多重连接依赖式探针扩增技术在遗传病分子诊断中的应用

多重连接依赖式探针扩增技术(multiplex ligation-dependent probe amplification,MLPA)是近年发展起来的基因检测新技术,可通过简单的杂交(hybridization)、连接(ligation)及PCR(polymerase chain reaction)扩增反应于同一管内同时检测出多达40种基因组DNA或RNA拷贝数变化。凭借其操作简单、高通量、稳定可靠等特点,该技术在遗传病的分子诊断等领域的应用已得到迅速的推广,本文就MLPA技术的原理、特点以及在遗传病分子诊断中的实际应用等作一综述。

采用多重连接依赖式探针扩增技术对先天性心脏病患儿进行基因拷贝数变异分析

目的探讨多重连接依赖式探针扩增(multiplex ligation-dependent probe amplification,MLPA)技术在临床上检测先天性心脏病(congenital heart disease,CHD)患者基因拷贝数变异(copy number variation,CNV)的可行性,了解中国未挑选的先天性心脏病患儿中基因拷贝数变异的发生情况。方法收集未挑选的125例先天性心脏病患儿,以100例年龄、性别匹配的健康儿童为正常对照组,采用MLPA技术(MLLPA-kit P311试剂盒)对病例组和对照组的基因组DNA进行分析。结果在125例先天性心脏病患儿中,发现5个22q11.2微缺失,阳性检出率为4%(5/125)。在100例正常对照中均未检出拷贝数变异。结论 CNV是CHD的重要致病机制,而22q11微缺失是CHD患者中常见的CNV的类型之一。ML-PA技术具有高通量、快捷及成本较低等特点,可应用于先天性心脏病基因拷贝数异常的检测。

多重连接探针扩增技术在食品安全检测中的应用研究进展

阐述了多重连接探针扩增(MLPA)技术在食品过敏原检测、食品掺假、食源性致病菌和转基因食品检测中的应用现状,并对该技术在食品安全检测领域的发展趋势和挑战进行展望。

基于多重连接依赖探针扩增(MLPA)技术检测加工食品中过敏原成分

该研究基于多重连接探针扩增技术(Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification,MLPA)同时检测开心果、巴西坚果、芹菜、麸质、夏威夷果、芝麻、榛子、大豆、花生、葵花籽、核桃、腰果、杏仁、芥末等14种植物源性的过敏原成分,针对ITS序列设计特异性杂交探针,样本核酸经95℃变性后,与探针进行特异性结合,经连接和PCR扩增反应得到不同大小的目标片段,通过毛细管电泳分析目标片段的有无来判断是否含有待测过敏原成分。利用混合探针体系检测单一模板只能扩增出单一扩增峰,表明探针具有高特异性,检测限结果表明,MLPA扩增最低可检出的DNA质量浓度为1ng/μL。通过20份实际样本的检测,证明该研究基于MLPA建立的加工食品中过敏原成分的检测方法,具有特异性强,灵敏度高的特点,可以应用于食品安全监管工作。

应用多重连接依赖式探针扩增技术快速高通量诊断胎儿染色体非整倍体异常

目的 评价多重连接依赖式探针扩增技术（multiplex ligation-dependent probe amplification,MLPA）在染色体非整倍体诊断中的应用价值,为我国羊水染色体诊断提供一种快速、特异、高通量的分子诊断手段.方法 应用MLPA技术检测了500份羊水标本,所有标本均进行荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization,FISH）技术检测和常规染色体核型分析,应用RH-MLPA-v511数据分析软件获得MLPA结果,比较MLPA技术与FISH和染色体核型分析结果的准确性,总结MLPA技术临床应用过程中的关键要点.结果 在500份羊水标本中,MLPA检测成功率97%.3个工作日完成结果的为92%,需重复检测的为5%,失败为3%.对染色体非整倍体异常检测敏感性和准确性100%.证实38例非整倍体病例探针信号比值＞正常二倍体4s,2例疑似三体结果＞2s.分析了21号染色体8条探针的杂交效率,21三体患者8条探针中平均4条探针比值＞1.3.结论 MLPA技术具有快速、特异、敏感、高通量、成本低等特点,可用于产前染色体非整倍体数目的快速检测,是传统染色体培养方法的补充,临床应用价值较高.

多重探针连接依赖式扩增技术在常见非整倍体染色体异常快速产前诊断中的应用研究——附407例检测报告

目的:评估现有多重探针连接依赖式扩增技术(MLPA)方案作为常见非整倍体染色体异常的快速产前诊断方法的有效性。方法:对407例羊水样本进行MLPA试验及羊水细胞染色体G显带核型分析,所有样本进行MLPA获得的扩增产物信息经GenemarkerV 1.80软件进行定量分析,观察样本DNA拷贝数的变化,并将所得结果与染色体核型分析结果进行比较,计算其检测的敏感度、特异度及阳性预测值。结果:407例样本中,应用MLPA技术发现正常样本397例及染色体非整倍体异常样本9例。异常结果包括21三体6例、18三体1例、X三体1例及X-单体1例,与羊水细胞培养染色体G显带核型分析结果一致。MLPA检测出的1例X单体疑似样本,经核型分析结果验证为正常核型。MLPA检测非整倍体性染色体异常的敏感度为100%,特异度为99.75%,阳性预测值为90%。结论:MLPA分析技术作为一项快速产前诊断技术,具有良好的特异性和应用价值。

早期自然流产胚胎绒毛染色体多重连接依赖式探针扩增技术分析

目的分析早期自然流产绒毛组织染色体异常的分布,探讨染色体异常发生率与胎儿性别、孕妇年龄及辅助生殖技术的相关性,为临床遗传咨询和生育指导提供实验室依据。方法应用多重连接依赖式探针扩增技术(multiplex ligation-dependent probe amplification,MLPA)对2019年6~12月广西壮族自治区生殖医院的流产绒毛标本进行染色体检测,并收集患者的相关病历资料进行遗传学分析。结果75例绒毛标本中共检出染色体异常44例(58.7%),其中三体型最为常见(90.9%,40/44)。男胎染色体异常率(71.4%)明显高于女胎(47.5%)(P<0.05);孕妇年龄≥35岁组的胚胎染色体异常发生率明显高于年龄<35岁组(P<0.05);自然受孕与辅助生殖受孕后自然流产的胚胎染色体异常率比较,差异无统计学意义(P>0.05),但卵胞浆内单精子显微注射组高于体外受精组(P<0.05)。讨论胚胎染色体异常可能是早期自然流产的重要原因。胚胎性别、孕妇年龄以及不同方式辅助生殖技术均与绒毛染色体异常的发生有一定关系。用MLPA法可快速、准确、经济地分析流产胚胎染色体情况,对于指导下一次妊娠及优生优育有重要意义。

多重探针连接依赖式扩增技术检测矮小儿童生长激素受体基因分析

目的：探讨矮小儿童生长激素受体（GHR）基因的变异情况。方法：选择矮小儿童96例,其中生长激素缺乏症（GHD）67例、特发性矮小（ISS）29例,另选择生长发育正常儿童23例,采集外周血,应用多重探针连接依赖式扩增（MLPA）技术检测GHR基因10个外显子,并分析比较GHR外显子的基因型及等位基因频率分布情况。结果：GHR基因外显子1～10均未发现信号升高,外显子1、2和4～10也未发现信号降低或缺失等异常情况;GHR外显子3信号降低和缺失的发生率在GHD组分别为34.3%、1.5%,在ISS组为17.2%、3.4%,在正常对照组为26.1%、8.7%;3组儿童GHR外显子3的3种基因型及等位基因频率的差异均具有统计学意义。结论 GHR基因外显子3在矮小及正常儿童中均存在多态性,GHR基因对身高的影响及其生物学功能有待进一步探讨。

多重连接探针扩增技术鉴别半夏及其常见混伪品

目的基于多重连接探针扩增技术(MLPA)建立一种中药材半夏与其常见伪品虎掌、滴水珠的分子鉴定方法,为半夏药材质量控制提供依据。方法从Genbank数据库下载半夏属核基因组内转录间隔区(ITS)序列,利用MEGA 6.05版软件进行序列比对,依据半夏、虎掌及滴水珠ITS序列中的单核苷酸多态性(SNP)位点设计物种特异性MLPA探针,MLPA反应后采用熔解曲线法对扩增产物进行分析。结果半夏、虎掌和滴水珠样品DNA与物种特异性MLPA探针可分别产生位于84.84,82.76及80.14℃的单一熔解峰,表明探针具有良好特异性;构建的探针体系可对0.1 ng模板DNA进行检测,并可有效检出半夏中掺混1%的虎掌或滴水珠样品。对市场收集样品进行检测,鉴别结果准确,灵敏度高。结论该研究建立的多重连接探针扩增方法可准确鉴别半夏和虎掌、滴水珠,具有特异性强、灵敏度高等特点,可为半夏药材质量控制提供技术支持。

高通量红细胞血型基因分型的多重连接依赖的探针扩增技术在一例抗Di^a新生儿溶血病诊断中的应用

目的运用高通量红细胞血型基因的多重连接依赖的探针扩增技术(multiplex ligation-dependent probe amplification,MLPA)辅助诊断一例罕见的由抗Di^a导致的严重核黄疸新生儿溶血病。方法运用传统的血型血清学方法对导致新生儿溶血病相关红细胞血型抗体进行鉴定,运用MLPA对患儿及其父母的超过40种红细胞血型抗原进行基因分型,对鉴定的抗体进行效价分析。结果血型血清学检测表明患儿体内含有针对某种低频抗原的抗体,MLPA基因分析结果提示母婴红细胞MNS血型系统及Diego血型系统抗原不匹配,可能存在抗N或抗Di^a,经进一步的血型血清学检测,证实母亲及患儿血清中存在抗Di^a,并且其母亲血清抗Di^a效价为1:32。结论抗Di^a可引起包括核黄疸在内的严重新生儿溶血病;高通量红细胞血型基因分型的MLPA技术能够协助并有效解决临床疑难样本稀有血型鉴定;针对国人的Di^a阳性的试剂红细胞应该常规应用于日常的抗体筛查工作中。

多重连接依赖的探针扩增(MLPA)技术在自然流产样本检测中的应用

目的评价多重连接依赖的探针扩增(multiplex ligation-dependent probe amplification,MLPA)技术在自然流产组织遗传学分析中的临床应用价值。方法采用常规染色体核型分析和MLPA产前非整倍体筛查试剂盒对12例胚停后行清宫术的绒毛组织样本进行检测。结果核型分析12例绒毛样本仅11例得到结果,而MLPA成功分析12例样本。两种方法均成功分析的样本中,7例为非整倍体,1例为结构异常。结构异常的样本核型分析无法定位,由MLPA法检测明确拷贝数异常的区间。1例非整倍体样本核型分析无法明确多余的染色体来源,MLPA检测明确了其来源。结论 MLPA技术在流产病因检测上可以作为核型分析的重要补充。

多重连接依赖式探针扩增和变性高效液相色谱法检测Duchenne型肌营养不良症患者DMD基因的缺失/重复突变

目的比较多重连接依赖式探针扩增法（MLPA）和变性高效液相色谱法（DHPLC）检测Duchenne型肌营养不良症（DMD）患者DMD基因缺失／重复突变的效果。方法选择2004年10月-2005年10月在我院确诊的22位无关DMD男性患者，采用MLPA法对经DHPLC技术检测过的患者的DMD基因的缺失／重复突变进行突变筛查，同时对先证者的23位女性亲属进行基因的缺失／重复突变检测。结果DHPLC技术和MLPA法均检测出11位先证者具有DMD基因缺失突变，3位先证者具有DMD重复突变；MLPA法除能更精确地检测出上述突变外，还检测出DHPLC法未检测出的两位患者的DMD基因存在缺失突变。16个家系中18位可能的女性携带者中，12位经检测为缺失／重复突变携带者。两种方法均未检测到6位先证者及其女性亲属DMD基因具有缺失／重复突变。结论与DHPLC法和传统的多重PCR方法相比，MLPA法检测DMD基因的缺失／重复突变位置更为准确。MLPA法可用于检测先证者及家系中女性携带者DMD基因的缺失／重复突变。

多重连接依赖的探针扩增(MLPA)技术在广州地区RhD阴性献血者基因分型研究中的应用

目的采用新型Rh血型系统的MLPA检测试剂盒,对广州地区收集的200名RhD阴性献血者进行基因分型。方法采用传统的血型血清学方法,对RhD阴性献血者进行RhD表型鉴定。提取基因组DNA,采用MLPA检测试剂盒对收集的200名RhD阴性献血者进行RHD基因分型。对于不能明确分型的标本,进行RHD基因直接测序分析。结果在200名RhD阴性献血者中,采用MLPA方法对196名进行了明确的基因分型。其中,127名为RHD基因缺失(占63.5%);仅检测到包含RHD1227A突变的DEL等位基因有41例,其中38例包含杂合等位基因,其余3例包含纯合等位基因;仅检测到RHD(1-2)-CE(3-9)-D(10)等位基因的有23例,其中19例杂合,4例纯合;3例包含2种不同的RHD等位基因(1条为RHD(1-2)-CE(3-9)-D(10),另1条为RHD1227A);其余2例分别包含杂合的DFR-2(RHD-CE(4)-D)及弱D15型(RHD845A)等位基因。在其余4例直接测序分析的标本中,2例包含杂合的RHD711delC突变;1例1条等位基因为MLPA检测到的包含RHD1227A突变的DEL等位基因,另1条为包含711delC突变的RHD等位基因;其余1例的1条等位基因为MLPA检测到的RHD(1-2)-CE(3-9)-D(10),另1条为包含新突变的RHD等位基因(1154G>T,385Gly>Val)。结论 MLPA检测试剂盒是适用于中国人群的1种快速、有效的高通量基因分型方法,能够对中国人群常见的各种RHD基因型进行明确分型,适用于参比实验室相关疑难标本的基因分型检测。也可应用于中国人群常见的Del表型检测,使Del表型患者不必再输注RhD阴性血液,节约稀有的RhD阴性血液资源。

多重连接依赖的探针扩增技术检测中国人遗传性非息肉病性结直肠癌错配修复基因大片段缺失

目的 了解中国人遗传性非息肉病性结直肠癌（HNPCC）家系hMSH2和hMLH1基因大片段缺失特点。方法 采用多重连接依赖的探针扩增（MLPA）技术和GeneMapper分析技术检测17个HNPCC家系先证者hMSH2和hMLH1基因种系大片段缺失。结果 在3个家系中分别发现hMSH2基因第8外显子、1～6外显子和1～7外显子3种大片段缺失类型，未发现hMLH1基因大片段缺失。大片段缺失占hMSH2和hMLH1基因总种系病理性突变的19％。结论 中国人HNPCC错配修复（MMR）基因大片段缺失发生率较高，hMSH2基因缺失可能更为常见。在分子遗传学检测中有必要开展MMR基因大片段缺失的检测。

多重连接依赖式探针扩增技术在α地中海贫血基因诊断与产前诊断中的应用

目的探讨多重连接依赖式探针扩增（MLPA）技术在α地中海贫血（地贫）基因缺失检测及产前诊断中的应用。方法采用全血细胞计数和血红蛋白成分检测对受检者外周血标本进行表型分析，采用常规跨越裂点PCR（gap—PCR）技术及反向斑点杂交（RDB）法检测α地贫基因缺失及点突变，采用MLPA技术检测仪珠蛋白基因缺失；产前诊断采用gap—PCR和MLPA法对胎儿标本进行仅地贫基因缺失检测。结果1256份（628对夫妇）受检者外周血标本中，75份检出α地贫表型特征。其中71份经常规方法检出α地贫基因突变且与表型相符；3份经常规方法未检出基因突变和1份具有血红蛋白H病表型且基因型为-α^4.2／αα的标本，经MLPA法各检出1例α珠蛋白基因簇大片段缺失；筛出17对高风险夫妇。17份产前诊断标本中，2份受外源DNA污染的绒毛标本经MLPA法获得确诊。结论MLPA是α地贫基因缺失常规gap—PCR检测方法的有效补充，可防止α地贫基因缺失的漏诊及产前诊断中的假阳性或假阴性误诊。

磁珠法DNA提取技术在多重连接依赖探针扩增检测中的应用

目的探讨磁珠法DNA提取技术在多重连接依赖探针扩增(MLPA)检测样品制备中的应用价值。方法分别用半自动磁珠法和手工离心柱法提取1例21-羟化酶缺乏症患者和16例健康男性外周血、16例羊水细胞标本的基因组DNA,用MLPA法检测CYP21A2基因拷贝数,比较两种方法制备DNA的质量及MLPA结果。用磁珠法提取200例羊水细胞DNA,MLPA法检测染色体非整倍体异常表达情况。结果磁珠法提取外周血DNA的浓度和总量均高于离心柱法(P<0.05)。两种方法提取羊水DNA浓度相当,磁珠法所得总量较高(P<0.05)。21-羟化酶缺乏症患者CYP21A2基因拷贝数比值接近0.5。200例羊水标本中检出正常二倍体188例,21三体9例,18三体2例,特纳(Turner)综合征(45,X)1例,与核型分析结果一致。结论磁珠法制备的外周血和羊水细胞DNA适用于MLPA检测,具有较高的应用价值。

多重连接依赖式探针扩增法在区分肾上腺皮质肿瘤良恶性中的应用

目的采用多重连接依赖式探针扩增法(MLPA),分析筛查不同肾上腺皮质肿瘤中基因缺失/重复的差别。方法选择5例肾上腺皮质腺瘤和2例肾上腺皮质癌患者,采用MLPA的方法针对癌基因和抑癌基因,对肿瘤组织DNA潜在发生缺失/重复的基因进行突变筛查。结果肾上腺皮质良性肿瘤中,部分存在06p21.3、12q24.13、17p13.1、17q21.1、19q13.41基因位点重复性改变;在肾上腺皮质癌中,上述区段均发生改变,同时存在片段11q13缺失。结论MLPA法适合检测肾上腺皮质肿瘤的基因缺失/重复位点,肾上腺皮质腺瘤中基因位点改变数目显著少于皮质癌。

用多重连接依赖探针扩增技术进行Y染色体微缺失的产前诊断

目的探讨多重连接依赖探针扩增(multiplex ligation-dependent probe amplification,MLPA)技术在Y染色体微缺失产前诊断中的应用价值。方法收集4例染色体为46,XYqh-和1例染色体46,X,+mar的羊水样本,用MLPA P095染色体非整倍体检测试剂盒和Y染色体微缺失检测试剂盒分别对5例羊水样本进行检测。结果 4例Yqh-染色体的羊水样本的Y染色体信号值均在正常范围内,即Y染色体不存在微缺失,1例小Mar染色体为Y染色体;进一步用Y染色体探针检测结果示,Y染色体上AZFb和c区存在大片段缺失。结论用MLPA技术对疑似Y染色体微缺失的病例进行检测,可判断是否存在Y染色体生精功能区域的缺失,为产前诊断提供分子遗传学依据。

多重连接依赖性探针扩增方法在脊髓性肌肉萎缩症基因诊断中的应用

目的探讨多重连接依赖性探针扩增(MLPA)方法在脊髓性肌肉萎缩症(SMA)基因诊断中的应用,指导SMA的遗传咨询。方法收集3例疑似SMA的患儿及其父母的外周血标本,提取基因组DNA,应用MLPA技术进行分析。结果3例患儿均存在运动神经元存活基因端粒侧(SMN1)的纯合缺失,拷贝数为0;患儿父母均存在SMN1基因的杂合缺失,拷贝数为1。结论 MLPA技术可以应用于SMA患儿的基因诊断,不仅快速、简便,还可辨别携带者致病基因杂合缺失情况,可筛查携带者。

多重连接探针扩增技术检测常见线粒体疾病

目的探讨多重连接探针扩增技术(multiplex ligation-dependent probe amplification,MLPA)用于常见线粒体疾病基因检测的可行性。方法收集2010年5月至2012年8月北京协和医院281例可疑线粒体异常病例,包括神经科存在神经系统损伤的患者233例及眼科疑诊Leber遗传性视神经病变的患者48例,运用MLPA法对常见线粒体疾病突变位点进行检测,并使用线粒体基因序列测定方法进行验证。结果 281例标本中共38例检测到线粒体基因突变,总检出率为13.5%。眼科48例标本中,3460G>A、11778G>A和14484T>C3种突变共检测到19例,检出率为39.6%;神经科233例标本中,3243A>G、8344A>G、8993T>G和大片段缺失共检测到19例,检出率为8.2%。除1例大片段缺失暂无PCR测序验证外,其余MLPA结果均经序列测定验证为相符。结论 MLPA法是一种可行的快速、准确、简便的基因诊断方法,可作为筛查常见线粒体疾病的检测工具,为临床诊断和治疗提供依据。