蜂蜜中转基因成分启动子和终止子的多重实时荧光PCR法检测

为能高效率定位蜂蜜中的转基因可疑阳性样品,以10种转基因启动子和终止子(花椰菜花叶病毒35S启动子(pCaMV35S)、农杆菌的胭脂碱合成酶基因终止子(tNOS)、玄参花叶病毒的35S启动子(p FMV35S)、农杆菌的胭脂碱合成酶基因启动子(pNOS)、玉米泛素基因的启动子(pUbi)、烟草的花蕊特异性TA29的基因发育调节启动子(pTA29)、豌豆二磷酸核酮糖羧化酶基因的终止子(tE9)、章鱼碱合成酶终止子(t OCS)、谷氨酰胺转移酶7终止子(tg7)、花椰菜花叶病毒终止子(tCaMV35S))为研究靶标,进行10种启动子和终止子的引物和探针组合筛选、反应条件优化、灵敏度测定、质控品测试比对等实验,建立3组多重实时荧光PCR反应体系,并将其应用于市售蜂蜜的检测。结果表明:建立的3组多重实时荧光PCR反应体系能精准检出目的基因,其灵敏度分别为0.01、0.04、0.04 ng/μL;14种转基因质控品的测试显示多重实时荧光PCR和单重实时荧光PCR的检测结果一致;40份市售蜂蜜的筛查中,有两份蜂蜜检出pCaMV35S和tNOS,其余未检出,该方法大大提高了检测效率。该方法为蜂蜜中转基因成分的检测提供了快筛快检技术,同时也适用其它产品转基因成分的检测。

基于多重实时荧光定量PCR技术检测高危型人乳头瘤病毒E6/E7 mRNA的临床研究

目的 研究基于多重实时荧光定量PCR技术检测高危型人乳头瘤病毒(HPV)E6/E7 mRNA的价值。方法 选择2022年1月至2022年7月我院进行宫颈癌筛查的患者60例,分别采取多重实时荧光定量PCR技术测定高危型人乳头瘤病毒E6/E7 mRNA情况,并将病理学检查结果作为金标准,分析基于多重实时荧光定量PCR技术检测高危型人乳头瘤病毒E6/E7 mRNA的价值。结果 HPV 16、18、31、33等九类型的最低检测为10 copies/μL,但HPV 51、52、56、58等五类型最低检测是100 copies/μL。另外通过多重实时荧光定量PCR检测高危HPV E6/E7 mRNA和生殖道内常见病原菌例如大肠埃希菌、取淋病奈瑟菌、梅毒螺旋体、金黄色葡萄球菌等,其结果均显示阴性,且检测结果的特异性良好。薄层液基细胞学的检查结果与病理学检查并无差别(P>0.05)。多重实时荧光定量PCR技术的符合率91.67%(55/60),灵敏度83.33%(15/18),特异度95.24%(40/42)。结论 基于多重实时荧光定量PCR技术在HPV E6/E7 mRNA检测中意义重大,存在较高的灵敏度及特异度,可成为宫颈病变筛查的主要方式。

3种常见金银花致病菌多重实时荧光定量PCR检测方法研究

为了建立可同时检测炭疽病病原菌(Colletotrichum gloeosporioides)、白粉病病原菌(Erysiphe lonicera)和褐斑病病原菌(Cercospora rhamni)3种金银花重要叶部病原菌的多重实时荧光定量PCR快速检测方法,本试验基于3种病原菌ITS片段序列分别设计特异引物和TaqMan荧光探针,并制备重组质粒建立标准曲线;对建立的多重实时荧光定量PCR检测方法进行特异性、灵敏度、准确性验证。结果表明,本研究建立的多重实时荧光定量PCR快速检测方法仅针对金银花炭疽病、白粉病和褐斑病病原菌有特异性扩增;最低检测限为2.94×10^(2)copies/μL,比普通PCR法高100倍;利用本方法检测15份有叶部病害症状的金银花病叶,与DNA测序结果完全一致。综之,本研究建立的多重实时荧光PCR检测方法特异性强、灵敏度高,为金银花炭疽病、白粉病和褐斑病的早期诊断提供了技术支持。

多重实时荧光PCR TaqMan-MGB杂交探针标记法快速鉴定转基因玉米MIR162

为对转基因玉米MIR162的进口实行监测、规范转基因玉米在国内市场中的流通,建立一种转基因玉米MIR162准确快速的检测方法,通过设计转基因玉米MIR162品系特异性序列的引物和探针,摸索和优化多重荧光PCR体系和参数,开发建立多重实时荧光PCR TaqMan-MGB杂交探针标记法快速鉴定转基因玉米MIR162。结果表明,转基因玉米MIR162品系标准品和平行样品中内标基因和品系特异性基因均出现明显扩增曲线,其他转基因玉米品系标准品仅内标基因有扩增曲线,空白对照无扩增曲线,说明该TaqMan-MGB探针对转基因玉米MIR162品系具有扩增特异性。该方法可作为鉴定筛查转基因玉米MIR162品系及其转化体成分的有效方法,用于规范管理转基因产品在市场上的流通。

应用多重实时荧光PCR方法对8种动物毛纤维种类鉴别的研究

本研究旨在利用多重实时荧光PCR方法对水貂、狐狸、骆驼、兔、山羊、绵羊、鸭和鹅8种动物毛纤维进行物种鉴定研究。利用碱裂解法加入二硫苏糖醇,并结合硅珠吸附核酸法来优化动物毛纤维DNA的提取;根据8种动物16S rDNA基因特异核苷酸序列设计通用PCR引物和特异性TaqMan荧光探针;通过优化引物和探针浓度及退火温度等PCR反应体系和条件,建立了多重实时荧光PCR检测体系;并对多重PCR体系的特异性、灵敏度、重复性和适用性进行评估。结果表明,使用SDS-二硫苏糖醇DTT-蛋白酶K结合Chelex-100法,并利用硅珠纯化提取动物毛纤维DNA效果最佳,满足实时荧光PCR检测要求。本方法 DNA灵敏度为0.01ng,混合样本方法检出限为1.0%。因此本方法能够从动物毛纤维提取高质量DNA,建立的多重实时荧光PCR检测体系具有特异性强、重复性好和灵敏度高等优势。本方法可用于水貂、狐狸、骆驼、兔、山羊、绵羊、鸭和鹅8种动物及其混合物毛纤维的鉴定,为拓展动物毛纤维在物种识别、分子进化研究、分子标记辅助育种和遗传资源评价等领域中的应用奠定基础。

食源性致病菌多重实时荧光PCR检测扩增内标的构建及评价

多重实时荧光PCR在食源性致病菌检测中具有重要的作用,扩增内标(IAC)可用来指示其检测过程中可能出现的假阴性检测结果。采用来源于人类腺病毒基因的一段序列设计IAC,并对其检测特异性、扩增效率以及与目的致病菌基因组DNA的抗干扰扩增能力进行了评估。结果表明,本IAC引物在供试菌株中均没有非特异性扩增结果,扩增效率达99.44%,而且对供试沙门氏菌(Salmonella spp.)、大肠杆菌O157:H7(Escherichiacoli O157:H7)以及单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)的多重实时荧光PCR扩增没有任何干扰,在食源性致病菌多重检测技术的建立中具有广泛的应用前景。

应用含内参的多重实时荧光RT-PCR方法快速检测登革病毒和基孔肯雅病毒

目的建立一种登革病毒、基孔肯雅病毒并含人类基因内参检测的多重实时荧光RT-PCR方法,能在同一反应管内同时检测目前发现的所有来源的登革病毒或基孔肯雅病毒。方法针对登革病毒3′端非编码区和基孔肯雅病毒结构蛋白E2-6K-E1区以及人体各类组织细胞中均能稳定表达的RNAse P基因,设计了3套特异性引物和探针,建立了1套能同时检测登革病毒、基孔肯雅病毒及含有人类基因检测内参的多重实时荧光RT-PCR方法,对其灵敏性和特异性进行了验证,并对临床发热病人标本进行了应用评估。结果该方法对检测体外转录合成的登革病毒和基孔肯雅病毒RNA的灵敏性可达最低每个反应10～100拷贝,对检测登革1型病毒和基孔肯雅病毒的灵敏性分别可达最低每个反应0.1TCID50/mL和1TCID50/mL。用20株登革病毒、4株基孔肯雅病毒和日本脑炎病毒、西尼罗病毒、黄热病毒、盖塔病毒、辛德毕斯病毒各1株进行检测,方法的特异性均为100%。方法应用于189份发热病人血清标本检测,可准确地鉴定出其中登革病毒或基孔肯雅病毒核酸阳性的标本,且所有血清标本均能被内参引物和探针有效地扩增和杂交。结论本研究建立了一种高灵敏性、高特异性且含人类基因内参检测的登革病毒和基孔肯雅病毒多重实时荧光RT-PCR检测方法,可作为登革热或基孔肯雅热病人早期快速鉴别诊断的有效工具,也可用于蚊媒携带登革病毒或基孔肯雅病毒的高通量快速筛查。

肉制品中牛源性成分多重实时荧光PCR检测方法的建立及初步应用

目的建立肉制品中牛源性成分的荧光PCR检测方法。方法根据牛特异性线粒体DNA片段,设计合成两对引物,以生、熟牛肉及超市牛肉加工品为材料,建立肉制品中牛源性成分的多重实时荧光PCR检测方法,并用该法与国标法同时对市售的25份肉制品同时进行检测,通过对其他种类的肉源DNA进行扩增验证方法的特异性;对含有不同比例牛肉成分的DNA样本进行检测确定检出限。结果该方法可成功检测出肉制品中的牛源性成分。在25份肉制品检测中,与国标法检测结果一致。该法的特异性为100%,灵敏度检测线为1%。结论本研究成功建立牛源性肉制品的检测方法,该方法快速简便,且具有较高的特异性和灵敏度,可用于市售肉制品中牛源性成分的鉴定。

化妆品中动物源性成分多重实时荧光PCR检测方法的研究

使用优化的Chelex-100结合玻璃奶法提取膏状、液态和固态化妆品中的动物源性DNA;根据驴、马和牛线粒体16S rRNA基因序列设计通用引物和特异性探针,建立了一次性检测化妆品中驴、马和牛3种动物源性成分的多重实时荧光PCR体系,检出限均为0.001 ng。并对市售的面霜、洗面奶和面膜进行盲样检测,验证了体系的可靠性和准确性。

一种从羊奶中检测牛奶和大豆成分多重实时荧光定量PCR方法的建立

羊奶制品因其良好的营养功效备受消费者的青睐,也是乳制品主要掺假对象。本研究参考市场可能掺假现状,分别根据羊和牛线粒体基因组16S rRNA基因序列和大豆的KTi-S基因(GI:510514)序列,设计一对牛和羊特异性引物、一对大豆特异性引物以及相应的Taq Man-MGB探针,建立羊奶中牛奶和大豆成分多重实时荧光定量PCR检测方法,并引入内标质控有效保证检测体系的准确性。本检测体系对羊奶、牛奶及豆浆的基因组DNA检测敏感度为0.01 ng;对羊奶中掺入牛奶和豆浆的体积掺假检测灵敏度均为0.1%。因此,本研究建立的羊奶中牛奶和大豆成分多重实时荧光定量PCR检测体系具有通量大、灵敏度高、特异性好等优点,实现了对羊奶中其他源性成分快速、准确的检测,对保障相关产品市场安全具有重要意义。

改良多重实时荧光定量PCR检测流感A型和B型病毒

目的：建立改良多重实时荧光定量PCR体系快速检测流感A型和B型病毒。方法根据生物信息学分析结果选定流感A型和B型病毒的靶序列，建立MRT－PCR检测体系。构建质粒标准品，评估所建立体系的灵敏度、特异性和重复性。结果成功建立了基于同源加尾系统和Taqman－分子灯标探针的改良多重实时荧光定量PCR检测体系；该方法最低检测限为102 copies／μl，特异性良好，重复性良好，变异系数（CV）为0．99％～2．50％。结论建立了快速、敏感、特异、稳定地改良多重实时荧光定量PCR（ MRT－PCR）检测体系，具有良好的临床应用前景。

多重实时荧光PCR鉴别金钱白花蛇源性方法研究

目的用多重实时荧光聚合酶链式反应(多重实时荧光PCR)快速鉴别金钱白花蛇源性。方法以线粒体细胞色素C基因为目标靶基因,根据其特异性核酸序列设计引物和探针,通过优化引物及探针浓度、退火温度等PCR体系和条件,建立从活体材料和粉末制剂等中药材中检测金钱白花蛇源性的二重二色实时荧光PCR检测体系。结果通过检测市售15块金钱白花蛇药材,发现其中5块不含金钱白花蛇源性成分;10份金钱白花蛇粉末制剂中3份未检出金钱白花蛇成分;5份活体样本均为金钱白花蛇。检测结果与DNA测序结果一致。结论本研究建立的方法可用于金钱白花蛇源性的检测,能有效保障金钱白花蛇相关名贵中药及制品的安全性。

辣椒中常见产毒性真菌的裸磁珠-多重实时荧光定量PCR检测方法

目的将多重实时荧光定量PCR技术与裸磁珠富集技术联用,建立辣椒样品中常见3类（曲霉属、青霉属、镰刀菌属）产毒性真菌的快速定量检测方法。方法根据真菌核糖体RNA（r DNA）基因序列选择真菌广谱引物及属特异性探针,联用裸磁珠富集技术,建立多重实时荧光定量PCR体系,并评价所建方法的灵敏度、特异性、重复性和一致性。结果裸磁珠-多重实时荧光定量PCR方法灵敏度高,与本研究优化后的普通实时荧光定量PCR相比提高了10倍,是原报道的100倍,直接检测辣椒样品中3类产毒性真菌的检出限均可达103CFU/ml,即104CFU/g,且特异性良好（与非目标菌无交叉反应）、重复性良好（CV〈1.5%）,该方法模拟检测辣椒样品中3类产毒性真菌的计数结果与标准培养法的计数结果相比均无统计学差异（P〉0.05）,实验过程仅需7 h（标准培养鉴定法耗时7~14 d）。结论构建的裸磁珠-多重实时荧光定量PCR方法能大大缩短产毒性真菌的检测时间,并成功应用于模拟辣椒样品中常见3类产毒性真菌的定量检测,值得进一步研究和推广。

改良多重实时荧光定量PCR法测定抑癌基因MGMT、p16、CDH13和RASSF1A甲基化在肺癌早期诊断中的作用

目的:建立改良多重实时荧光定量PCR法,检测抑癌基因MGMR、p16、CDH13和RASSF1A基因甲基化,探讨其在肺癌早期诊断中的应用。方法:选取30例病理确诊为肺癌的患者作为肺癌组,30例病理确诊为良性病变的患者作为对照组。建立改良实时荧光定量PCR体系。检测受试者血清MGMT、p16、CDH13和RASSF1A基因甲基化,对比两组基因甲基化阳性率,计算四项基因甲基化单独及联合用于肺癌早期诊断的敏感度和特异度。结果:肺癌组受试者血清MGMT、p16、CDH13和RASSF1A显著高于对照组(P<0.05);MGMT、p16、CDH13和RASSF1A四项基因甲基化联合检测用于肺癌早期诊断的敏感度和特异度显著高于单项指标检测(P<0.05)。结论:建立了多重实时荧光定量PCR法用于MGMT、p16、CDH13和RASSF1A基因甲基化检测,联合检测用于肺癌早期诊断具有较高的敏感度和特异度。

多重实时荧光定量PCR对9种常见呼吸道病原体检测

目的探讨多重实时荧光定量PCR(MRT-PCR)检测9种常见呼吸道病原体的临床应用价值。方法采用Primer Express3.0(ABI)和Primer3 Input 4.0设计引物和探针建立MRT-PCR法,通过构建质粒标准品分析该方法的最低检出限和特异性。并对204例临床标本中副流感病毒1、2、3型、肺炎支原体、肺炎衣原体、呼吸道合胞病毒、腺病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒进行回顾性检测。结果 MRT-PCR法检测病原体的最低检出限达103copies/m L,特异性达100%,无交叉反应。204例咽拭子标本中,MRT-PCR检出呼吸道合胞病毒23例,副流感病毒1、2、3型13例,腺病毒15例,肺炎支原体15例,肺炎衣原体3例,甲型流感病毒13例与乙型流感病毒6例。该结果与其他试剂报告结果完全一致。结论多重实时荧光定量PCR具有快速、准确、特异性强等特点,在呼吸道病原体检测方面有重要价值。

长沙市食品从业人员致泻大肠埃希菌实时荧光多重PCR检测结果分析

目的了解长沙市食品从业人员致泻大肠埃希菌感染、分布及毒力基因携带情况。方法抽取长沙市9个单位258例食品从业人员为研究对象,采用实时荧光多重聚合酶链反应(PCR)检测致泻大肠埃希菌。结果致泻大肠埃希菌感染率为15.5%(40/258),其中肠聚集性大肠埃希菌(EAEC)占10.9%(28/258),肠致病性大肠埃希菌(EPEC)占3.1%(8/258),肠出血性大肠埃希菌(EHEC)占1.6%(4/258),未检出肠侵袭性大肠埃希菌(EIEC)和肠产毒性大肠埃希菌(ETEC)。28株EAEC携带uidA基因26株,aggR+pic基因13株,astA基因27株,携带率分别为92.9%、46.4%、96.4%;8株EPEC全部携带eae和uidA基因;4株EHEC中3株携带eae基因,且都携带stx1+stx2基因。结论建立持续监测致泻大肠埃希菌的机制和深入研究其分子流行病学理论,除了为监管部门制订和评价公共卫生措施提供基础数据,对评价食品安全状况,有效控制传染源、保护人民群众健康具有重要意义。

多重实时荧光定量PCR鉴别欧洲型、美洲型和高致病性PRRSV检测方法的建立

根据欧洲型N基因、美洲型M基因和高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)nsp2基因的各自保守序列设计特异性的引物和不同荧光标记的TaqMan荧光探针,通过优化反应体系和扩增条件,建立了能够检测欧洲型、美洲型和高致病性PRRSV的多重实时荧光定量PCR方法。该方法的重复试验表明其批内和批间的变异系数最高值分别为1.84%和1.76%;灵敏性试验表明其检测下限为10copies/μL;特异性试验表明与其他一些猪源病毒无交叉反应,具有良好的特异性;临床试验表明,该方法能够快速准确地检测出临床组织样本中美洲型及高致病性PRRSV的核酸;此外,本研究用欧洲型PRRSV质粒进一步验证了该方法可以检测出欧洲型PRRSV的目的基因。该方法的建立为不同类型的PRRSV快速检测提供了有效手段,可用于猪繁殖与呼吸综合征疫情的监测及防控。

多重实时荧光PCR快速检测转基因大豆及其加工产品

本研究运用多重实时荧光聚合酶链式反应技术(polymerase chain reaction,PCR)对转基因大豆及其深加工制品进行筛选检测。通过设计大豆内源基因植物凝集素(Lectin)和常用的外源基因花椰菜花叶病毒35S启动子(CaMV35S)、根癌农杆菌胭脂碱合成酶基因终止(nos)的特异性引物和探针,反应条件和反应体系的优化,特异性、重复性和灵敏性的实验比对分析等开发建立了多重荧光定量PCR检测技术。以10%Roundup Ready转基因大豆标准品为材料,建立并优化转基因大豆的定量检测体系,对大豆中的转基因成分进行定量分析。结果表明:该方法重复性好,检测特异性强,扩增效率在90%～110%,标准曲线相关系数R2≥0. 98,确定了最低检测限为每20μL反应2. 4个拷贝。结论:由于使用多重实时荧光PCR技术,可实现一管多检的实际需要,降低试剂成本,缩短检测时间,为大豆及其深加工产品转基因成分的快速检测提供了有效方法,为促进农产品和食品进出口提供技术保障。

金黄色葡萄球菌及毒素多重实时荧光PCR检测技术及其试剂盒性能测试

[目的]本文基于自筛的金黄色葡萄球菌特异性靶基因ASL18_04625(sa19)以及2种重要的毒素基因(A型和U型肠毒素,sea344和seu222),建立一种同时检测金黄色葡萄球菌及其肠毒素的多重实时荧光PCR检测方法。[方法]通过优化引物浓度等因素,确定最适多重实时荧光PCR反应体系,并将此检测体系组装成试剂盒,对人工污染样品和实际样品进行检测。[结果]选用1.5×Syto9 Green作为荧光染料,优化后的反应体系为0.015 U·μL^(-1)Taq酶,0.10 mmol·L^(-1)dNTP,终浓度分别为0.05、0.10和0.20μmol·L^(-1)的3对引物。sa19的基因组灵敏度为40.7 pg·μL^(-1),sea344、seu222的基因组灵敏度均为4.07 pg·μL^(-1);sa19的菌液浓度灵敏度为1.19×10^(3)CFU·mL^(-1),sea344、seu222的菌液浓度灵敏度均为1.19×10^(4)CFU·mL^(-1)。构建的试剂盒组内和组间重复率均为100%。在经历60次反复冻融、72 h泡沫箱储藏、-20℃储藏90 d、4℃储藏45 d后,试剂盒检测结果仍没有显著变化,同时具有良好的特异性与抗干扰能力。[结论]本研究针对食源性金黄色葡萄球菌建立的多重实时荧光PCR法,具有快速、特异性强、灵敏度高的优点,并组建成适用于实际检测应用的商品化试剂盒,在食品安全检测方面具有广阔的应用前景。

多重实时荧光串联PCR技术高通量检测生蚝中9种致病菌

大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌、铜绿假单胞菌、产气荚膜梭菌、单增李斯特菌和创伤弧菌是贝类食品中常见的食源性致病菌。该文通过设计特异性引物,优化反应参数以建立多重实时荧光串联PCR(multiplexed tandem PCR,MT-PCR)方法,进一步评估方法的特异性和灵敏度,并用于检测生蚝样品。优化后的MT-PCR方法与常规qPCR具有相同定量能力,可同时检测上述9种致病菌。在对混合菌液的检测中,MT-PCR方法的检测灵敏度最低可达10~2 CFU/mL,且此法对其中6种致病菌的检测灵敏度高于qPCR。应用该技术检测人工染菌的生蚝样品,检测灵敏度为10~2~10~3CFU/g。该研究建立的MT-PCR方法可实现高通量、快速准确地检测生蚝中这9种常见的食源性致病菌,对保障食品安全和评估食源性致病菌污染风险具有重要意义。