全自动多重检测试剂同时检测HBV DNA、HCV RNA和HIV-1 RNA

目的寻找一种有效实用的全自动多重检测试剂同时检测HBVDNA,HCVRNA和HIV-1RNA系统MPLC-COBAS。方法笔者采用ACROMETRIX公司的NACTMHBVDNA,HCVRNA及HIV-1RNA核酸对照品,卫生部临床检验中心的HBVDNA,HCVRNA质控对照品,检测该系统的灵敏度;同时采用我中心酶免法(ELISA)初筛检结果阳性,经中和实验确认HBsAg阳性标本10份,经RIBA确认抗-HCV阳性标本3份,经WesternBlot确认抗-HIV阳性标本3份,检测该系统的阳性符合率;检测大量临床ELISA筛检结果为阴性的标本来检测其特异性,并且每次实验设立内对照,阴阳性对照以进行临床标本检测。结果该系统的检测灵敏度(95%可信限)为HBV病毒为24-60IU/mL,HCV病毒为78-125IU/mL,HIV-1RNA病毒为45-67IU/mL,阳性符合率为100%,假阳性率为0.13%。结论全自动多重检测试剂同时检测HBVDNA,HCVRNA和HIV-1RNA系统MPLC-COBAS用于检测临床标本是有效实用的,可进一步加大临床标本检测数量,将该系统更好地用于酶联阴性结果的大规模筛查。

细菌感染多重核酸检测试剂参考品的建立

目的建立细菌感染多重核酸检测试剂参考品并制定其质量标准,为相关产品的质量评价提供依据。方法选择34种可导致中枢神经系统、血液、呼吸道、肠道以及生殖道感染的致病性细菌或真菌,培养富集后应用全自动细菌鉴定及药物敏感分析系统VITEK2进行鉴定。鉴定正确的菌株,应用梯度稀释法测定浓度后进行分组混合成高浓度样本。应用全基因组第二代测序技术验证混合样本的组成情况和特异性。选择基于不同原理的多重核酸检测试剂进行协作标定,根据标定结果确定参考品的质量标准,并对参考品的稳定性进行考察。结果本参考品由28种细菌和6种真菌混合成7支混合参考品,编号为M1~M7,其中细菌的终浓度约为1×10~8~1×10~9 CFU/ml,真菌的终浓度约为1×10~6~1×10~7 CFU/ml。经全基因组第二代测序技术验证,参考品的组成正确且无交叉污染情况。分别应用基于PCR-熔解曲线、等温扩增以及靶向扩增第二代测序技术的多重核酸检测试剂对参考品进行检测,结果显示本参考品经过适当稀释后能够对试剂的准确性、特异性、重复性以及最低检出限等性能指标进行评价,且参考品各混合菌株间无交叉反应。稳定性研究结果表明反复冻融3次不影响本参考品的稳定性。结论本研究建立了细菌感染多重核酸检测试剂参考品并制定其质量标准,能够应用于相关参考品的质量评价。

3种致泻大肠埃希氏菌多重PCR检测试剂盒的研制与效用评价

本研究为了研制一种多重PCR检测试剂盒,用于对肠道致病性大肠埃希氏菌(Enteropathogenic Escherichia coli,EPEC)、产志贺毒素大肠埃希氏菌(Shigatoxin-producing E. coli,STEC)和肠道出血性大肠埃希氏菌(Enterohemorrhagic E. coli,EHEC)3种DEC(Diarrheagenic E. coli,DEC)的快速检测。优化所涉及的多重PCR检测体系和构建相应的检测试剂盒,其中的主要检测试剂采用冻干工艺,评价该试剂盒的检测特异性、灵敏度、重复性以及保质期。结果表明,本研究成功建立了针对于3种DEC的检测体系EP和检测体系ST;3种DEC标准菌株和分离菌株均出现明显的目标基因条带,而其他种类DEC标准菌株和分离菌株均未出现目标基因条带;该试剂盒检测管EP和检测管ST的检出限分别可达到1.5×10^3 cfu/mL和2.1×10^3cfu/mL,且二者检测重复率均为100%;该试剂盒可在4℃条件下保存12个月,也可在42℃环境运输120h,期间其检测效力不受影响。本研究研制的试剂盒性能好,检测结果稳定、可靠,适用于食品中3种DEC的快速检测。

全自动多重检测试剂同时检测HBV DNA,HCV RNA和HIV-1 RNA

前言 由于血清学检查病毒的窗口期或病毒抗原发生变异等原因导致了少许的但甚严重的输血传播病毒性感染的发生。近年来,使用核酸扩增检测(NAT)能明显减少血清学检测的窗口期。 NAT检测包括标本准备,特异性靶片段扩增和检测。在过去几年,已经建立了特异性的病毒序列探针以检测病毒核酸。最近,有几家实验室和公司已建立了多重NAT检测试剂。虽然已有报告采用多重NAT检测HBV、HCV和HIV-1病毒。

基于实时荧光定量PCR的番木瓜多重PCR高效检测方法

以pCaMV35S基因核酸检测试剂盒反应体系为基础,添加多重PCR反应所需的目标基因引物和番木瓜(Carica papaya L.)DNA,进行多重PCR反应,同时考察不合成荧光探针的情况下对目标基因进行实时荧光定量检测。结果表明,在实时荧光定量PCR反应体系中,多重PCR扩增的基因条带比常规PCR扩增的基因条带更亮,在不合成荧光探针的情况下实现目标基因的实时荧光定量PCR反应,以期建立一种基于实时荧光定量PCR的多重PCR检测方法。

禽流感H5、H7、H9亚型多重实时荧光RT-PCR检测试剂盒灵敏性试验

为了确定深圳出入境检验检疫局和深圳太太基因工程有限公司联合研制的禽流感H5、H7、H9亚型多重实时荧光RT-PCR检测试剂盒对H5和H9亚型禽流感的灵敏度,通过测定已知鸡胚半数致死量(ELD_(50))的标准毒株的进行了定量。

6种食品致病菌的多重PCR检测

目的寻求食物中毒诊断及食品检测的有效方法。方法建立多重PCR体系一次检测多种食品致病菌方法。结果可以一次检测出肠毒性大肠埃希菌(E.coli-ETEC),蜡样芽胞杆菌(Bacilluscereus),沙门菌属(Salmonellaspp),大肠埃希菌O157:H7(E.coli-O157:H7),志贺菌属(Shigellaspp),霍乱弧菌(Vibriocholerae)等菌属或菌。结论多重PCR体系检测6种菌DNA的灵敏度最低为10.30fg,与单独的PCR检测的灵敏度相同。将它做成体外基因诊断试剂盒,将成为细菌性食物中毒诊断及食品检测的有效工具。

PRV、PCV-2、PPV多重PCR试剂盒的研制

根据GenBank中的猪伪狂犬病病毒(PRV)gE、猪圆环病毒2型(PCV-2)ORF2、猪细小病毒(PPV)VP2基因序列,设计了3对引物,研制了检测PRV、PCV-2和PPV的多重PCR试剂盒。该试剂盒扩增的阳性条带分别为300bp、420bp、680bp。敏感性、特异性结果显示,该试剂盒对3种病毒的最低核酸检测量分别为PRV45.2pg/L、PCV-235.7pg/L、PPV0.30ng/L,而猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合症(PRRSV)、大肠杆菌、猪支原体的扩增结果均为阴性。对125份自然感染病猪样品的检测结果表明,该试剂盒检测结果与单一PCR检测结果完全符合。结果表明该多重PCR试剂盒具有很好的特异性和敏感性,可用于临床PRV、PCV-2和PPV的检测。

MPX V2.0试剂在血液核酸筛查中的应用

目的通过与MPX V1.0试剂的比对,评估罗氏诊断公司MPX V2.0试剂在血液筛查中的可行性和适用性。方法在罗氏Cobas核酸检测平台上,分别使用MPX V1.0或MPX V2.0试剂对9 418人次HBs Ag、抗-HCV、抗-HIV、TP ELISA阴性的无偿献血者血液标本进行核酸定性检测,并对NAT阳性样本进行鉴别确认试验和电化学发光检测。结果 9 418人次标本经MPX V1.0检出混样阳性样本10例,6例拆分阳性样本,检出总阳性率0.064%;MPX V2.0检出9例混样阳性,6例拆分阳性,检出总阳性率0.064%;MPX V2.0对MPX V1.0,相对阴性符合率99.98%,相对总符合率99.96%;MPX V1.0和MPX V2.0均检测为阳性者4例,MPX1.0和MPX V2.0单独阳性者各2例。用确认试验鉴别4例HBV DNA阳性,结果1例HCV RNA阳性,3例不确定;发现1例低CT值(MPX V1.0 CT=16.4,MPX V2.0 CT=18)样本,经MPX V2.0判定为HCV感染,推测为HCV感染窗口期,之后经追踪检测证实。结论 MPX V2.0试剂与MPX V1.0试剂拆分率接近,检出总阳性率一致,相对总符合率较高;两种试剂均有对低病毒载量(<20 U/ml)样本的漏检,灵敏度仍待提高;MPX V2.0可直接区分病毒感染类型,更有利于对阳性献血者的解释和追踪随访,以指导其早期就诊。

新型H7N9型流感病毒多重荧光RT—PCR检测方法建立

为研制新型H7N9亚型流感病毒快速检测试剂盒，珠海出入境检验检疫局的工作人员根据GenBank中公布的新型H7N9亚型（2013年）流感病毒血凝素抗原（HA）和神经氨酸酶抗原（NA）的基因序列，设计两套特异性的引物和探针，建立基于TaqMan探针的多重荧光RT—PCR快速检测新型H7N9亚型流感病毒方法。

腺病毒、EB病毒和巨细胞病毒多重荧光定量PCR检测试剂的开发及验证

目的开发一次试验即可明确是否属于腺病毒、EB病毒和巨细胞病毒中的某一种感染的多重检测试剂。方法设计特异性的腺病毒、EB病毒和巨细胞病毒的引物探针,探索最优的PCR反应体系。结果通过产品灵敏度、精密度、准确度及稳定性的研究结果证明,该试剂组分对痰液样本内腺病毒、EB病毒及巨细胞病毒的检测灵敏度和特异性均达到95%以上、准确度达到100%,该试剂置于4℃存放4 d、反复冻融6次,检测结果显示无明显差异。结论该试剂相关性能达到了国内诊断试剂所要求的主要性能指标。