乙型肝炎病毒阿德福韦酯耐药多重荧光聚合酶链反应检测方法的建立及临床应用

目的：建立快速、多重的突变荧光聚合酶链反应（PCR）检测技术，对阿德福韦酯（ADV）耐药位点（rtA181V/T、rtN236T）进行定性检测，为临床诊断和个性化治疗提供参考。方法通过基因测序筛选突变阳性样本，进而构建ADV rt181和rt236位点野生株和突变株重组质粒，并以上述质粒为标准品，针对每个位点建立多重荧光PCR方法，并对该方法的特异性、重复性、灵敏性和稳定性进行了分析与评价。进而利用此项技术对130例乙型肝炎病毒（HBV）阳性样本（其中ADV疑似耐药样本15例）进行了耐药突变检测。结果本实验所建立的多重荧光定量方法对HBV突变ADV耐药的检测下限均达到1×10^2 copies/mL，野生株和突变株混合试验均表现出高特异性，精密度范围在0.24%~0.32%，37℃加速破坏并不会影响试剂性能。130例样本中，rtA181V位点突变6例，rtA181T位点突变4例，rtN236T位点突变3例，rtA181V与rtN236T位点混合突变1例，突变率分别为4.6%、3.1%、2.3%及0.77%，该结果与测序结果完全一致。结论本实验建立的多重荧光PCR方法灵敏度高、特异性好，可以有效区分单个碱基的突变，并且可以同步区分野生株、突变株及野生株/突变株混合型，特别适合于对野生株和突变株的混合感染的检测，能检测出混合样本中1%浓度的突变样本，适合于临床快速对HBV样本进行耐药性判断，能更好更快更准地对临床ADV患者提供用药指导建议。

荧光定量聚合酶链式反应联合显色培养法在孕晚期孕妇B群链球菌筛查中的价值

目的 分析荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)联合显色培养法在孕晚期孕妇B群链球菌筛查中的价值,为临床提供参考。方法 选取2022年10月至2024年3月阳光融和医院孕35~37周行B群链球菌筛查的1 000例孕妇进行回顾性分析,分别采用B群链球菌显色培养法、qRT-PCR法对孕妇肛拭子或阴拭子B群链球菌进行检测。以肉汤增菌培养法为金标准,比较B群链球菌显色培养法、qRT-PCR法检测B群链球菌的一致性;评估B群链球菌显色培养法、qRT-PCR法对B群链球菌的检测效能;以B群链球菌显色培养法、qRT-PCR法任一检测方法阳性作为联合检测阳性,评估联合检测与肉汤增菌培养法对B群链球菌的检测一致性及检测效能。结果 1 000例标本经金标准检出阳性94例,阴性906例,阳性检出率为9.40%。B群链球菌显色培养法检出阳性89例,阴性911例,阳性检出率为8.90%,与金标准检测一致性中等(Kappa值=0.681,P<0.05);qRT-PCR法检出阳性98例,阴性902例,阳性检出率为9.80%,与金标准一致性较好(Kappa值=0.839,P<0.05);联合检测阳性148例,阴性为852例,阳性检出率为14.80%,与金标准检测一致性较好(Kappa值=0.881,P<0.05)。与B群链球菌显色培养法相比,qRT-PCR法检测灵敏度、准确率均较高,漏诊率较低,联合检测灵敏度较高,特异度、漏诊率均较低(均P<0.05);与qRT-PCR法相比,联合检测灵敏度较高,特异度、漏诊率均较低(均P<0.05),准确率比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论 B群链球菌显色培养法、qRT-PCR法联合检测可提高检测敏感度,提升B群链球菌阳性检出能力,可为临床诊断提供参考。

多重聚合酶链式反应-毛细管电泳技术检测5种食源性致病菌

目的利用多重聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)-毛细管电泳技术,构建一种快速检测沙门氏菌、大肠埃希氏菌O157:H7、单核细胞增生李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌和副溶血性弧菌的方法。方法针对5种食源性致病菌,选择保守性较好的致病基因设计特异性多重PCR引物,利用毛细管电泳成像分析多重PCR产物。通过对PCR及电泳条件进行优化,建立5种食源性致病菌的多重PCR-毛细管电泳检测方法,并对其特异性、灵敏度进行研究。结果5对引物特异性良好,均未出现非特异性扩增,多重PCR最佳引物浓度为0.2μmol/L,最佳退火温度为56.0℃,毛细管电泳最佳分离模式为AM900,灵敏度较高,检测灵敏度可达到5×10^(-3) ng/μL。结论本研究建立的多重PCR-毛细管电泳方法用于检测5种食源性致病菌,操作简便、特异性和灵敏度高,在食源性致病菌检验中具有较好的实用价值。

实时荧光聚合酶链式反应法快速鉴定阪崎克罗诺杆菌

目的根据DNA旋转酶B亚基(gyrB)基因设计特异性的引物探针,建立一种能够快速准确鉴定阪崎克罗诺杆菌的实时荧光定量聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)方法。方法寻找并在美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)中下载目标基因序列,使用DNAMAN进行序列比对,Primer Express软件设计引物探针。通过特异性实验、绝对灵敏度、相对灵敏性实验、抗干扰实验对所建立方法进行方法验证。选择本实验室保存的36种40株食品中常见致病菌的标准菌株进行特异性验证。结果多维度特异性验证实验结果显示该方法能够特异性地检测出阪崎克罗诺杆菌,对亲缘关系较近的其他克罗诺杆菌及食品中较为常见的致病菌均无非特异性扩增。DNA检测灵敏度可以达到0.0100 ng/μL,相对灵敏度可以达到10^(3) CFU/mL。抗干扰实验结果显示,将干扰菌和干扰菌DNA分别与阪崎克罗诺杆菌和阪崎克罗诺杆菌DNA进行混合检测,对检测结果无显著影响,说明该方法抗干扰能力良好。结论本研究所设计的引物探针在实时荧光PCR方法下对食品样品中阪崎克罗诺杆菌的检测具有特异、快速、敏感和抗干扰的特点,可为以后食品中阪崎克罗诺杆菌的检测提供技术支撑。

荧光聚合酶链式反应探针熔解曲线技术检测痰标本中结核分枝杆菌异烟肼耐药性的价值分析

目的:分析荧光聚合酶链式反应探针熔解曲线(MeltPro)技术在检测痰标本中结核分枝杆菌异烟肼耐药性的应用价值。方法:选取2022年6月—2024年6月句容市疾病预防控制中心收治的肺结核患者347例作为研究对象,采集患者痰标本,进行菌种分离培养,采用液体药敏试验、MeltPro技术检测结核分枝杆菌异烟肼耐药性,以液体药敏试验结果为“金标准”,分析MeltPro技术检测异烟肼耐药性的效能。结果:MeltPro技术检测结核分枝杆菌异烟肼耐药性的敏感度为87.50%,特异度为95.87%,准确度为95.68%。MeltPro技术检测与液体药敏试验检测结果的一致性尚可(Kappa=0.728)。结论:MeltPro技术检测痰标本中结核分枝杆菌异烟肼耐药性的效能较高,有利于临床医生快速且准确地筛查患者耐药情况。

多重荧光定量聚合酶链反应法检测肉制品中的3种食源性致病菌

目的建立多重荧光定量聚合酶链反应法(quantitative polymerase chain reaction,qPCR)快速检测肉制品中沙门氏菌、单增李斯特菌、大肠杆菌O157:H73种食源性致病菌的方法。方法根据沙门氏菌的invA基因、单增李斯特菌的hemolysin基因、大肠杆菌O157:H7的rfbE基因序列分别设计特异性引物及探针,通过优化反应体系,测定其灵敏度、特异性和重复性,建立了可同时检测上述3种食源性致病菌多重qPCR方法。结果该方法只扩增3种靶细菌,对其他供试菌不扩增;沙门氏菌、单增李斯特菌、大肠杆菌O157:H7的检出限分别为10^(1)、10^(2)、10^(2)拷贝数/μL,并且拥有良好的重复性和特异性。人工污染的猪肉样品经SLE培养基富集8 h后,分别可以检测到初始菌液浓度为1.56×10^(2)CFU/25 g的沙门氏菌,2.13×10^(2)CFU/25 g的单增李斯特菌,2.32×10^(2)CFU/25 g的大肠杆菌O157:H7。结论所建立的多重qPCR灵敏度高、特异性强、重复性好,可同时检测肉制品中沙门氏菌、单增李斯特菌和大肠杆菌O157:H73种食源性致病菌,在提高食品安全和保护人类健康方面有重要意义。

多重实时荧光定量聚合酶链式反应在芝麻酱掺假鉴别中的应用

目的研究基于分子生物学技术,建立多重实时荧光定量聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)技术检测芝麻酱中的植物源性成分,实现芝麻酱的快速掺假鉴别,突破单标准单物种检测的局限性。方法该研究以芝麻2S albumim mRNA基因、花生Ara b2基因、大豆Lectin基因、玉米adh1基因设计特异性引物和探针,优化反应体系,建立多重实时荧光定量PCR技术检测芝麻酱中的芝麻源性成分、花生源性成分、大豆源性成分、玉米源性成分,并应用于市售的芝麻酱样本检测分析。结果该方法高效低成本,特异性好,对小米、绿豆等10种非目标源性成分无特异性扩增;对芝麻源性成分、花生源性成分、大豆源性成分、玉米源性成分的最低检出限为100 pg/μL,具有较高的灵敏度;应用建立的方法,对市售21份芝麻酱样本进行检测分析,检测结果与标签标注不符合的有4份,标签标注符合率为80.95%,与参比方法检测结果一致。结论建立的多重实时荧光定量PCR技术对加工成品的检测具有较好的适用性,为芝麻酱的掺假鉴别提供了一种新的分子生物学方法。

基于引物快速固化技术的实时荧光聚合酶链式反应检测方法

目的开发一种快速、低成本的引物干燥与固定新技术,以实现载脂蛋白E基因亚型的实时荧光聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)检测方法。方法研究不同粘附着色剂性能、实现引物快速干燥固化,建立一种固化引物模式的实时荧光PCR方法对6种载脂蛋白E基因亚型进行检测,并对新方法的常温储存性能、检测特异性、灵敏度和准确度及与基因测序法的结果一致性实施试验评价。结果固化引物技术仅需高温干燥,固化后的引物可常温储运,稳定性高,不影响PCR扩增。建立的固化引物模式的实时荧光PCR方法检测载脂蛋白E基因准确性高、特异度好,灵敏度为0.63 ng/μL,与传统的液体PCR试剂灵敏度一致。临床样本验证结果表明,本方法与基因测序的符合率为100%。结论本文建立的固化引物实时荧光PCR法可提高多突变位点基因检测操作的便捷性与检测通量选择的灵活性。

TaqMan探针双重荧光聚合酶链式反应技术检测食源性沙门氏菌和志贺氏菌

目的建立TaqMan探针双重荧光聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)技术检测食源性沙门氏菌和志贺氏菌的方法。方法通过比对沙门氏菌和志贺氏菌的基因组序列,选择同源性高、保守性好的区域设计特异性引物和探针,经过引探筛选、浓度调试等一系列优化,建立了食源性沙门氏菌和志贺氏菌双重荧光PCR核酸检测方法,并对其特异性、质粒最低检出限、菌液敏感性、重复性、稳定性以及实际样品进行了验证。结果该方法与大部分食源性致病菌无交叉反应,特异性强;沙门氏菌和志贺氏菌质粒的最低检出限可达5 copies/μL,沙门氏菌菌液敏感性为1.0×10^(2) cfu/mL,志贺氏菌菌液敏感性10 cfu/mL;质粒和菌液核酸梯度的批内和批间变异系数均在0.177%~1.958%之间,小于5.0%,具有较强的稳定性;标准曲线相关系数(r^(2))均大于0.999。结论本研究成功建立了一种TaqMan探针双重荧光PCR技术同时检测食源性沙门氏菌和志贺氏菌的方法,该方法扩增时间短,只需要30 min即可,而且特异性强、稳定性好,可用于疑似沙门氏菌和志贺氏菌污染样品的检测,为食品安全的快速检测提供技术支撑。

SYBR GreenⅠ染料-实时荧光定量聚合酶链式反应法检测发酵乳中的霉菌和酵母含量

目的建立一种应用SYBR GreenⅠ染料的实时荧光定量聚合酶链式反应法快速检测发酵乳中的霉菌和酵母菌。方法本研究针对霉菌与酵母菌的保守序列设计引物,确定最优反应体系与反应条件。通过熔解曲线以及非目标菌株的检测验证该方法的特异性;通过菌悬液的梯度稀释检测确定该方法的灵敏度;通过菌悬液与发酵乳样品混合后进行检测,确定该方法的检出限,并得到标准曲线。结果该方法能够特异性的检测发酵乳中的霉菌、酵母菌,无交叉反应。该方法检测霉菌、酵母菌的灵敏度均为10^(2) CFU/mL,并且当菌悬液与发酵乳样品混合后,并没有降低该方法的检出限。在10^(2)~10^(6) CFU/mL浓度范围内,菌液浓度的对数值与循环阈值(cyclethreshold,Ct)具有良好的线性关系,可以在市售样品的检测中通过Ct值计算样品中目标菌的含量,更快的判断发酵乳是否被霉菌、酵母菌污染。结论该方法可用于发酵乳中霉菌和酵母菌的快速检测,为发酵乳的食品安全提供了技术保障。

实时荧光定量聚合酶链式反应快速检测4种食源性致病弧菌

目的建立和优化4种食源性致病弧菌的实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,qPCR)快速检测方法。方法基于副溶血性弧菌的toxR基因(GenBank ID:MH047287.1)、霍乱弧菌的ompW基因(GenBank ID:MF100046.1)、拟态弧菌的toxR基因(GenBank ID:EF693743)和创伤弧菌的vvhA基因(GenBank ID:KC821520.1)设计常规PCR引物和qPCR特异性引物和探针。分别建立副溶血性弧菌、霍乱弧菌、拟态弧菌和创伤弧菌4种食源性致病弧菌的单重qPCR检测体系,根据扩增曲线和Ct值对探针浓度进行优化,设置探针浓度梯度。结果4种弧菌的探针最适浓度均为0.1µmol/L。对设计的4种弧菌的引物分别进行常规PCR的扩增,其最低检出限均为1×10^(5) copies/µL,4种弧菌分别进行单重qPCR的最低检出限均为1×10^(1) copies/µL,扩增效率均接近100%。qPCR的灵敏度均高于常规PCR。特异性实验结果表明,4种目的弧菌DNA扩增出特异性曲线,其他的非目的基因未被扩增出扩增曲线。结论该方法准确度和灵敏度高,前处理简单快速,适用于4种食源性致病弧菌的荧光定量PCR快速检测。

一种基于多重实时荧光聚合酶链式反应熔解曲线分析的肉及肉制品掺假鉴别方法

为实现肉及肉制品掺假快速鉴别,分别以猪、牛线粒体DNA的COXⅠ,绵羊、山羊、狗、狐狸、貉线粒体DNA的16S rRNA及鸡、鸭线粒体DNA的12S rRNA基因为靶位点,设计扩增产物熔解温度(T_m值)具有显著性差异的特异性引物,建立一种用于快速鉴别肉或肉制品中猪、牛、绵羊、山羊、鸡、鸭、狗、狐、貉9种源性成分的5重实时荧光聚合酶链式反应熔解曲线分析方法,通过特异性、灵敏度及市售样品的检测,对该方法进行检验和评价。结果表明:方法具有良好的特异性及灵敏度,单物种DNA检出限为0.001~1 ng,多物种混合DNA检出限均为0.1 ng,通过市售样品检测表明该方法可用于实际样品(包括生鲜样品和熟制样品)掺假的快速鉴别。

多重聚合酶链反应-毛细管电泳-激光诱导荧光法检测三种食源性致病菌

建立了食品中常见致病菌大肠杆菌O157：H7的uidA基因、沙门菌的invA基因和志贺菌的ipaH基因的多重聚合酶链反应（PCR）产物的毛细管电泳快速检测方法。根据这3种致病菌的特异性基因序列设计多重PCR引物,优化PCR扩增反应体系,采用7.0g/L甲基纤维素为筛分介质,毛细管电泳-激光诱导荧光检测法同时检测了3种常见致病菌的PCR扩增产物。在优化的多重PCR反应和毛细管筛分电泳条件下,该方法可以同时检测沙门菌、志贺菌和大肠杆菌O157：H7基因的多重PCR扩增产物,22min内即可完成3种常见致病菌的毛细管电泳检测。迁移时间的相对标准偏差为1.47%-2.07%。与凝胶电泳法比较,该法简便快速,灵敏度高,可用于多种致病菌脱氧核糖核酸的检测,为食品安全提供了一种可靠的快速检测方法。

实时荧光多重聚合酶链反应-高分辨率溶解曲线分析鉴别6种致腹泻性大肠埃希菌的研究

目的建立一种鉴别6种致腹泻性大肠埃希菌的实时荧光多重聚合酶链反应-高分辨率溶解曲线分析方法。方法根据6种致腹泻大肠埃希菌的8种特异性毒力基因设计8对引物,采用实时荧光多重聚合酶链反应后溶解曲线分析,根据曲线的峰值、高度、宽度、面积不同鉴别不同的致病菌。结果成功设计出8对引物,扩增出针对6种致腹泻大肠埃希菌的8种不同毒力基因,获得了特异性的溶解曲线。优化反应体系后在同一反应管中成功获得针对8种特异基因的溶解曲线,除肠侵袭性大肠杆菌、细胞致死膨胀性大肠杆菌具有相同的两种基因不能鉴别外,其中5种致腹泻性大肠埃希菌均可以明确鉴别。结论多重聚合酶链反应-高分辨率溶解曲线分析鉴别致腹泻性大肠埃希菌是一种简单、特异、高效的方法,在腹泻病与食源性疾病的暴发调查和日常监测中具有广泛的应用价值。

多重实时聚合酶链式反应法快速检测食品中的产志贺毒素大肠埃希氏菌

目的建立多重实时聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)法快速检测食品中的产志贺毒素大肠埃希氏菌(Shiga toxin-producing Escherichiacoli,STEC)的方法。方法以产志贺毒素大肠埃希氏菌携带的毒力基因stx1、stx2和黏附基因eae靶基因引物探针建立多重实时PCR体系,并采用原位冻干技术将PCR反应体系和阳性质控品进行了预先分装冻干,制成稳定、便捷的即用型反应体系,随后对方法的灵敏性、特异性和稳定性进行评价。结果所建立的多重实时PCR法检测eae、stx1、stx2基因的灵敏性为102 CFU/mL。与32种非STEC菌均无交叉反应。整体检测时长可控制在1 h以内,冻干体系可在常温条件下保存1年以上。结论本方法快速、简便,适用于测定食品中的STEC。

叠氮丙啶-实时荧光聚合酶链式反应-高通量测序技术鉴定冷链食品中多种病原菌

目的 应用叠氮丙啶-实时荧光聚合酶链式反应-高通量测序技术鉴定冷链食品中多种病原菌,构建病原菌分子进化树。方法 以冷链食品中的沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽胞杆菌、副溶血性弧菌、单核细胞增生李斯特氏菌5种病原菌作为研究对象,应用叠氮丙啶-实时荧光聚合酶链式反应技术作为冷链食品中病原菌检测初筛手段,应用微生物培养法以及生化鉴定仪器法进行方法比对与结果验证,运用高通量测序以及分子进化树构建作为冷链食品中所分离病原菌的种属地位确证方法。结果 叠氮丙啶-实时荧光聚合酶链式反应技术成功扩增了冷链食品中生活状态病原菌的特征性核酸片段,排除了死亡细菌以及阴性对照菌的干扰,病原菌检出限可达到1×10^(3)CFU/mL,一次反应可检测42份试样,可以在18 h内完成检测工作。在冷链食品中病原菌抽样检测调查中,随机采集的751份冷链食品,共检出62株病原菌,病原菌总体检出率为8.3%(62/751)。通过后续的16S rRNA测序以及葡萄球菌属、弧菌属以及李斯特菌属分子进化树的构建,成功溯源了金黄色葡萄球菌的污染来源并完成病原菌种属定位。结论 本方法特异性好、灵敏度高、检测通量高,为冷链食品及相关食品中病原菌的精确检测与溯源分析提供新的思路与方法。

双重荧光逆转录-聚合酶链式反应与荧光逆转录-重组酶介导等温扩增快速检测食源性GⅠ型、GⅡ型诺如病毒

目的建立双重荧光逆转录-聚合酶链式反应(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)与荧光逆转录-重组酶介导等温扩增(reverse transcription recombinase-aided amplification,RT-RAA)快速有效地检测食品中食源性GⅠ型和GⅡ型诺如病毒的方法。方法根据GⅠ型、GⅡ型诺如病毒基因组保守序列设计引探,经过一系列引探浓度筛选,建立了双重荧光RT-PCR和恒温荧光RT-RAA两种检测方法,分别从敏感性、特异性、稳定性、重复性等方面进行了比较研究;同时将这两种方法应用于实际临床样本检测中,并与GB4789.42—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验诺如病毒检验》进行比对验证。结果建立的两种方法特异性良好,敏感性均可达10 copies/μL;双重荧光RT-PCR方法质粒梯度变异系数(coefficient of variation,CV)值在0.1%~1.5%区间,恒温荧光RT-RAA方法CV值在1.0%~10.0%区间,稳定性和重复性显示双重荧光RT-PCR优于恒温荧光RT-RAA检测方法;31份诺如病毒阳性食品核酸样本均能检出,且50份食品盲样检测结果与国标一致。结论本研究成功建立了双重荧光RT-PCR与恒温荧光RT-RAA快速检测食源性GⅠ型、GⅡ型诺如病毒方法,两种方法各有优缺点,双重荧光RT-PCR稳定性和重复性好,恒温荧光RT-RAA检测时间短,仅20 min就能完成扩增,可根据不同需求选择一种或两种作为食源性GⅠ型、GⅡ型诺如病毒的检测方法。

定量荧光聚合酶链式反应在流产组织染色体畸变分析中的诊断价值

目的评估在以拷贝数变异测序(CNV-seq)为主要遗传学检测手段对流产组织进行染色体畸变分析中辅以定量荧光聚合酶链式反应(QF-PCR)检测的诊断价值。方法采用QF-PCR及CNV-seq技术同时检测2021年9月至2022年11月海口市妇幼保健院收集的110例流产组织样本。此外,QF-PCR技术将额外检测50例健康人群外周血样本进行数据补充。QF-PCR体系为自建体系,在13、18、21、性染色体共选择17个位点并将其分为两组。Panel A组由D13S796、D13S256、D18S386、D18S535、D21S11、D21S1446、DXS6809、HPRT构成;Panel B组由D13S371、D13S634、D18S51、D18S535、D18S819、D21S1409、D21S1412、DYS218、DXS981、AMEL构成。分析QF-PCR在判别13、18、21、性染色体非整倍体时与CNV-seq结论一致性、QF-PCR为CNV-seq进行母源污染鉴定能力,以及QF-PCR进行13、18、21、性染色体非整倍体的分型能力。结果对110例流产组织进行检测,两种方法结论一致例数占比为93.6%。其中QF-PCR避免了5例CNV-seq自身局限性造成的不准确结论,2例为QF-PCR的检测失败。在母源细胞污染鉴定能力上,15个短串联重复序列的观察杂合度、期望杂合度与个体识别能力值范围分别为0.737~0.950、0.593~0.941、0.817~0.975;D13、D18、D21与DX的累积He依次为0.9999、0.9998、0.9998与0.9985,累积个体识别能力大于0.999999999999999999999999999999;自建的QF-PCR方法在分型能力上表现良好,其干扰因素影响较小。结论QF-PCR联合CNV-seq检测可能成为未来孕早期流产组织遗传学分析的主要方法。它不仅能够降低CNV-seq的误诊率、鉴别母体细胞污染。采用自建QF-PCR体系还能够显著降低联合检测成本。

荧光定量聚合酶链反应检测脑脊液中结核分枝杆菌DNA对鉴别诊断结核性脑膜炎的应用价值分析

目的 探究荧光定量聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)检测脑脊液中结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis,MTB)DNA对鉴别诊断结核性脑膜炎(tuberculous meningitis,TBM)的应用价值。方法 选择2019年7月—2021年6月于安陆市普爱医院就诊的存在脑膜刺激征的80例患者作为研究对象,所有患者均经MTB培养后明确诊断,将确诊为TBM的37例患者分入脑膜炎组,疑似TBM的18例患者分入疑似组,非TBM的25例患者分入非TBM组,对3组患者行腰椎穿刺,留取5 m L脑脊液及时送检,分别行MTB培养法、抗酸染色涂片法、荧光定量PCR检测。对比3种检测方法在MTB中的阳性检出率,对比脑膜炎组与疑似组患者MTB的DNA检测数值。结果 脑膜炎组应用荧光定量PCR检测MTB的阳性检出率高于疑似组,差异有统计学意义(P<0.05);脑膜炎组与疑似组采用MTB培养法、抗酸染色涂片法的MTB阳性检出率比较,差异无统计学意义(P>0.05)。脑膜炎组患者MTB的DNA检测数值为(4.71±0.97),疑似组患者MTB的DNA检测数值为(4.35±0.83),2组患者MTB的DNA检测值比较,差异无统计学意义(t=1.351,P=0.183)。结论 应用荧光定量PCR检测脑脊液中MTB的DNA,有助于判断TBM患者病情严重程度,在鉴别诊断TBM中具有较高的临床应用价值,为临床诊疗提供新思路及方向,值得临床推广应用。

Taq Man探针实时荧光定量聚合酶链式反应检测低温酸乳中常见的霉菌和酵母

为提高低温酸乳中霉菌和酵母菌检测效率,根据保守基因延伸因子1α(elongation factor 1α,EF-1α)序列分别针对霉菌与酵母菌设计引物与探针,利用实时荧光定量聚合酶链式反应,基于TaqMan探针分别建立霉菌和酵母菌检测方法。以低温酸乳中常见真菌与乳酸菌基因组DNA为扩增模板进行特异性检验,并对方法灵敏度与重复性进行检验,同时构建标准曲线。结果表明:根据EF-1α基因设计的引物与探针特异性良好;所构建的标准曲线相关系数均大于0.99;该方法检测酵母菌的灵敏度为101 CFU/mL,检测霉菌的灵敏度为102 CFU/mL;重复性检验中组内与组间的变异系数均小于2%,表明方法具有良好的可靠性与稳定性,适用于低温酸乳中霉菌与酵母菌的快速检测。