基于多重连接依赖探针扩增(MLPA)技术检测加工食品中过敏原成分

该研究基于多重连接探针扩增技术(Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification,MLPA)同时检测开心果、巴西坚果、芹菜、麸质、夏威夷果、芝麻、榛子、大豆、花生、葵花籽、核桃、腰果、杏仁、芥末等14种植物源性的过敏原成分,针对ITS序列设计特异性杂交探针,样本核酸经95℃变性后,与探针进行特异性结合,经连接和PCR扩增反应得到不同大小的目标片段,通过毛细管电泳分析目标片段的有无来判断是否含有待测过敏原成分。利用混合探针体系检测单一模板只能扩增出单一扩增峰,表明探针具有高特异性,检测限结果表明,MLPA扩增最低可检出的DNA质量浓度为1ng/μL。通过20份实际样本的检测,证明该研究基于MLPA建立的加工食品中过敏原成分的检测方法,具有特异性强,灵敏度高的特点,可以应用于食品安全监管工作。

磁珠法DNA提取技术在多重连接依赖探针扩增检测中的应用

目的探讨磁珠法DNA提取技术在多重连接依赖探针扩增(MLPA)检测样品制备中的应用价值。方法分别用半自动磁珠法和手工离心柱法提取1例21-羟化酶缺乏症患者和16例健康男性外周血、16例羊水细胞标本的基因组DNA,用MLPA法检测CYP21A2基因拷贝数,比较两种方法制备DNA的质量及MLPA结果。用磁珠法提取200例羊水细胞DNA,MLPA法检测染色体非整倍体异常表达情况。结果磁珠法提取外周血DNA的浓度和总量均高于离心柱法(P<0.05)。两种方法提取羊水DNA浓度相当,磁珠法所得总量较高(P<0.05)。21-羟化酶缺乏症患者CYP21A2基因拷贝数比值接近0.5。200例羊水标本中检出正常二倍体188例,21三体9例,18三体2例,特纳(Turner)综合征(45,X)1例,与核型分析结果一致。结论磁珠法制备的外周血和羊水细胞DNA适用于MLPA检测,具有较高的应用价值。

用多重连接依赖探针扩增技术进行Y染色体微缺失的产前诊断

目的探讨多重连接依赖探针扩增(multiplex ligation-dependent probe amplification,MLPA)技术在Y染色体微缺失产前诊断中的应用价值。方法收集4例染色体为46,XYqh-和1例染色体46,X,+mar的羊水样本,用MLPA P095染色体非整倍体检测试剂盒和Y染色体微缺失检测试剂盒分别对5例羊水样本进行检测。结果 4例Yqh-染色体的羊水样本的Y染色体信号值均在正常范围内,即Y染色体不存在微缺失,1例小Mar染色体为Y染色体;进一步用Y染色体探针检测结果示,Y染色体上AZFb和c区存在大片段缺失。结论用MLPA技术对疑似Y染色体微缺失的病例进行检测,可判断是否存在Y染色体生精功能区域的缺失,为产前诊断提供分子遗传学依据。

多重连接依赖探针扩增技术筛查Turner综合征的可行性

目的:探究多重连接依赖探针扩增技术(multiple ligation-dependent probe amplification,MLPA)在筛查Turner综合征(Turner syndrome,TS)染色体异常的可行性。方法:收集88例临床诊断矮小症女童的外周血进行MLPA检测及外周血细胞核型分析,采用Fisher确切概率检验对2种方法诊断TS的结果进行差异性分析。结果:88例女童中14例确诊为TS,其中外周血核型分析异常14例(13例为TS,1例为常染色体异常),检测TS灵敏度为92.8%;MLPA检出异常14例(13例TS,1例X染色体部位疑似男性,Y染色体重复),检测灵敏度为100%。2种检测方法的特异度均为100%。采用Fisher确切概率对两种方法的检测灵敏度进行分析,二者无显著差异(P=0.5)。结论:与外周血细胞核型分析相比,MLPA具有更经济、高效、操作难度较低等优点,且对TS的检测灵敏度和特异度无统计学差异,可作为TS的筛查方法。

多重连接探针扩增技术在食品安全检测中的应用研究进展

阐述了多重连接探针扩增(MLPA)技术在食品过敏原检测、食品掺假、食源性致病菌和转基因食品检测中的应用现状,并对该技术在食品安全检测领域的发展趋势和挑战进行展望。

应用多重连接依赖探针扩增技术快速检测胎儿染色体非整倍体与结构异常

目的探讨多重连接依赖探针扩增＇（multiplex ligation-dependent probe amplification, MLPA）技术在羊水细胞染色体非整倍体及染色体结构异常检测中的应用。方法应用MLPA技术对286份羊水样本进行检测，并与常规染色体核型分析进行对比，对于检测到的染色体结构异常应用微阵列比较基因组杂交技术（array comparative genomic hybridization, aCGH）进行验证。结果在286份羊水中，共检测到10例21-三体，2例18三体，1例13三体，1例嵌合21-三体，1例X单体，1例X染色体短臂大片段缺失，1例18号染色体短臂部分三体，1例18号染色体长臂和短臂大片段缺失。所有MLPA结果与染色体核型分析均一致。对于检测到的染色体结构异常均应用aCGH技术验证，检测结果符合率100％。结论MLPA可快速检出常见染色体非整倍体以及染色体结构异常包括大片段缺失与重复，为临床产前诊断提供有价值的信息。

多重连接依赖探针扩增在假肥大型肌营养不良症家系基因诊断中的应用

目的评估多重连接依赖探针扩增（multiplex ligation—dependent probe amplification，MLPA）技术在假肥大型肌营养不良症（Duchenne／Becker muscular dystrophy，DMD／BMD）患者临床诊断、携带者筛查及产前诊断中的应用。方法应用MLPA法检测DMD基因79个外显子的缺失或重复突变，DNA测序以及STR毛细管电泳与连锁分析方法进行验证及辅助诊断。结果47例患儿中7例可见重复突变，31例可见缺失突变，其中7例为单个外显子缺失。23例MLPA检测阳性的患儿的母亲中有13例为携带者。产前诊断的13例胎儿中，3例为男性胎儿患者，2例为女性胎儿携带者。结论MLPA能迅速、直接、准确地检测DMD基因外显子的缺失／重复突变。联合应用MLPA、基因测序以及连锁分析可以提高DMD／BMD基因诊断的准确率。

G显带和多重连接依赖探针扩增联合分析心脏发育畸形胎儿的染色体异常

目的探讨联合应用染色体G显带核型分析与多重连接依赖探针扩增技术（multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA）在检测先天性心脏畸形胎儿的染色体异常中的应用价值。方法应用染色体核型分析联合MLPA技术对104例中孕期B超提示先天性心脏畸形胎儿进行染色体数目和结构异常检测。对检出的染色体异常，进一步通过染色体微阵列分析（chromosomal microarray analysis，CMA）予以验证。结果染色体G显带核型分析与MLPA检测结果显示，在104例先天性心脏畸形胎儿羊水标本中，检出19例染色体异常，异常检出率为18％。93例心脏畸形胎儿的羊水标本进行CMA检测，共检出14例染色体异常，其中10例异常为已知的致病性拷贝数变异（copy number variation，CNV），4例为临床意义未明的CNV。10例致病性CNV羊水标本的MLPA检测结果也显示相同的染色体异常，4例临床意义未明CNV的羊水标本的MLPA检测结果仅1例检出异常。结论染色体G显带核型分析联合MLPA技术是一种快速、经济、有效的检测先天性心脏畸形胎儿染色体异常的方法。

应用多重连接依赖探针扩增技术快速检测胎儿染色体非整倍体异常

目的探讨多重连接依赖探针扩增（multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA）技术在常见染色体非整倍体异常检测及其在产前诊断中的应用价值。方法应用MLPA技术检测561份产前诊断样本和20例已知染色体异倍体标本，所有样本均进行常规染色体核型分析，比较MLPA结果和染色体核型分析结果，评价MLPA技术的临床符合率。结果MLPA技术能够在48h内出具检测结果，共检测出38例染色体异倍体，包括20例21-三体，10例18-三体，1例13-三体，4例Turner综合征，1例Klinefelter综合征，1例超雄综合征，1例48，XYY，＋18双三体综合征。MLPA结果与染色体核型结果一致，检测结果100％准确。在561份产前诊断样本中，有550份样本的MLPA分析结果和细胞染色体核型的结果一致，临床符合率达到98．04％。结论MLPA技术具有快速、简单、稳定等优点，可检测常见非整倍体异常，能作为产前诊断的可靠方法，具有临床实际应用价值。

应用多重连接依赖探针扩增和微阵列比较基因组杂交技术检测不明原因智力障碍患儿

目的应用多重连接依赖探针扩增(MLPA)技术和微阵列比较基因组杂交(aCGH)技术检测不明原因智力障碍患儿。方法针对临床上经过常规检查、遗传代谢病氨基酸和酰基肉碱谱分析、外周血染色体核型等未见明显异常的精神发育迟缓(智力评分70分)患儿,通过MLPA技术及aCGH技术对患儿进行检测。结果经过SALSA MLPA P245 Kit染色体微缺失检测试剂盒检测,提示MECP2/Xq28复制。对患儿的基因组DNA进行aCGH检测,提示CNV重复。经过两种技术,患儿诊断为智力障碍,病因为MECP2基因复制引起。结论应用MLPA技术联合aCGH技术可诊断不明原因智力障碍患儿。

甲基化特异性多重连接依赖探针扩增技术在胎盘甲基化研究中的应用

目的探讨甲基化特异性多重连接依赖探针扩增技术（methylation—specific multiplex ligation-dependent probe amplification，MS-MLPA）在胎盘甲基化研究中的可行性。方法应用MS-MI。PA及亚硫酸氢盐测序两种方法对9个正常整倍体胎盘样本及13名非孕妇女外周血进行甲基化检测，并计算候选的CG1149、HLCS、CG1113、ACTB4个基因的甲基化率。结果在13名非孕妇女的外周血标本中，当消化内参完全消化时，ACTB基因的甲基化率波动于0～0．1之间，0．1为MS-MLPA检测甲基化率的截断值；在9个胎盘组织样本中，MS-MLPA与亚硫酸氢盐测序方法所测得的HLCS、CGH13、CG1149和ACTB4个基因的甲基化率结果一致。结论MS-MLPA检测甲基化率结果可靠，可代替亚硫酸氢盐测序用于胎盘的甲基化研究。

应用免疫组化染色联合多重连接依赖探针扩增技术诊断假肥大型肌营养不良症

目的探讨应用免疫组化染色联合多重连接依赖探针扩增技术(Multiplex ligation-dependent probe amplification,MLPA)诊断假肥大型肌营养不良症的应用价值及意义。方法应用针吸型活检术取276例假肥大型肌营养不良症患者(212例DMD,64例BMD)的肌组织,采用免疫组化染色技术检测抗肌营养不良蛋白,以2例正常人的肌细胞作为以照。同时应用多重连接依赖探针扩增技术对患者的DMD基因的缺失/重复突变进行突变筛查。结果正常人肌细胞膜上抗肌萎缩蛋白染色阳性,可见沿肌细胞膜分布完整的棕色条带;DMD患者肌膜染色阴性,肌细胞膜完全不显色;BMD患者染色弱阳性,可见沿肌细胞膜分布的间断斑片状棕色带。结论 276例DMD患儿样品经多重连接依赖探针扩增技术分析,其中165例由缺失突变所致,另111测未检测到缺失突变,运用此两种方法综合诊断有助于假肥大型肌营养不良症的诊断和鉴别。

联合应用高分辨率熔解曲线和多重连接依赖探针扩增技术对PAH基因突变筛查研究

目的联合应用高分辨率熔解曲线（highresolutionmelting，HRM）和多重连接依赖探针扩增（multiplexligation—dependentprobeamplification，MLPA）技术检测苯丙酮尿症（phenylketonuria，PKU）患者基因突变，并探讨两种技术联合运用对于突变筛查的价值。方法采用HRM和MLPA技术对26例临床诊断为PKU的患者苯丙氨酸羟化酶基因（phenylalaninehydroxylase，PAH）进行检测，并通过测序验证；针对未报道的基因改变进行聚合酶链反应一限制性片段长度多态性分析。结果在52个等位基因中检测到44个突变等位基因（共21种不同突变），包括第4外显子拷贝数的增加，总检出率达84．62％（44／52），其中C．584—585insA和IVSl0＋1G〉T突变在国内外未见报道。此外，R243Q（25％）突变为中国最常见的突变种类。结论应用HRM和MLPA技术相对提高了PAH基因突变筛查的检出率，检测结果丰富了基因突变数据库，并为临床诊断与产前诊断提供实验室依据。

高通量红细胞血型基因分型的多重连接依赖的探针扩增技术在一例抗Di^a新生儿溶血病诊断中的应用

目的运用高通量红细胞血型基因的多重连接依赖的探针扩增技术(multiplex ligation-dependent probe amplification,MLPA)辅助诊断一例罕见的由抗Di^a导致的严重核黄疸新生儿溶血病。方法运用传统的血型血清学方法对导致新生儿溶血病相关红细胞血型抗体进行鉴定,运用MLPA对患儿及其父母的超过40种红细胞血型抗原进行基因分型,对鉴定的抗体进行效价分析。结果血型血清学检测表明患儿体内含有针对某种低频抗原的抗体,MLPA基因分析结果提示母婴红细胞MNS血型系统及Diego血型系统抗原不匹配,可能存在抗N或抗Di^a,经进一步的血型血清学检测,证实母亲及患儿血清中存在抗Di^a,并且其母亲血清抗Di^a效价为1:32。结论抗Di^a可引起包括核黄疸在内的严重新生儿溶血病;高通量红细胞血型基因分型的MLPA技术能够协助并有效解决临床疑难样本稀有血型鉴定;针对国人的Di^a阳性的试剂红细胞应该常规应用于日常的抗体筛查工作中。

基于多重连接探针扩增技术的食品中六重过敏原成分检测

基于多重连接探针扩增(multiplex ligation-dependent probe amplification,MLPA)技术建立了一种六重过敏原成分检测方法,可实现食品中大豆、芝麻、花生、杏仁、榛子和核桃6种成分的同时检测。选取多拷贝ITS基因为靶标基因,设计并合成6组特异性杂交探针。探针经杂交、连接和聚合酶链式反应得到扩增片段,经毛细管电泳分析扩增片段大小可明确区分6种过敏原成分。该体系经20余种相关植物、动物及微生物DNA验证显示其特异性良好,经模拟参考样品验证其检出限为5 mg/kg。30份不同种类市售食品MLPA检测结果表明,该方法性能满足实际样品的过敏原的多重检测。因此,本研究建立的基于MLPA技术的六重过敏原检测方法特异性强、灵敏度高,能够为食品过敏原评估、标识管理和风险控制提供技术支撑。

多重连接依赖的探针扩增(MLPA)技术在自然流产样本检测中的应用

目的评价多重连接依赖的探针扩增(multiplex ligation-dependent probe amplification,MLPA)技术在自然流产组织遗传学分析中的临床应用价值。方法采用常规染色体核型分析和MLPA产前非整倍体筛查试剂盒对12例胚停后行清宫术的绒毛组织样本进行检测。结果核型分析12例绒毛样本仅11例得到结果,而MLPA成功分析12例样本。两种方法均成功分析的样本中,7例为非整倍体,1例为结构异常。结构异常的样本核型分析无法定位,由MLPA法检测明确拷贝数异常的区间。1例非整倍体样本核型分析无法明确多余的染色体来源,MLPA检测明确了其来源。结论 MLPA技术在流产病因检测上可以作为核型分析的重要补充。

多重连接依赖式探针扩增和变性高效液相色谱法检测Duchenne型肌营养不良症患者DMD基因的缺失/重复突变

目的比较多重连接依赖式探针扩增法（MLPA）和变性高效液相色谱法（DHPLC）检测Duchenne型肌营养不良症（DMD）患者DMD基因缺失／重复突变的效果。方法选择2004年10月-2005年10月在我院确诊的22位无关DMD男性患者，采用MLPA法对经DHPLC技术检测过的患者的DMD基因的缺失／重复突变进行突变筛查，同时对先证者的23位女性亲属进行基因的缺失／重复突变检测。结果DHPLC技术和MLPA法均检测出11位先证者具有DMD基因缺失突变，3位先证者具有DMD重复突变；MLPA法除能更精确地检测出上述突变外，还检测出DHPLC法未检测出的两位患者的DMD基因存在缺失突变。16个家系中18位可能的女性携带者中，12位经检测为缺失／重复突变携带者。两种方法均未检测到6位先证者及其女性亲属DMD基因具有缺失／重复突变。结论与DHPLC法和传统的多重PCR方法相比，MLPA法检测DMD基因的缺失／重复突变位置更为准确。MLPA法可用于检测先证者及家系中女性携带者DMD基因的缺失／重复突变。

多重连接依赖的探针扩增(MLPA)技术在广州地区RhD阴性献血者基因分型研究中的应用

目的采用新型Rh血型系统的MLPA检测试剂盒,对广州地区收集的200名RhD阴性献血者进行基因分型。方法采用传统的血型血清学方法,对RhD阴性献血者进行RhD表型鉴定。提取基因组DNA,采用MLPA检测试剂盒对收集的200名RhD阴性献血者进行RHD基因分型。对于不能明确分型的标本,进行RHD基因直接测序分析。结果在200名RhD阴性献血者中,采用MLPA方法对196名进行了明确的基因分型。其中,127名为RHD基因缺失(占63.5%);仅检测到包含RHD1227A突变的DEL等位基因有41例,其中38例包含杂合等位基因,其余3例包含纯合等位基因;仅检测到RHD(1-2)-CE(3-9)-D(10)等位基因的有23例,其中19例杂合,4例纯合;3例包含2种不同的RHD等位基因(1条为RHD(1-2)-CE(3-9)-D(10),另1条为RHD1227A);其余2例分别包含杂合的DFR-2(RHD-CE(4)-D)及弱D15型(RHD845A)等位基因。在其余4例直接测序分析的标本中,2例包含杂合的RHD711delC突变;1例1条等位基因为MLPA检测到的包含RHD1227A突变的DEL等位基因,另1条为包含711delC突变的RHD等位基因;其余1例的1条等位基因为MLPA检测到的RHD(1-2)-CE(3-9)-D(10),另1条为包含新突变的RHD等位基因(1154G>T,385Gly>Val)。结论 MLPA检测试剂盒是适用于中国人群的1种快速、有效的高通量基因分型方法,能够对中国人群常见的各种RHD基因型进行明确分型,适用于参比实验室相关疑难标本的基因分型检测。也可应用于中国人群常见的Del表型检测,使Del表型患者不必再输注RhD阴性血液,节约稀有的RhD阴性血液资源。

多重连接依赖的探针扩增技术检测中国人遗传性非息肉病性结直肠癌错配修复基因大片段缺失

目的 了解中国人遗传性非息肉病性结直肠癌（HNPCC）家系hMSH2和hMLH1基因大片段缺失特点。方法 采用多重连接依赖的探针扩增（MLPA）技术和GeneMapper分析技术检测17个HNPCC家系先证者hMSH2和hMLH1基因种系大片段缺失。结果 在3个家系中分别发现hMSH2基因第8外显子、1～6外显子和1～7外显子3种大片段缺失类型，未发现hMLH1基因大片段缺失。大片段缺失占hMSH2和hMLH1基因总种系病理性突变的19％。结论 中国人HNPCC错配修复（MMR）基因大片段缺失发生率较高，hMSH2基因缺失可能更为常见。在分子遗传学检测中有必要开展MMR基因大片段缺失的检测。

多重连接探针扩增技术鉴别半夏及其常见混伪品

目的基于多重连接探针扩增技术(MLPA)建立一种中药材半夏与其常见伪品虎掌、滴水珠的分子鉴定方法,为半夏药材质量控制提供依据。方法从Genbank数据库下载半夏属核基因组内转录间隔区(ITS)序列,利用MEGA 6.05版软件进行序列比对,依据半夏、虎掌及滴水珠ITS序列中的单核苷酸多态性(SNP)位点设计物种特异性MLPA探针,MLPA反应后采用熔解曲线法对扩增产物进行分析。结果半夏、虎掌和滴水珠样品DNA与物种特异性MLPA探针可分别产生位于84.84,82.76及80.14℃的单一熔解峰,表明探针具有良好特异性;构建的探针体系可对0.1 ng模板DNA进行检测,并可有效检出半夏中掺混1%的虎掌或滴水珠样品。对市场收集样品进行检测,鉴别结果准确,灵敏度高。结论该研究建立的多重连接探针扩增方法可准确鉴别半夏和虎掌、滴水珠,具有特异性强、灵敏度高等特点,可为半夏药材质量控制提供技术支持。