石蜡切片多重免疫荧光染色优化条件探讨

【目的】探讨在石蜡切片上不同染色条件对多重荧光标记结果的影响。【方法】根据不同组织抗原选择合适的固定剂;对石蜡组织切片采用高温高压的抗原修复方式,使用柠檬酸盐缓冲液或EDTA抗原修复液进行抗原修复,并在染色操作过程中增加封闭步骤,随后进行常规组织免疫荧光染色。【结果】常规石蜡切片用40g/L多聚甲醛固定、抗原糖基含量高的石蜡切片用过碘酸盐-赖氨酸-多聚甲醛固定可以很好的保护切片中的抗原;pH 6.0的枸橼酸缓冲液及pH 8.0的EDTA-Na缓冲液分别对组织胞浆抗原及胞核抗原具有较好的抗原修复作用;多重荧光染色不同种属来源第一抗体染色间增加一次封闭步骤,可有效的改善多重荧光染色质量。【结论】选择合适的固定剂、抗原修复液及增加抗原封闭次数对石蜡组织切片上的多重荧光标记结果具有显著的影响。

多重定量荧光PCR快速检测染色体非整倍体疾病

目的探讨多重定量荧光PCR快速检测染色体非整倍体标本疾病的价值。方法利用21,18,13号及X染色体上15个STR(短串联重复序列)位点进行多重PCR扩增,在24h内快速检测染色体非整倍体标本。通过建立两个多重PCR体系,对921例临床标本(包括外周血、绒毛膜及羊水标本)进行检测。结果 921例标本中915例结果与染色体核型结果相符,其中2例45,X外周血标本,2例21-三体综合征标本、1例46,XX标本未检出,1例羊水标本分析失败,与传统染色体核型分析方法相比,其灵敏度及特异度分别为97.64%、99.85%。结论多重定量荧光PCR技术可用于快速诊断非整倍体疾病。

循环免疫荧光法助力组织学多靶标共染

免疫组化染色是一种研究组织形态和原位蛋白表达的重要技术,对肿瘤的诊断、鉴别诊断、指导治疗、判断预后等方面具有重要作用[1]。组织切片可以为细胞和组织生物学提供丰富的信息。在同一张切片上,传统免疫组化染色通常只能对1~2种抗原进行染色分析,随着精准医学的发展和蛋白质组学更加深入的研究,如不同蛋白间的相互作用,共表达和共定位,表达量与空间和距离关系,肿瘤异质性分析,细胞表型统计,肿瘤微环境呈现等均需在一张组织切片上同时检测多个靶标分子[2-5]。

免疫组化双染法分析非桥本背景甲状腺乳头状癌免疫细胞浸润特征与临床病理特征的相关性

目的通过免疫组化双染法在甲状腺乳头状癌(papillary thyroid carcinoma,PTC)组织中的应用,建立人工判读标准并探索该标准应用的可行性;分析非桥本背景PTC组织中T、B淋巴细胞(简称T细胞、B细胞)的浸润特征与临床病理特征的相关性。方法A组选择16例PTC组织进行免疫组化双染和多重免疫荧光染色,分别进行人工判读和机器软件判读;通过Kappa值对比分析人工判读和机器判读结果的一致性。B组选择27例非桥本背景PTC组织进行免疫组化双染,采用人工判读肿瘤组织中T、B细胞表达水平。Kaplan-Meier曲线和Log-rank检验进行无瘤生存期(disease free survival,DFS)分析。结果免疫组化双染人工判读与多重免疫荧光染色机器判读结果达到中等一致性(T细胞Kappa=0.508,B细胞Kappa=0.538),与免疫组化双染机器判读结果达到高度及中等一致性(T细胞Kappa=0.754,B细胞Kappa=0.418)。T细胞表达与各项临床病理特征均无相关性(P>0.05)。B细胞表达仅与淋巴结转移癌被膜侵犯、N分期有相关性(P<0.05)。生存分析显示,B细胞表达与患者DFS无相关性(P>0.05)。结论免疫组化双染人工判读标准用于肿瘤免疫细胞浸润的研究具有一定可行性。非桥本背景PTC中B细胞表达高低与淋巴结转移及N分期有关。

强化造粒条件下颗粒污泥中EPS不同组分的空间分布特征

采用多重荧光染色方法分析强化造粒条件下（不同时间段投加PAC）好氧颗粒污泥形成过程中胞外聚合物（extracellular polymeric substances,EPS）各组分的空间分布特征。研究发现：强化造粒条件下污泥完全颗粒化进程与对照组相比,所需时间明显缩短,粒径更大,含水率、比重、强度更优,且颗粒结构更规则紧密。EPS不同组分空间分布分析表明：α-呋喃葡萄糖、α-甘露糖主要分布在颗粒外侧,蛋白质在整个颗粒污泥断面均有分布,PAC投加对它们的分布影响较小,但对β-D-呋喃葡萄糖、脂类以及死细胞和活细胞在颗粒污泥中的分布有明显的影响;其中在1-7 d投加PAC,死细胞和β-D-呋喃葡萄糖主要集中在颗粒污泥外侧,活细胞和脂类主要分布在颗粒污泥内部,而8-14 d投加PAC,上述情况刚好相反;对照组（不投加PAC）颗粒污泥EPS各组分的空间分布与推迟PAC投加时间后的情况基本相似。

ANAMMOX的快速启动及EPS在ANAMMOX颗粒污泥中的空间分布

为探讨厌氧氨氧化反应的快速启动过程及胞外聚合物(extracellular polymeric substances,EPS)在厌氧氨氧化颗粒污泥中的空间分布,采用厌氧序批式反应器(anaerobic sequencing batch reactor,ASBR)接种活性污泥成功启动厌氧氨氧化反应.结果表明稳定运行时,NH_4^+-N、NO_2^--N去除率均达到99%以上,TN去除率为89.87%±0.43%,总氮(TN)去除负荷达到1.7kg·(m^3·d)^(-1).NH_4^+-N与NO_2^--N的消耗量和NO_3^--N生成量之间的比例关系为1∶(1.32±0.08)∶(0.24±0.03).反应器运行中,出水pH和NO_3^--N浓度可作为反应性能的指标,快速判断反应器运行情况.蛋白质为厌氧氨氧化颗粒污泥EPS的主要组分,蛋白质(PN)和多糖(PS)的含量分别为(59.61±5.64)mg·g^(-1)、(12.21±2.04)mg·g^(-1),PN/PS为4.88±1.39.β-D-呋喃葡萄糖和死细胞集中分布在颗粒污泥最外层;活细胞、蛋白质、脂类、α-呋喃葡萄糖和α-甘露糖遍布整个颗粒污泥,但主要集中在外侧.蛋白质和脂类构成了厌氧氨氧化颗粒污泥的骨架,厌氧氨氧化菌分布在蛋白质和脂类中间.

大鼠挫伤骨骼肌中M1/M2型巨噬细胞时间相关性研究

目的研究大鼠骨骼肌挫伤后M1/M2型巨噬细胞浸润的动态变化规律结合组织学改变建立损伤时间推断方法。方法建立大鼠骨骼肌挫伤模型,挫伤后6h、12h、24h、36h、48h、60h、72h、96h、144h、216h、336h为实验组,对照组不进行任何处理。采用HE染色法和免疫荧光多重染色方法观察骨骼肌挫伤后修复规律,运用全景组织细胞定量分析系统检测损伤区内单位面积细胞核数量、M1及M2型巨噬细胞数量和比例变化规律并建立与损伤时间的关系。结果在0.5mm×0.5mm范围内,M1型巨噬细胞比例在0.05±0.02~0.18±0.12且M2型巨噬细胞比例在0.02±0.01~0.04±0.02范围内时,推断该组织的损伤时间为伤后6h~48h;M1型巨噬细胞比例0.22±0.02且M2型巨噬细胞比例在0.09±0.02范围内时,推断该组织的损伤时间为损伤后60h;M1型巨噬细胞比例0.1±0.02且M2型巨噬细胞比例在0.16±0.07范围内时,推断该组织的损伤时间为损伤后144h;M1型巨噬细胞比例0.05±0.01~0.09±0.02且M2型巨噬细胞比例在0.07±0.02~0.09±0.01范围内时,推断该组织的损伤时间为损伤后216h~336h。结论大鼠挫伤骨骼肌中M1/M2型巨噬细胞时间相关性表达规律可作为损伤时间推断的新依据,结合病理组织学改变可进一步提高损伤时间推断的准确性。