L858R处设计ARMS引物及Taqman水解探针。然后,以包含E746_A750缺失和L858R点突变的质粒为研究对象,进一步分析所建立方法的灵敏度、敏感性以及特异性。最后,用所建立的ARMS-Taqman法检测100例非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)临床标本。结果在无背景DNA干扰的情况下,ARMS-Taqman法检测灵敏度可达10copies。对于检测敏感性,在500copies/L野生型基因背景下,其敏感性达1%;在5,000copies/l野生型基因背景下,其敏感性高达0.1%-0.5%。对于检测特异性,以正常人白细胞DNA为研究对象,21L858R突变存在一定程度的非特异性扩增,但其最小Ct高达14.89,而19Del未见非特异性扩增。对100份临床标本进行检测,19Del21例,21L858R18例,总突变率为39.0%。结论我们所构建的ARMS-Taqman法是一种快速、简便以及具有较高灵敏度和特异性的EGFR基因突变检测方法,值得在临床上进一步推广和验证。

血浆EGFR基因突变检测在晚期非小细胞肺癌患者EGFR-TKI疗效评估中的价值

目的探讨血浆表皮生长因子受体(EGFR)突变状态检测在晚期非小细胞肺癌患者表皮生长因子受体酪氨酸酶抑制剂(EGFR-TKI)疗效评估中的价值。方法应用扩增阻滞突变系统(ARMS)法检测70例晚期非小细胞肺癌患者肿瘤组织及血浆的EGFR突变状态。以肿瘤组织中的EGFR突变状态检测为对照,计算血浆中EGFR突变状态检测的敏感性、特异性、一致性,并比较两种检测对患者EGFR-TKI疗效及预后评估的差异。结果以配对的肿瘤组织EGFR突变检测结果为对照,ARMS法检测血浆EGFR突变的敏感性、一致性及特异性分别为58.1%、72.9%、96.3%。在38例经过EGFR-TKI治疗的患者中,肿瘤组织EGFR突变型患者的有效率及中位无进展生存期均优于EGFR野生型患者(有效率:69%比11.1%,P=0.005;无进展生存期:10个月比3个月,P=0.003)。血浆EGFR突变型患者与肿瘤组织EGFR突变型患者的有效率及中位无进展生存期均相似(有效率:P=0.908;中位无进展生存期:P=0.593)。在血浆标本中,EGFR突变型患者的中位无进展生存期长于EGFR野生型患者(10个月比7个月,P=0.032)。EGFR突变型患者的有效率高于EGFR野生型患者,但差异无统计学意义(70.6%比42.9%,P=0.111)。结论血浆EGFR突变可预测晚期非小细胞肺癌患者EGFR-TKI疗效,但因较高的假阴性率,血浆EGFR野生型患者需应用肿瘤组织进一步检测。

PCR直接测序法与ARMS检测非小细胞肺癌EGFR基因突变

目的 比较PCR直接测序法与蝎形探针扩增阻滞突变系统（amplification refractory mutation system,ARMS）检测非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）中EGFR基因突变的敏感性.方法 用直接测序发与ARMS法同时检测154例NSCLC中EGFR基因第18、19、20、21外显子的突变情况.结果 男性84例,女性70例,年龄33 ～ 86岁,手术切除标本71例、活检标本79例,其中鳞状细胞癌27例、腺癌121例、腺鳞癌2例;另4例为胸水.测序法32例突变（32/154,20.8％）,ARMS法52例突变（53/154,33.8％）.两种方法均检测到突变者29例,均无突变者99例,直接测序法检测到突变而ARMS法阴性者3例,反之23例,不一致率差异有显著性（P＜0.000 1）.结论 检测NSCLC中EGFR突变情况时,ARMS法较直接测序法操作步骤少,突变率高.