基于新型高保真Taq酶的多重等位基因特异性PCR方法的建立与应用

在8号染色体存在部分替换片段的小鼠上挑选3个SNP位点进行初步方案检验,包括高保真Taq酶的特异性测试以及引物浓度对分型结果的影响,并评价该方法的灵敏度;之后应用该技术检测野生1号染色体替换系小鼠上的9个SNP的不同样本。对Taq酶的特异性研究表明:引物在未引入突变的前提下检测结果与测序结果保持一致;引物稀释实验说明浓度最低为0.003~0.006μmol/L,灵敏度的检测结果表示最低浓度检测限可达0.07 ng/μL以下。最后检测得到5种标准样本的基因型,其代表9个SNP的组合。成功验证并建立该新型高特异性Taq酶应用于多重等位基因特异性PCR实验的总体流程。提供一套具备高特异性、能够针对多个SNP位点进行检测的低成本方案,对多重等位基因特异性PCR技术的开发同样具有参考价值。

利用多重等位基因特异PCR鉴别人参、西洋参

目的:查找并发现参类药材的SNP位点,利用多重等位基因特异PCR同时鉴别人参、西洋参。方法:查找GenBank上已收载的参类药材序列,进行比对分析,根据人参、西洋参的SNP位点设计引物,对PCR反应体系进行优选。在此基础上,对20个不同来源的人参、西洋参样品进行PCR扩增,根据各自的特异条带进行鉴别。结果:当退火温度为66℃时,出现249 bp条带的为人参,1 049 bp条带的为西洋参。该鉴别反应特异性高、重复性好,能在同一反应中准确鉴别人参、西洋参。结论:多重等位基因特异PCR能成功地对人参、西洋参进行鉴别,在中药材分子鉴定中具有推广应用价值。

等位基因差异特异性PCR检测HBVDNA的前C区1896突变位点及其临床意义

为了探讨ＨＢＶ前Ｃ区 １８９６突变位点检测的临床意义，采用３－末瑞等位基因差异特异性ＰＣＲ方法对９５例乙型肝炎病毒感染者的ＨＢＶＤＮＡ１ ８９６位点进行基因型（野生株／突变株）的检测，结果显示：总突变率为６４．２％，总野生率为５５．８％，纯野生型和纯突变型的检出率分别为２８．４％和２７．４％；不同临床类型的乙肝病毒感染者均可出现突变，其野生型、突变型和混合感染型的检出率之间的比较无显著性差异（Ｐ＞０．０５），急性乙肝与慢性乙肝、携带者、肝硬化和肝癌的总突变率存在差异（Ｐ＜０．０５）；血清不同ＨＢｅ系统均可发生突变．抗－ ＨＢｅ阳性组的突变率显著高于ＨＢｅＡｇ阳性和ＨＢｅ系统阴性组（Ｐ＜０．０５），提示：机体感染了ＨＢＶ后．变异主要是发生在慢性持续性感染过程中．突变株逐渐替代了野生株并成为优势株．使宿主得以持续感染ＨＢＶ。

用等位基因特异性PCR筛查海南省黎族人β-地中海贫血IVSII654(C→T)突变

目的:研究海南省黎族人群β-地中海贫血IVSII654(C→T)突变的发病率。方法:应用等位基因特异性聚合酶链反应(PCR)技术筛查海南省白沙、昌江、陵水、琼中、保亭等县黎族人群中β-地中海贫血IVSII654(C→T)突变。结果:共筛查了788例黎族人DNA标本,未发现β-地中海贫血IVSII654(C→T)突变。结论:IVSII654(C→T)突变不是海南省黎族人群中主要的β-地中海贫血的基因类型。

等位基因特异性引物和TaqMan-MGB探针双抑制野生等位基因扩增的实时荧光定量PCR检测JAK2V617F突变率

本研究建立在外周血基因组DNA中定量检测JAK2V617F突变率的荧光定量PCR检测方法并探讨其临床应用价值。在实时荧光定量PCR分析系统中,应用等位基因突变引物和等位基因野生TaqMan-MGB探针共同抑制JAK2V617F野生等位基因扩增,从而特异性地扩增JAK2V617F突变等位基因。通过测定不同JAK2V617F突变率标准品及其循环阈值(Ct值),建立JAK2V617F突变率定量测定方法,并对89例表观健康人外周血基因组DNA中JAK2V617F突变率进行检测。结果表明,建立的方法定量检测JAK2V617F突变率的下限为0.1%,检测JAK2V617F突变率的批内、批间平均变异率分别为4.1%和6.1%。对89例表观健康人外周血基因组DNA中JAK2V617F突变率检测显示,其中2例为JAK2V617F阳性,突变率分别为0.64%和0.98%。结论:建立的JAK2V617F突变率定量检测方法具有检测灵敏度高和重复性好的特性,适合骨髓增殖性疾病的诊断及疾病进程和疗效监测。本方法检测原理可用于各种单碱基突变率的检测,具有广泛的应用前景。

等位基因特异PCR结合熔解曲线分析快速检测线粒体DNA A1555G突变

目的建立一种线粒体DNA A1555G突变的快速检测方法。方法以45例线粒体耳聋患者为研究对象,采用等位基因特异PCR结合熔解曲线分析对线粒体DNA A1555G突变位点进行检测,根据得到的熔解曲线分析线粒体DNA A1555G突变。并与PCR产物直接测序法结果进行比较。结果线粒体DNA A1555G同质性突变时只出现一个峰且峰尖所对应的Tm为(82±0.5)℃;线粒体DNA A1555G未发生突变时只出现一个峰且峰尖所对应的Tm为(79±0.5)℃;线粒体DNA A1555G异质性突变时出现2个峰且各自峰尖所对应的Tm为(82±0.5)℃和(79±0.5)℃。45例样本的检测结果与PCR产物直接测序法的结果符合率达100%。结论等位基因特异PCR结合熔解曲线分析具有操作简便、结果准确、快速等特点,可作为线粒体DNA A1555G突变检测的常规方法。

等位基因特异多重PCR快速检测结核分枝杆菌异烟肼耐药性研究

了解北京地区异烟肼(INH)耐药结核分枝杆菌(MTB)的分子特点,评价等位基因特异多重PCR在INH耐药性快速检测中的应用价值。选取102株北京地区MTB临床分离株,首先分别采用PCR-RFLP和反向线性杂交技术(RLB)检测耐药相关基因katG和inhA突变,然后运用等位基因特异多重PCR方法同时检测katG和inhA基因突变,并与PCR-RFLP和RLB分别检测的结果进行比较。采用等位基因特异多重PCR检测发现,INH耐药株中60.3%(35/58)存在katG315突变,13.8%(8/58)发生了inhA突变,两者同时突变率为6.9%(4/58),INH敏感株中没有发现katG315突变,而inhA突变率为18.2%(8/44)。上述检测结果与PCR-RFLP和RLB分别检测的结果完全一致,且等于两种方法结果之和,提示等位基因特异多重PCR可完全取代PCR-RFLP和RLB。北京地区INH耐药菌株以katG315 AGC→ACC突变为主;联合检测katG315和inhA基因可提高INH耐药株的检出率。等位基因特异多重PCR操作简便,结果易于判断,可作为临床MTB菌株中INH耐药性快速检测的辅助手段。

建立基于脱氧次黄嘌呤核苷修饰等位基因PCR方法检测EGFR基因热点突变

目的建立基于脱氧次黄嘌呤修饰等位基因特异荧光聚合酶链反应(d I-AS-PCR)方法,检测表皮生长因子受体(EGFR)基因热点突变L858R和19del(2235~2249,2236~2250)。方法设计包含扩增EGFR基因L858R和19del热点突变在内的特异性引物、荧光探针和内参体系;且特异检测基因突变的等位基因PCR引物3’-末端n-1或n-2位置采用脱氧次黄嘌呤(d I)修饰。建立标准品和质控样品,应用荧光PCR检测,并分析结果。结果 d I-AS-PCR能够在野生型背景下检测低于0.1%的突变,对50例肺癌临床样本进行检测,有9例(18%)EGFR基因发生L858R突变,14(28%)例19del基因突变。EGFR基因热点突变率为46%,其检测结果与DNA测序完全一致。结论基于d I-AS-PCR技术的特异荧光PCR检测EGFR基因热点突变,敏感性高,特异性强,可以应用于临床EGFR基因突变检测,指导个性化用药及酪氨酸激酶抑制剂(TKI)治疗耐药监测。

一种检测细胞微量点突变的方法——等位基因特异的PCR

为了灵敏、方便地检测出细胞群体中含量极低的点突变 ,利用一 β珠蛋白基因簇Gγ 2 0 2C→G突变的杂合细胞株 ,优化传统的等位基因特异PCR的反应条件 ,以定量的PCR产物为模板 ,在含 5 %甲酰胺的体系中用半巢式的等位基因特异引物进行扩增 .结果表明 ,该方法灵敏可靠 ,可快速检测到细胞群体中低于 0 0 2 5

多重PCR检测捻转血矛线虫苯并咪唑类药物抗性等位基因

利用GoenBank发表的捻转血矛线虫B微管蛋白葵因组DNA序列设计2对引物,建立检测捻转血矛线虫苯并咪哇类药物抗性的多重PcR方法,利用该方法检测我国不同地区捻转血矛线虫对苯并咪哇类药物的抗性,并用生物学检测验证,结果表明,建立的多重PCR方法在杭性检测上具有很强的特异性,澳大利亚抗性虫株只有F1和F3条带,上海敏感虫株只有F2和F3片段;序列分析证实抗性虫株编码B微管蛋白第200位氮墓酸的密码子为TAC,敏感虫株为TTC。并且该法具有很高的灵敏性,检测基因组DNA的最低量为50ng。生物学检测,澳大利亚杭性虫株丙硫苯咪哇LD_50ml,上海敏感虫株的LD50为0.0023,与多重PCR结果相符,说明多重PCR可以用于捻转血矛线虫苯并咪吐类药物抗性的检测.利用该技术检测源于新疆石河子、伊宁,安徽五河,江苏南京、徐州等地的虫株发现,这些地理株均表现为敏感型,丙硫苯咪哇LD50在0.0023-0.0032之间,提示我国捻转血矛线虫苯并咪哇类药物抗性尚不严重。

等位基因特异性PCR及MLPA检测CMT患者PMP22突变基因的结果比较

目的联合应用等位基因特异性PCR与多重连接探针扩增技术(MLPA)对腓骨肌萎缩症(CMT)患者进行PMP22基因重复突变的检测,并初步验证两种方法所得结果是否一致。方法分别应用等位基因特异性PCR及MLPA技术对6例散发CMT患者及6例正常对照进行PMP22基因重复突变检测。结果 6例CMT患者及6例对照经等位基因特异性PCR均未检测出PMP22基因的特异性连接片段,且所有病例及对照经MLPA技术检测结果亦均为阴性,两种方法检测结果一致。结论利用等位基因特异性PCR和MLPA两种方法检测PMP22基因重复突变所得的结果基本一致。

等位基因特异性PCR结合金磁微粒免疫层析检测膀胱癌患者尿液中TERT突变

目的建立可检测人尿液DNA中端粒酶逆转录酶(TERT)启动子区域突变的方法。方法设计等位基因特异性PCR引物,利用温度梯度PCR确定等位基因特异性PCR程序,利用金磁微粒检测板进行扩增产物检测。收集34例膀胱癌患者的尿液,提取DNA,利用该文建立的等位基因特异性PCR结合金磁微粒免疫层析方法检测TERT启动子区域突变。结果建立了结合等位基因特异性PCR和金磁微粒免疫层析的TERT启动子区域C228T和C250T突变检测方法。34例膀胱癌患者尿液中8例患者存在C228T突变,1例患者存在C250T突变。结论该研究建立了TERT启动子区域C228T和C250T突变检测方法,可应用于膀胱癌患者尿液DNA突变检测。

应用多重PCR技术检测慢性淋巴细胞白血病IgVH基因突变

免疫球蛋白重链可变区(IgVH)基因突变是慢性淋巴细胞白血病(CLL)最重要的独立预后因素之一,为探讨CLL患者IgVH基因突变状态,应用多重PCR技术检测9例CLL患者的IgVH基因,纯化PCR扩增产物后直接测序,应用IMGT/V-QUEST工具分析,明确有无IgVH突变及突变位置。结果表明9例CLL患者皆扩增出395-465bp区域(MIXI)或290-360bp区域(MIXII)单克隆条带,测序结果显示5例患者有突变,IgVH基因分别为IGHV3-1103、IGHV3-901、IGHV3-2301、IGHV4-5901和IGHV4-3402;4例无突变,IgVH基因为IGHV3-5301、IGHV3-2303、IGHV3-3305和IGHV3-701。结论PCR检测IgVH基因突变,简化了繁琐的实验过程,缩短了实验时间,解决传统PCR对IgVH基因突变检测的桎梏,值得在临床和科研中推广使用。

特异性等位基因PCR技术在昆虫抗药性研究中的应用

特异性等位基因PCR（PCR amplification of specific alleles,PASA）是一种快速检测DNA单个碱基突变的方法,也叫做等位基因特异扩增（allele-specific amplification,ASA）、等位基因特异性PCR（allele-specific PCR,ASPCR）和放大受阻突变体系（amplification refractory mutation system,ARMS）。

MLPA和多重PCR法检测假肥大性肌营养不良患者DMD基因突变

目的应用多重连接依赖式探针扩增(MLPA)法和多重PCR法对临床诊断为假肥大性肌营养不良患者进行基因诊断,并比较两种方法检测DMD基因缺失和重复改变的效果。方法选择2005年至2007年在中国医科大学盛京医院儿科就诊的51例DMD患者和8例BMD患者。采用MLPA法对经多重PCR法检测过的患者的DMD基因的缺失/重复突变进行突变筛查,同时对先证者的母亲进行基因的缺失/重复突变检测。结果用多重PCR方法在59例假肥大性肌营养不良症患者中检测到31例患者有外显子缺失。MLPA检测出33例外显子缺失,6例外显子重复和1例点突变,同时检测出26例患儿的母亲为携带者。MLPA比多重PCR多检测出10例DMD基因突变,两种方法共同检测出的30例突变中MLPA检测出16例基因突变范围比多重PCR大。结论与多重PCR法相比,MLPA更加简便、快捷、可靠,同时可以对携带者进行诊断,是一种高效的遗传病基因诊断手段。

多重等位基因特异多聚合酶链反应产前基因在诊断β-珠蛋白生成障碍性贫血中的应用

目的 探讨多重等位基因特异多聚合酶链反应(PCR)产前基因诊断β-珠蛋白生成障碍性贫血的临床应用价值。方法 在B超监视下对21名孕妇行羊膜腔穿刺,抽取羊水20ml,常规酚-氯仿法提取DNA,应用多重等位基因特异PCR检测其羊水细胞的β-珠蛋白的5种基因突变类型(CD17,CD41～42,IVS-Ⅱ654,nt-28,nt-29)。结果 检测的21例中,4例双重杂合子及1例纯合子,均选择流产。16例为正常或单个突变的杂合子,胎儿出生后取脐血验证并随访观察,现小儿9个月～3.2岁,均健康。结论 多重等位基因特异PCR可用于β-珠蛋白生成障碍性贫血高风险胎儿的产前基因诊断,在指导β-珠蛋白生成障碍性贫血阳性家系的选择性妊娠中具有一定的临床意义。

WTK1细胞tk基因突变的多重PCR分析

目的探讨WTK1细胞tk位点自发和诱发突变体的突变谱和突变热点。方法用甲磺酸甲酯、丝裂霉素C和叠氮钠染毒WTK1细胞后,筛选出tk基因突变集落,用多重PCR方法对WTK1细胞tk基因突变谱进行分析。结果三种受试物均能诱导WTK1细胞tk位点突变频率增高,且存在剂量-反应关系;所分析的突变体中绝大部分缺失tk基因外显子4和5-7。结论三种受试物对WTK1细胞均有致突变作用;tk位点的突变存在明显的突变热点。