多重连接依赖性探针扩增方法在脊髓性肌肉萎缩症基因诊断中的应用

目的探讨多重连接依赖性探针扩增(MLPA)方法在脊髓性肌肉萎缩症(SMA)基因诊断中的应用,指导SMA的遗传咨询。方法收集3例疑似SMA的患儿及其父母的外周血标本,提取基因组DNA,应用MLPA技术进行分析。结果3例患儿均存在运动神经元存活基因端粒侧(SMN1)的纯合缺失,拷贝数为0;患儿父母均存在SMN1基因的杂合缺失,拷贝数为1。结论 MLPA技术可以应用于SMA患儿的基因诊断,不仅快速、简便,还可辨别携带者致病基因杂合缺失情况,可筛查携带者。

应用多重连接依赖性探针扩增技术进行脊髓性肌萎缩症的基因诊断及产前诊断

目的探讨多重连接依赖性探针扩增（multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA）技术在脊髓性肌萎缩症（spinal muscular atrophy，SMA）基因诊断及产前诊断中的应用。方法选择来自8个SMA家系的患者4例，父母16例，胎儿4例，应用MLPA技术进行分析，对患者同时应用聚合酶链反应一限制性片段长度多态性（polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR—RFLP）方法进行分析。结果对患者的检测，MLPA分析结果与PCR-RFLP检测结果相符，4例患者的运动神经元存活基因（survival motor neuron gene，SMN）1的第7和第8外显子均为纯合缺失。除家系1、4母亲的SMN1基因MLPA检测结果与其他家系不同外，其余各家系14名父母均明确诊断为SMN1基因杂合缺失突变携带者。结论MLPA技术是一种准确可靠的基因定量分析方法，适合于SMA患者、携带者的基因诊断及产前诊断。

应用多重连接依赖性探针扩增定量技术检测假肥大型肌营养不良重复突变及携带状态

目的应用多重连接依赖性探针扩增（MLPA）技术对假肥大型肌营养不良（DMD及BMD）患者及其家系成员进行dystrophin基因分析，探讨MLPA定量技术在本病重复突变及携带者检测中的优势。方法以355例DMD及BMD患者、46名缺失型患者之母和8名重复型患者之母为研究对象，应用MLPA技术对dystrophin基因全长外显子进行分析，对于单一外显子缺失的样本采用PCR及测序进行验证。结果经MLPA分析，全部355例患者中190例为dystrophin基因缺失型患者，在其余非缺失型患者中检测出34例重复型突变。此外，在46名缺失型患者的母亲中发现了28名携带者，在8名重复型患者的母亲中发现了6名携带者，两组患者母亲携带者频率差异无统计学意义。经过测序验证，在1例单一外显子缺失的患者中发现17号外显子存在AGGGAACAGATCCTGGTAAAGCA小片段缺失。结论与传统的定量方法相比，MLPA定量技术可对DMD及BMD患者全长外显子区域同时进行缺失、重复分析，并能对患者家系成员的携带状态进行判定。此外，MLPA检测结果受模板DNA的浓度及纯度影响较小。

多重连接依赖性探针扩增技术在X连锁Alport综合征基因诊断中的应用

目的应用多重连接依赖性探针扩增（MLPA）技术检测COL4A5基因，为x连锁Alport综合征基因诊断探索新的方法。方法对在北京大学第一医院临床诊断的，并且行COL4A5基因检测存在大片段缺失突变的3例X连锁Alport综合征患者，采用反转录（RT）-PCR、PCR和MLPA三种方法检测分析COIAA5基因突变。结果患儿l发现COIAA5基因连续缺失第22、23、24外显子；患儿2发现COIAA5基因缺失第30外显子；患儿3发现缺失COIAA5基因第1、2外显子和COIAA6基因第1、2外显子。这3个大片段缺失突变均为国内外首次报道新的突变。RT-PCR、PCR和MLPA方法结果一致，相互验证补充。结论MLPA可以用于检测COIAA5基因大片段缺失突变，为X连锁Alport综合征基因诊断提供了一种新的方法。

多重连接依赖性探针扩增技术在脊髓性肌萎缩症产前诊断中的应用

目的：探讨多重连接依赖性探针扩增（MLPA）技术在脊髓性肌萎缩症（SMA）产前诊断中的应用价值。方法：收集3个SMA家系（10例），采集患儿及其父母的外周血及妊娠11～13拍周的绒毛，提取基因组DNA，运用MLPA技术进行产前诊断。结果：3例胎儿均为运动神经元存活基因（SMN）I杂合缺失，SMN2拷贝数正常；家系I先证者为SMN1纯合缺失及SMN2杂合重复：3个家系父母均有SMN1杂合缺失，部分还有SMN2杂合缺失或重复。结论：MLPA技术对SMA的产前诊断具有重要意义，可为遗传咨询提供可靠信息。

应用甲基化特异性多重连接依赖性探针扩增和甲基化特异性PCR检测Prader-Willi综合征

目的比较甲基化特异性多重连接依赖性探针扩增和甲基化特异性PCR两种方法检测Prader–Willi综合征。方法应用细胞遗传学、甲基化特异性多重连接依赖性探针扩增和甲基化特异性PCR方法检测1个Prader–Willi综合征家系。结果甲基化特异性多重连接依赖性探针扩增和甲基化特异性PCR方法均能对患者进行检测,为缺失型致病,而其父母未见异常。结论甲基化特异性多重连接依赖性探针扩增方法检测Prader–Willi综合征比甲基化特异性PCR方法提供更多的致病信息。

多重连接依赖性探针扩增技术在脊肌萎缩症诊断中的应用

目的探讨多重连接依赖性探针扩增技术在脊肌萎缩症的患者诊断、携带者诊断及产前诊断中的应用。方法收集脊肌萎缩症患者39例、父母30例(15例患者的双亲)、胎儿9例;同时选取44例健康个体为正常对照。抽提外周血或羊水标本DNA,应用多重连接依赖性探针扩增技术分析SMN1基因外显子7和外显子8是否缺失。结果 39例脊肌萎缩症患者中有35例存在SMN1基因外显子7和外显子8纯合缺失,其余4例为外显子7纯合缺失。30例父母的SMN1基因均呈现外显子7和外显子8杂合缺失。9例胎儿中,有2例存在SMN1基因外显子7和外显子8纯合缺失,4例有外显子7和外显子8杂合缺失,3例未见SMN1基因外显子7或外显子8缺失。44例正常对照个体均未见SMN1基因外显子7或外显子8缺失。结论多重连接依赖性探针扩增技术是一种可靠的脊肌萎缩症分子诊断方法,可用于脊肌萎缩症的患者基因诊断、携带者基因诊断及产前基因诊断。

多重连接依赖性探针扩增技术在α地中海贫血产前诊断中的应用

目的探讨多重连接依赖性探针扩增（multiplexligation-dependentprobeamplification，MLPA）技术在α地中海贫血（简称地贫）产前基因诊断中的应用。方法对2例血液学检查（全血细胞计数和血红蛋白分析）为α地贫表型特征，α地贫基因常规方法检测为正常的孕妇的血液样本进行MLPA检测；对89对夫妇双方或一方为α地贫基因携带者的家系中的胎儿样本，采用常规跨越断裂点PCR（Gappolymerasechainreaction，Gap-PCR）技术和反向斑点杂交技术检测α珠蛋白基因的缺失及点突变；同时应用MLPA技术对上述89份样本进行a珠蛋白基因缺失检测。结果上述2例孕妇的血液样本，经MLPA检测未检测到a珠蛋白基因缺失，后经证实为缺铁性贫血；88份胎儿样本的MLPA检测结果和Gap—PCR检测结果完全一致；1份胎儿样本（绒毛组织）经Gap—PCR检测未能确诊，后结合MLPA检测确诊为--SEA／αα。结论MLPA技术可应用于α地贫的产前基因诊断，作为Gap—PCR技术的有效补充，减少漏诊和误诊，提高产前诊断的准确率。

多重连接依赖性探针扩增技术在杜氏肌营养不良分子诊断中的应用

目的探讨多重连接依赖性探针扩增技术(MLPA)在杜氏肌营养不良(DMD)分子诊断中的应用。方法对2008年12月至2013年1月南京军区福州总医院就诊的18个家系中临床怀疑DMD患者进行MLPA分析,并对其中2个家系中高风险孕妇进行产前分子诊断。结果通过MLPA检测,在6例患者DMD基因中检测出外显子缺失(其中2例为新生突变),1例为外显子重复突变。产前分子诊断中在其中1例胎儿的DMD基因中检测到与先证者相同的缺失突变,而另1例未测到与先证者相同突变。结论MLPA能够检测出DMD基因中外显子缺失和重复突变,在临床应用上具有广阔前景。

市售食品21种动植物过敏原成分的检测分析

为进一步明确市售食品动植物过敏原标注情况,该研究建立一种可同时检测21种动植物过敏原成分的多重连接依赖性探针扩增(MLPA)技术,并对其进行灵敏度实验,并结合实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-fqPCR)检测技术对38种市售预包装食品中动植物过敏原成分进行比较分析。结果表明,采用MLPA检测技术可同时对21种动植物过敏原成分进行检测,扩增峰之间不存在交叉干扰,扩增峰实际大小和理论大小相差≤3 bp,检出最低脱氧核糖核酸(DNA)质量浓度为1 ng/μL;RT-fqPCR、MLPA技术检测标注过敏原成分食品的检出率分别为51.5%、44.1%,此外,MLPA检测法检出了6个标注可能含有过敏原成分样品中的过敏原成分,10个样品中未标记的过敏原成分。因此,采用MLPA技术检测21种动植物过敏原成分的灵敏度更高。

荧光短片段多重PCR在脊髓性肌萎缩症SMN1基因突变检测中的应用

目的设计特异性扩增引物,建立荧光短片段多重PCR技术检测SMN1基因拷贝数变异的方法,验证方法的检测性能并初步应用于基因拷贝数检测。方法选取107例来自神经系统疾病生物样本库的人外周血DNA样品(包括SMN1基因0拷贝30例、1拷贝47例、2拷贝30例),设计5’端带有FAM荧光基团的SMN1基因7号外显子引物以及三对内参基因引物,利用荧光短片段多重PCR技术,使用基因分析仪片段分析多重PCR的产物,并与相应的MLPA检测结果进行比较。结果特异性扩增SMN1基因7号外显子及内参基因的引物可实现目的片段的扩增,通过计算可得到0拷贝、1拷贝、2拷贝的样本结果。对107例DNA样本的SMN1基因拷贝数荧光短片段多重PCR的检测结果进行分析,实验结果均与MLPA检测结果相一致。结论使用荧光标记多重PCR反应检测SMN1拷贝数可重复性好,精确度高,与MLPA得到的结果高度一致,具有便捷、准确、成本低的优势,可满足临床高准确性的检测要求,可用于SMA新生儿携带者的大规模筛查。

免疫磁珠分选和MLPA技术联合检测多发性骨髓瘤分子遗传学异常系统的建立

目的探讨联合免疫磁珠分选和多重探针连接依赖性扩增(MLPA)技术检测多发性骨髓瘤(MM)分子遗传学异常的可靠性。方法收集29例初诊MM患者的骨髓细胞,用CD138磁珠进行分选,设计MLPA探针检测分选前后标本TP53和RB1的表达情况,并与FISH检测结果进行对照。结果 MLPA检测成功率100%,与FISH结果吻合度达99.1%,分选后MLPA和FISH阳性率均有显著性提高。结论 MLPA适合临床MM分子遗传学异常检测,标本应在检测前进行磁珠分选。

Prader-Willi综合征的临床筛查和基因诊断

目的探讨临床疑似Prader-Willi综合征(PWS)患儿的临床筛查、基因诊断及确诊病例临床诊断评分结果的差异。方法选取2016年7月至2018年12月收治的临床疑似PWS患儿94例为研究对象,应用甲基化特异性多重连接依赖性探针扩增(MS-MLPA)技术进行检测,对确诊患儿采用临床诊断评分进行评估,并分析确诊患儿的围生期特征。结果MS-MLPA技术确诊PWS患儿11例,检出率为12%;其中男7例,女4例;中位确诊年龄3岁4个月(范围:25 d至6岁8个月)。11例PWS患儿中仅5例(45%)满足临床诊断标准。PWS患儿围生期主要特征有胎动减少9例(82%)、剖宫产11例(100%)、新生儿期肌张力低下11例(100%)、喂养困难11例(100%)及哭声低下11例(100%)。结论对临床疑似的PWS患儿应及早进行基因检测确诊,单纯依靠临床诊断评分可能导致PWS漏诊。

儿童Peutz-Jeghers综合征家系的基因突变

目的 Peutz-Jeghers综合征是少见的常染色体显性遗传性疾病,患者特征性临床表现为口唇黑斑和肠道多发错构瘤性息肉。LKB1/STK11基因胚系突变与Peutz-Jeghers综合征的发病有密切关系。文中探讨1例Peutz-Jeghers综合征家系LKB1/STK11基因的病理性突变。方法收集家系成员外周血,提取DNA,采用多重连接依赖性探针扩增(multiplex liga-tion-dependent probe amplification,MLPA)、PCR-变性高效液相色谱(denaturing high performance liquid chromatography,DHPLC)、DNA测序等方法分别检测LKB1/STK11基因大片段缺失、碱基突变、碱基插入和缺失。同时收集250名正常人外周血,提取DNA,用PCR-DHPLC筛查验证突变位点在正常人群中的分布。用生物信息学分析突变位点对编码蛋白质结构和功能的影响。结果家系中2名受累成员均携带LKB1/STK11基因c.924G>C位点的病理性胚系突变,导致Trp308Cys错义突变。结论 LKB1/STK11基因c.924G>C位点的病理性胚系突变是此家系的致病性因素。Peutz-Jeghers综合征家系中LKB1/STK11基因的胚系突变筛查可作为一种有效的手段来预测风险。

MLPA技术在脊髓性肌肉萎缩症基因诊断中的应用

目的：探讨多重连接依赖性探针扩增（MLPA）技术在脊髓性肌肉萎缩症（SMA）患者、携带者及产前基因诊断中的应用。方法以临床诊断为 SMA 患儿为研究对象，采用基因组 DNA 多重连接探针扩增（MLPA）技术进行 SMN1基因和 SMN2基因拷贝数变异检测。结果 MLPA 分析结果显示，9个家系中9例患者及2例胎儿呈 SMN1基因纯合缺失，其父母双方 SMN1基因7、8外显子均为杂合性缺失，均为 SMA 携带者。结论 ML‐PA 技术可以应用于 SMA 患儿的基因诊断，不仅快速、简便，还可辨别携带者致病基因杂合缺失情况，可筛查携带者。

血友病基因携带孕妇258例产前诊断结果分析

目的通过分析血友病基因携带孕妇的产前诊断结果,评价多种直接基因诊断方法联合使用对血友病基因检测的价值。方法对产前诊断中心行产前诊断的258例血友病基因携带孕妇,联合应用LDPCR、MLPA、基因测序方法对胎儿基因进行直接检测。孕周为11~13周胎儿检测样本通过绒毛吸取术获得,孕周18~28周胎儿检测样本通过羊水穿刺获得。统计致病基因胎儿阳性率、各检测方法的阳性检出率。结果258例血友病基因携带者中,血友病A为225例(87.2%),血友病B为33例(12.8%)。产前诊断胎儿中血友病A基因诊断阳性84例(37.3%),血友病B基因诊断阳性5例(38.6%)。绒毛穿刺131例(50.8%),羊水穿刺127例(49.2%)。穿刺术均无不良事件发生。84例血友病A基因检测阳性病例中,F8基因内含子22倒位39例(46.4%),内含子1倒位4例(4.8%),基因大片段缺失3例(3.6%),基因点突变38例(45.2%)。5例血友病B基因检测阳性者,F9基因4号外显子G-A点突变2例、5号外显子G碱基丢失2例、2号内含子5'端第4碱基A-T突变1例。基因检测阴性胎儿出生后随访1~2年,无血友病发生。结论LD-PCR、MLPA和直接基因测序法联合使用,能对血友病基因进行有效检测,值得临床推广。

杜氏肌营养不良基因突变检测国家参考品的研制

目的建立杜氏肌营养不良基因(DMD)突变检测国家参考品。方法收集DMD突变患儿及其家系血清,对建系成功的46份细胞系扩增繁殖至所需量后,进行基因组DNA提取并分装,制备成国家参考品。8家实验室采用8种二代测序(NGS)试剂和2种多重连接依赖性探针扩增试剂(MLPA)对候选参考品进行了验证。通过NGS和MLPA试剂检测候选参考品评价参考品的均匀性。通过NGS试剂对反复冻融3次后的候选参考品进行检测以评价稳定性。结果4家实验室采用MLPA试剂的检测结果一致,8家实验室采用NGS试剂的检测结果基本一致,对于突变位点信息有争议的参考品,采用一代测序进行了测序验证。NGS和MLPA各自均匀性检测结果均一致,反复冻融3次后的检测结果与常规保存的检测结果一致。结论通过协作验证以及均匀性、稳定性分析,成功建立了DMD突变检测国家参考品,该参考品可用于DMD基因突变检测试剂盒的性能评价。

运用MLPA技术检测男性不孕患者Y染色体微缺失的临床应用

目的调查男性不育患者中Y染色体微缺失的分布频率及缺失位点。方法选择2015年1月至2016年12月上海交通大学医学院附属瑞金医院妇产科生殖中心收治的110例男性不育患者,抽取外周静脉血DNA;运用多重链接依赖性探针扩增(MLPA)技术检测Y染色体微缺失情况,分析比较不同缺乏类型组Y染色体缺失率及缺失位点的差异。结果 110例男性不育患者中,有36例检出存在无精子因子(AZF)区不同程度微缺失,缺失率为32.7%;其中AZFc区缺失发生频率最高,占总缺失的75.0%(27/36);Y染色体微缺失患者无精、少精的发生率更高72.2%(26/36)。结论男性不育患者尤其是无精症/少精症患者Y染色体微缺失发生率较高,应在治疗前进行遗传检测及咨询。

MLPA技术联合染色体核型分析检测儿童发育异常的临床研究

目的探讨多重链接依赖性探针扩增(MLPA)技术联合染色体核型分析在检测儿童发育异常中的临床应用价值。方法收集87例生长发育异常的儿童,抽取外周血进行传统G显带核型分析,并运用MLPA技术进行染色体微缺失等检测,分析发育异常儿童的染色体情况。结果 87例患儿中检出异常核型22例,异常率为25.3%,包括46,XY,小Y染色体核型10例、45,X核型2例、45,X/46,XY核型1例、46,XY/45,XX核型1例、47,XXY核型1例等。在65例正常核型中MLPA仍检测出8例存在微缺失或微重复。结论 MLPA技术联合染色体核型分析为临床诊断儿童发育异常提供了一条有效、准确的检测流程,有利于提高染色体异常的检出率和准确率。

MLPA技术应用于SMA产前诊断的临床价值

目的观察分析MLPA(多重连接依赖性探针扩增)技术应用于SMA(脊髓性肌萎缩症)产前诊断的临床价值。方法选取本院(在2016年2月至2019年2月)收治的三个脊髓性肌萎缩症家系(9例),采集家系父母与患儿外周血、孕妇妊娠羊水标本(16~24周)。采用统计学分析三个脊髓性肌萎缩症家系的多重连接依赖性探针扩增技术检查结果。结果纯合缺失为1例、杂合缺失为9例、杂合重复为2例、情况正常为6例,各组数据比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论多重连接依赖性探针扩增技术应用于脊髓性肌萎缩症患者产前诊断的临床价值高。