多重连接探针扩增技术在食品安全检测中的应用研究进展

阐述了多重连接探针扩增(MLPA)技术在食品过敏原检测、食品掺假、食源性致病菌和转基因食品检测中的应用现状,并对该技术在食品安全检测领域的发展趋势和挑战进行展望。

基于多重连接依赖探针扩增(MLPA)技术检测加工食品中过敏原成分

该研究基于多重连接探针扩增技术(Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification,MLPA)同时检测开心果、巴西坚果、芹菜、麸质、夏威夷果、芝麻、榛子、大豆、花生、葵花籽、核桃、腰果、杏仁、芥末等14种植物源性的过敏原成分,针对ITS序列设计特异性杂交探针,样本核酸经95℃变性后,与探针进行特异性结合,经连接和PCR扩增反应得到不同大小的目标片段,通过毛细管电泳分析目标片段的有无来判断是否含有待测过敏原成分。利用混合探针体系检测单一模板只能扩增出单一扩增峰,表明探针具有高特异性,检测限结果表明,MLPA扩增最低可检出的DNA质量浓度为1ng/μL。通过20份实际样本的检测,证明该研究基于MLPA建立的加工食品中过敏原成分的检测方法,具有特异性强,灵敏度高的特点,可以应用于食品安全监管工作。

基于多重连接探针扩增技术的食品中六重过敏原成分检测

基于多重连接探针扩增(multiplex ligation-dependent probe amplification,MLPA)技术建立了一种六重过敏原成分检测方法,可实现食品中大豆、芝麻、花生、杏仁、榛子和核桃6种成分的同时检测。选取多拷贝ITS基因为靶标基因,设计并合成6组特异性杂交探针。探针经杂交、连接和聚合酶链式反应得到扩增片段,经毛细管电泳分析扩增片段大小可明确区分6种过敏原成分。该体系经20余种相关植物、动物及微生物DNA验证显示其特异性良好,经模拟参考样品验证其检出限为5 mg/kg。30份不同种类市售食品MLPA检测结果表明,该方法性能满足实际样品的过敏原的多重检测。因此,本研究建立的基于MLPA技术的六重过敏原检测方法特异性强、灵敏度高,能够为食品过敏原评估、标识管理和风险控制提供技术支撑。

多重连接探针扩增技术鉴别半夏及其常见混伪品

目的基于多重连接探针扩增技术(MLPA)建立一种中药材半夏与其常见伪品虎掌、滴水珠的分子鉴定方法,为半夏药材质量控制提供依据。方法从Genbank数据库下载半夏属核基因组内转录间隔区(ITS)序列,利用MEGA 6.05版软件进行序列比对,依据半夏、虎掌及滴水珠ITS序列中的单核苷酸多态性(SNP)位点设计物种特异性MLPA探针,MLPA反应后采用熔解曲线法对扩增产物进行分析。结果半夏、虎掌和滴水珠样品DNA与物种特异性MLPA探针可分别产生位于84.84,82.76及80.14℃的单一熔解峰,表明探针具有良好特异性;构建的探针体系可对0.1 ng模板DNA进行检测,并可有效检出半夏中掺混1%的虎掌或滴水珠样品。对市场收集样品进行检测,鉴别结果准确,灵敏度高。结论该研究建立的多重连接探针扩增方法可准确鉴别半夏和虎掌、滴水珠,具有特异性强、灵敏度高等特点,可为半夏药材质量控制提供技术支持。

多重连接依赖的探针扩增(MLPA)技术在自然流产样本检测中的应用

目的评价多重连接依赖的探针扩增(multiplex ligation-dependent probe amplification,MLPA)技术在自然流产组织遗传学分析中的临床应用价值。方法采用常规染色体核型分析和MLPA产前非整倍体筛查试剂盒对12例胚停后行清宫术的绒毛组织样本进行检测。结果核型分析12例绒毛样本仅11例得到结果,而MLPA成功分析12例样本。两种方法均成功分析的样本中,7例为非整倍体,1例为结构异常。结构异常的样本核型分析无法定位,由MLPA法检测明确拷贝数异常的区间。1例非整倍体样本核型分析无法明确多余的染色体来源,MLPA检测明确了其来源。结论 MLPA技术在流产病因检测上可以作为核型分析的重要补充。

多重连接依赖的探针扩增(MLPA)技术在广州地区RhD阴性献血者基因分型研究中的应用

目的采用新型Rh血型系统的MLPA检测试剂盒,对广州地区收集的200名RhD阴性献血者进行基因分型。方法采用传统的血型血清学方法,对RhD阴性献血者进行RhD表型鉴定。提取基因组DNA,采用MLPA检测试剂盒对收集的200名RhD阴性献血者进行RHD基因分型。对于不能明确分型的标本,进行RHD基因直接测序分析。结果在200名RhD阴性献血者中,采用MLPA方法对196名进行了明确的基因分型。其中,127名为RHD基因缺失(占63.5%);仅检测到包含RHD1227A突变的DEL等位基因有41例,其中38例包含杂合等位基因,其余3例包含纯合等位基因;仅检测到RHD(1-2)-CE(3-9)-D(10)等位基因的有23例,其中19例杂合,4例纯合;3例包含2种不同的RHD等位基因(1条为RHD(1-2)-CE(3-9)-D(10),另1条为RHD1227A);其余2例分别包含杂合的DFR-2(RHD-CE(4)-D)及弱D15型(RHD845A)等位基因。在其余4例直接测序分析的标本中,2例包含杂合的RHD711delC突变;1例1条等位基因为MLPA检测到的包含RHD1227A突变的DEL等位基因,另1条为包含711delC突变的RHD等位基因;其余1例的1条等位基因为MLPA检测到的RHD(1-2)-CE(3-9)-D(10),另1条为包含新突变的RHD等位基因(1154G>T,385Gly>Val)。结论 MLPA检测试剂盒是适用于中国人群的1种快速、有效的高通量基因分型方法,能够对中国人群常见的各种RHD基因型进行明确分型,适用于参比实验室相关疑难标本的基因分型检测。也可应用于中国人群常见的Del表型检测,使Del表型患者不必再输注RhD阴性血液,节约稀有的RhD阴性血液资源。

自然流产和超声检查提示脏器结构异常胎儿的染色体高通量连接探针扩增技术检测分析

目的分析自然流产和超声检查提示脏器结构异常胎儿的染色体高通量连接探针扩增技术(HLPA)检测结果。方法1183例自然流产或超声检查提示胎儿心脏畸形、淋巴水囊瘤或多发畸形等结构异常的孕妇,孕早期孕妇留取胎儿绒毛组织标本,孕中晚期孕妇取胎儿肌肉组织标本。1183例份标本中372例份(HLPA组)采用HLPA检测染色体,811例份(对照组)采用低深度全基因组测序拷贝数变异(CNV-seq)技术检测染色体,对比分析两组胎儿染色体异常情况。结果HLPA组、对照组胎儿检测失败率分别为1.61%、1.48%(P>0.05)。HLPA组、对照组胎儿染色体异常检出率分别为60.11%、49.94%(P>0.05)。HLPA组中染色体数目异常204例、染色体结构异常16例,对照组中染色体数目异常369例、染色体结构异常30例,HLPA组、对照组染色体数目异常、染色体结构异常情况比较,P均>0.05。结论HLPA对自然流产或超声检查显示心脏、淋巴水囊瘤或多发畸形等结构异常胎儿染色体异常的诊断效能与CNV-seq技术相当,可用于胎儿的染色体诊断。

高通量红细胞血型基因分型的多重连接依赖的探针扩增技术在一例抗Di^a新生儿溶血病诊断中的应用

目的运用高通量红细胞血型基因的多重连接依赖的探针扩增技术(multiplex ligation-dependent probe amplification,MLPA)辅助诊断一例罕见的由抗Di^a导致的严重核黄疸新生儿溶血病。方法运用传统的血型血清学方法对导致新生儿溶血病相关红细胞血型抗体进行鉴定,运用MLPA对患儿及其父母的超过40种红细胞血型抗原进行基因分型,对鉴定的抗体进行效价分析。结果血型血清学检测表明患儿体内含有针对某种低频抗原的抗体,MLPA基因分析结果提示母婴红细胞MNS血型系统及Diego血型系统抗原不匹配,可能存在抗N或抗Di^a,经进一步的血型血清学检测,证实母亲及患儿血清中存在抗Di^a,并且其母亲血清抗Di^a效价为1:32。结论抗Di^a可引起包括核黄疸在内的严重新生儿溶血病;高通量红细胞血型基因分型的MLPA技术能够协助并有效解决临床疑难样本稀有血型鉴定;针对国人的Di^a阳性的试剂红细胞应该常规应用于日常的抗体筛查工作中。

多重连接依赖的探针扩增技术检测中国人遗传性非息肉病性结直肠癌错配修复基因大片段缺失

目的 了解中国人遗传性非息肉病性结直肠癌（HNPCC）家系hMSH2和hMLH1基因大片段缺失特点。方法 采用多重连接依赖的探针扩增（MLPA）技术和GeneMapper分析技术检测17个HNPCC家系先证者hMSH2和hMLH1基因种系大片段缺失。结果 在3个家系中分别发现hMSH2基因第8外显子、1～6外显子和1～7外显子3种大片段缺失类型，未发现hMLH1基因大片段缺失。大片段缺失占hMSH2和hMLH1基因总种系病理性突变的19％。结论 中国人HNPCC错配修复（MMR）基因大片段缺失发生率较高，hMSH2基因缺失可能更为常见。在分子遗传学检测中有必要开展MMR基因大片段缺失的检测。

多重连接探针扩增技术检测常见线粒体疾病

目的探讨多重连接探针扩增技术(multiplex ligation-dependent probe amplification,MLPA)用于常见线粒体疾病基因检测的可行性。方法收集2010年5月至2012年8月北京协和医院281例可疑线粒体异常病例,包括神经科存在神经系统损伤的患者233例及眼科疑诊Leber遗传性视神经病变的患者48例,运用MLPA法对常见线粒体疾病突变位点进行检测,并使用线粒体基因序列测定方法进行验证。结果 281例标本中共38例检测到线粒体基因突变,总检出率为13.5%。眼科48例标本中,3460G>A、11778G>A和14484T>C3种突变共检测到19例,检出率为39.6%;神经科233例标本中,3243A>G、8344A>G、8993T>G和大片段缺失共检测到19例,检出率为8.2%。除1例大片段缺失暂无PCR测序验证外,其余MLPA结果均经序列测定验证为相符。结论 MLPA法是一种可行的快速、准确、简便的基因诊断方法,可作为筛查常见线粒体疾病的检测工具,为临床诊断和治疗提供依据。

磁珠法DNA提取技术在多重连接依赖探针扩增检测中的应用

目的探讨磁珠法DNA提取技术在多重连接依赖探针扩增(MLPA)检测样品制备中的应用价值。方法分别用半自动磁珠法和手工离心柱法提取1例21-羟化酶缺乏症患者和16例健康男性外周血、16例羊水细胞标本的基因组DNA,用MLPA法检测CYP21A2基因拷贝数,比较两种方法制备DNA的质量及MLPA结果。用磁珠法提取200例羊水细胞DNA,MLPA法检测染色体非整倍体异常表达情况。结果磁珠法提取外周血DNA的浓度和总量均高于离心柱法(P<0.05)。两种方法提取羊水DNA浓度相当,磁珠法所得总量较高(P<0.05)。21-羟化酶缺乏症患者CYP21A2基因拷贝数比值接近0.5。200例羊水标本中检出正常二倍体188例,21三体9例,18三体2例,特纳(Turner)综合征(45,X)1例,与核型分析结果一致。结论磁珠法制备的外周血和羊水细胞DNA适用于MLPA检测,具有较高的应用价值。

多重连接探针扩增技术的研究进展及其应用

多重连接探针扩增技术（multiplex ligation-dependentprobe amplification,MLPA）是一种高通量、针对待测核酸中靶序列进行定性和定量分析的新技术。该技术仅需20ng/μlDNA,即可通过简单的杂合、连接、PCR扩增及电泳步骤,在同一反应管中对四十多个不同的靶基因进行检测和定量分析。这一技术最先于2002年由荷兰的Schouten等[1]报道。如今短短几年中,该技术已被欧洲、亚洲等几十个实验室采用。迄今为止,已有150多篇不同领域采用该技术方法的报道在重要刊物上发表。

多重连接探针扩增技术在临床病原体检测中的应用

真菌等临床病原体的诊断、基因分型和耐药性检测对于临床诊治十分重要。多重连接探针扩增是一个可以同时定量检测多个基因序列的,简单、有效、快速的方法。其步骤包括待测DNA变性、半探针与待测DNA杂交,半探针的连接、PCR法扩增、凝胶电泳或者毛细管电泳鉴定扩增产物。MLPA已经在临床微生物诊断和研究中有了一定的应用,虽然尚处于起步阶段,但因其操作简便,反应快速,高通量,高敏感性和特异性的特点,拥有良好的应用前景。

多重探针连接依赖式扩增技术在常见非整倍体染色体异常快速产前诊断中的应用研究——附407例检测报告

目的:评估现有多重探针连接依赖式扩增技术(MLPA)方案作为常见非整倍体染色体异常的快速产前诊断方法的有效性。方法:对407例羊水样本进行MLPA试验及羊水细胞染色体G显带核型分析,所有样本进行MLPA获得的扩增产物信息经GenemarkerV 1.80软件进行定量分析,观察样本DNA拷贝数的变化,并将所得结果与染色体核型分析结果进行比较,计算其检测的敏感度、特异度及阳性预测值。结果:407例样本中,应用MLPA技术发现正常样本397例及染色体非整倍体异常样本9例。异常结果包括21三体6例、18三体1例、X三体1例及X-单体1例,与羊水细胞培养染色体G显带核型分析结果一致。MLPA检测出的1例X单体疑似样本,经核型分析结果验证为正常核型。MLPA检测非整倍体性染色体异常的敏感度为100%,特异度为99.75%,阳性预测值为90%。结论:MLPA分析技术作为一项快速产前诊断技术,具有良好的特异性和应用价值。

多重连接依赖式探针扩增技术在遗传病分子诊断中的应用

多重连接依赖式探针扩增技术(multiplex ligation-dependent probe amplification,MLPA)是近年发展起来的基因检测新技术,可通过简单的杂交(hybridization)、连接(ligation)及PCR(polymerase chain reaction)扩增反应于同一管内同时检测出多达40种基因组DNA或RNA拷贝数变化。凭借其操作简单、高通量、稳定可靠等特点,该技术在遗传病的分子诊断等领域的应用已得到迅速的推广,本文就MLPA技术的原理、特点以及在遗传病分子诊断中的实际应用等作一综述。

多重连接探针扩增-高分辨熔解法鉴别鸡血藤及其常见混伪品

目的采用分子生物学技术鉴别鸡血藤及其常见3种混伪品。方法根据4个物种核基因组内转录间隔区2(ITS2)序列差异设计特异性探针,结合运用多重连接探针扩增(MLPA)技术与高分辨熔解(HRM)曲线技术,根据特异性探针熔解温度(T m)差异鉴别鸡血藤及其常见混伪品大血藤、白花油麻藤、香花鸡血藤。结果4个物种特异性探针T m值分别为:鸡血藤(87.0±0.2)℃、大血藤(82.8±0.2)℃、白花油麻藤(85.4±0.2)℃、香花鸡血藤(80.1±0.2)℃。探针特异性考察中,交叉反应与空白组均未产生熔解峰,表明探针具有良好特异性。构建的方法可用于1.0 ng模板DNA的检测,并可有效检出鸡血藤中掺混5%大血藤、白花油麻藤或香花鸡血藤。结论基于MLPA-HRM技术建立的鸡血藤及其混伪品鉴别方法灵敏度高,特异性强,稳定性好,可有效解决市场上鸡血藤药材植物来源复杂、混伪品难以鉴别的问题。

用多重连接依赖探针扩增技术进行Y染色体微缺失的产前诊断

目的探讨多重连接依赖探针扩增(multiplex ligation-dependent probe amplification,MLPA)技术在Y染色体微缺失产前诊断中的应用价值。方法收集4例染色体为46,XYqh-和1例染色体46,X,+mar的羊水样本,用MLPA P095染色体非整倍体检测试剂盒和Y染色体微缺失检测试剂盒分别对5例羊水样本进行检测。结果 4例Yqh-染色体的羊水样本的Y染色体信号值均在正常范围内,即Y染色体不存在微缺失,1例小Mar染色体为Y染色体;进一步用Y染色体探针检测结果示,Y染色体上AZFb和c区存在大片段缺失。结论用MLPA技术对疑似Y染色体微缺失的病例进行检测,可判断是否存在Y染色体生精功能区域的缺失,为产前诊断提供分子遗传学依据。

多重探针连接依赖式扩增技术检测矮小儿童生长激素受体基因分析

目的：探讨矮小儿童生长激素受体（GHR）基因的变异情况。方法：选择矮小儿童96例,其中生长激素缺乏症（GHD）67例、特发性矮小（ISS）29例,另选择生长发育正常儿童23例,采集外周血,应用多重探针连接依赖式扩增（MLPA）技术检测GHR基因10个外显子,并分析比较GHR外显子的基因型及等位基因频率分布情况。结果：GHR基因外显子1～10均未发现信号升高,外显子1、2和4～10也未发现信号降低或缺失等异常情况;GHR外显子3信号降低和缺失的发生率在GHD组分别为34.3%、1.5%,在ISS组为17.2%、3.4%,在正常对照组为26.1%、8.7%;3组儿童GHR外显子3的3种基因型及等位基因频率的差异均具有统计学意义。结论 GHR基因外显子3在矮小及正常儿童中均存在多态性,GHR基因对身高的影响及其生物学功能有待进一步探讨。

多重连接探针扩增技术鉴别酸枣仁及混伪品的研究

目的:针对市场上出现的酸枣仁药材掺假现象,开发一种快速鉴别酸枣仁药材是否含有掺伪品的方法。方法:基于多重连接探针扩增技术(MLPA),针对酸枣仁与理枣仁ITS2序列205位点处A/G变异,以及枳椇子170位点分别设计酸枣仁、理枣仁与枳椇子的MLPA探针,MLPA扩增后依据熔解曲线Tm值差异来进行鉴别,并考察了特异性、敏感度、掺伪比等内容,以验证该方法的可行性。结果:酸枣仁、理枣仁和枳椇子分别与特异性探针在85.56℃、87.26℃和83.93℃处出现单一扩增峰,表明探针特异性好;通过不断稀释DNA模板,仍旧可以检测出0.05 ng酸枣仁DNA量,同样酸枣仁中掺入10%的伪品均可被有效检出,表明该方法具有高灵敏度。结论:该研究建立的酸枣仁药材及其混伪品鉴别方法具有特异性强、灵敏度高的特点,对于解决酸枣仁药材掺伪问题具有良好的推广应用价值。

猪猝死症4种重要病原多重连接探针扩增鉴别检测技术的建立与应用

为了快速检测引起猪猝死的病原,本研究针对临床引起猪猝死症的4种疾病病原(猪尼帕病毒、非洲猪瘟病毒、猪产气荚膜梭菌和猪胸膜肺炎放线杆菌)分别设计特异性探针,建立了同时检测这4种病原的多重连接探针扩增技术(MLPA)。对扩增产物进行毛细管电泳分析,结果显示该方法,探针之间没有交叉反应,特异性强。对不同病原核酸的最低检测限可以达到140拷贝μ/L～370拷贝μ/L,敏感性较高。应用该MLPA方法对129份临床样品进行检测,并与国家相关标准进行比较。结果显示,两种方法的符合率为100%,且该方法检测猪产气荚膜梭菌和猪胸膜肺炎放线杆菌的特异性和敏感性均达到100%,Kappa值均为1。该方法的检测结果与国家或行业标准PCR的检测结果一致性较高,且克服了后者无法同时进行多重检测的缺点,最多可以同时检测45种病原,对于复杂症候群的快速和高通量检测具有重要临床意义。该方法可推广到其它多重病原体的检测中,显示出广阔的应用前景。