影响多重PCR扩增效果的因素

不同循环参数、PCR缓冲液及反应体积的对比实验表明,循环参数中退火温度和时间、延伸时间及PCR缓冲液的成分影响多重PCR的扩增效果,而反应体积、循环次数对其扩增效果影响较小。

多次退火环状循环扩增和多重置换扩增技术在β地中海贫血基因变异诊断效率中的差异分析

目的:探讨最适的β地中海贫血疾病HBB基因单细胞全基因组扩增方法。方法:60份β地中海贫血成纤维细胞(HBB基因变异位点CD17和IVSⅡ654)和48份废弃胚胎单个卵裂球进行多次退火环状循环扩增法(MALBAC)和多重置换扩增法(MDA)扩增及高通量测序,比较位点检测率、等位基因脱扣(ADO)率及扩增均一度等。结果:β地中海贫血疾病HBB基因MALBAC技术位点检测率(100%)高于MDA技术(96.3%);CD17和IVSⅡ654的ADO率MALBAC技术为9.09%和0.00%,MDA技术为23.08%和19.23%;对编码人β-珠蛋白的HBB基因附近60个SNP位点检测显示MALBAC技术ADO率为12.04%,MDA技术为21.25%;MALBAC技术拷贝数变异检测变异系数为0.13,MDA技术为0.15。结论:β地中海贫血单细胞诊断MALBAC法优于M D A法。

多次退火环状循环扩增联合高通量测序技术在体外受精胚胎无创检测非整倍体中的应用

为建立基于多次退火环状循环扩增联合高通量测序(multiple annealing and looping-based amplification cycles combined with next-generation sequencing,MALBAC-NGS)技术的体外授精胚胎非整倍体无创检测体系,本研究提前对非整倍体遗传缺陷胚胎进行筛查,收集在南宁市第二人民医院生殖中心接受体外受精-胚胎移植(In vitro fertilization embryo transfer,IVF-ET)的患者临床资料,比较了对照组(正常年龄)与观察组(高龄患者)的卵子数量、囊胚质量等数据,并分别运用MALBAC-NGS及传统胚胎植入前遗传学筛查(preimplantation genetic screening,PGS)技术对上述两组胚胎染色体进行筛查。研究结果表明,观察组获卵数、优质卵子比率及囊胚率显著低于对照组(P<0.05),两组间胚胎卵裂率无显著差异(P>0.05)。对照组及观察组间胚胎活检样本与培养液样本MLABAC扩增成功率无显著差异(P>0.05);经MALBAC-NGS检测,对照组及观察组组内胚胎活检样本与培养液样本染色体拷贝数检测结果无显著差异(P>0.05)。结果证实MALBAC-NGS技术可利用胚胎培养液进行染色体拷贝数检测,具备成为临床检测标准的潜力。

多次退火环状循环扩增技术在单细胞水平诊断脊髓性肌萎缩症的应用评估

目的:应用并评价多次退火环状循环扩增(multiple annealing and looping-based amplification cycles,MALBAC)技术在单细胞水平诊断脊髓性肌萎缩症(spinal muscular atrophy,SMA)基因变异的效率。方法:收集SMN1基因7号外显子纯合缺失、正常皮肤成纤维细胞以及废弃胚胎单个卵裂球细胞,分别使用MALBAC和多重链置换扩增(multiple displacement amplification,MDA)方法进行全基因组扩增(WGA)。Sanger测序检测SMN1及SMN2序列,并对3个微卫星位点进行连锁分析。结果:2种扩增技术的总扩增成功率、等位基因脱扣(ADO)率无统计学差异(P>0.05);MALBAC组诊断准确率为91.7%(67/73),低于MDA组的96.1%(73/76)(P<0.05)。结论:针对SMA疾病开展单细胞水平遗传学诊断,传统MDA方法略优于MALBAC全基因组扩增技术。

1例12号环状染色体的遗传学分析

目的探讨1例患有12号环状染色体患者的临床表型和遗传学特征。方法收集1例12号环状染色体患者的症状、体征和影像学检查等临床资料,应用染色体常规G显带技术(chromosome G banding technique)、染色体微阵列分析(chromosomal microarray analysis,CMA)、荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization,FISH)和多重连接探针扩增技术(multiplex ligation-dependent probe amplification,MLPA)进行分析。结果本例12号环状染色体患者流产2次,其他临床体征正常;性激素6项正常;抗苗缪勒管激素0.57 ng/m L,低于参考区间;腹部B超未见异常;该患者核型为mos 46,XX,r(12)(p13q24)[96]/45,XX,-12 [3]/46,XX,dic r(12; 12)(p13q24)[1]; CMA结果显示12号染色体在12q24.33区域存在小片段的缺失,缺失区域为良性CNVs; FISH检查结果显示12号环状染色体长臂末端缺失; MLPA检查结果显示12号长臂末端亚端粒缺失。结论本例环状12号染色体临床体征正常,环状染色体的临床表现与核型嵌合比例及12q末端缺失的多少相关,女性流产可能与r(12)的不稳定相关。

烟草RAPD反应体系的建立与优化研究

以烤烟品种为材料,研究了烟草RAPD分析过程中的影响因素,包括模板浓度、Mg2+、dNTP、引物、Taq酶、循环次数、退火温度等,建立了适于烟草RAPD分析的PCR反应体系:即在25μl反应体系中,模板用量为40ng;引物浓度为0.4μM;Mg2+浓度为2.5mM;dNTP浓度为0.2mM;TaqDNA聚合酶用量为1U。扩增程序为94℃预变性5min;然后94℃变性1min,38℃复性1min,72℃延伸1.5min,39个循环;最后72℃延伸5min。

组织中少量细胞的微卫星长度精细分析

微卫星是基因组上的特殊短重复序列,微卫星不稳定的程度与一些肿瘤的分型、治疗和预后相关。目前,微卫星长度变化的检测往往是基于大量细胞,检测灵敏度低。本文整合激光显微切割技术,基于多次退火环状循环扩增(multiple annealing and looping-based amplification cycles,MALBAC)的单细胞全基因组放大技术和毛细管电泳长度测量方法,经过关键技术点的改进,建立了一套针对组织中少量细胞的多微卫星位点检测方法。研究结果表明,基于技术改进,HE染色的组织细胞经激光显微切割分选后,可成功用MALBAC技术进行全基因组放大,并在多微卫星位点的检测上,获得了高度的准确性和重复性。利用所建立的方法,发现肠型胃癌早期病变组织-肠上皮化生(intestinal metaplasia,IM)的单个腺体内部出现多种长度变化的微卫星改变,说明该癌前病变组织中DNA错配修复系统已经出现问题。本方法所获得的全基因组放大产物,也可以用于外显子组测序和全基因组测序。另外,该方法适用于任何组织的少量细胞,甚至单细胞的多微卫星位点检测,以及全基因组的研究,为精细研究少量病变细胞的基因组特征以及组织异质性提供了有效的方法。

单染色体靶向富集方法的建立

靶向富集技术具有良好的均一性、特异性和灵敏性,只需较低的测序覆盖度即可满足后续的分析。该技术被广泛应用于特定位点重测序和染色体构象等研究。为了靶向富集测序文库中特定的染色体DNA片段,本研究以21号染色体为例,采用人胚肝二倍体细胞CCC-HEL-1建立了一种单染色体靶向富集方法。具体步骤如下:(1)首先将人正常核型二倍体细胞同步化到G2/M期,制备染色体悬液;然后流式分选出21号单染色体。(2)采用多重退火环形扩增技术(MALBAC)对21号染色体DNA进行扩增;用扩增的DNA产物构建文库。(3)利用体外转录合成、生物素标记的RNA探针与文库进行液相杂交,捕获并验证捕获效率。荧光定量PCR检测结果证明,特定的21号染色体呈上百倍的富集,而靶标文库则富集了近60倍。结果提示,特异单染色体靶向富集方法成功建立。该法不仅可实现任一单染色体的靶向富集,用于单条染色体功能组学研究,而且还可能用于查找特定疾病相关的染色体异常(如DNA突变、异位、重复及倒置等),具有一定的实用意义。

不同指征患者胚胎植入前非整倍体筛查的比较

目的通过对进行植入前遗传学筛查(PGS)患者的胚胎和染色体结果分析,比较不同PGS指征在胚胎染色体非整倍体的差异。方法收集2018年6月1日至2018年11月30日在西北妇女儿童医院生殖中心行PGS患者288例,胚胎培养囊胚期活检,PGS检测采用多次退火环状循环扩增技术-二代测序技术(MALBAC-NGS),比较不同年龄段、不同性别患者和不同PGS指征胚胎染色体非整倍体率。结果①PGS共活检288枚胚胎,最终有效检出结果的胚胎数为275枚。其中整倍体胚胎数目为141(51.27%),非整倍体胚胎数目为134(48.73%)。②在染色体异常的胚胎中以异常染色体数目为1条(42.54%)和2条(37.31%)最为常见。染色体异常的女性患者产生非整倍体胚胎数目为43个(59.72%),染色体异常的男性患者产生非整倍体胚胎数目为59个(49.17%),不同性别患者的整倍体率与非整倍体率比较无统计学差异(χ^2=2.01,P>0.05)。③随着女方年龄的增长,胚胎非整倍体率逐渐升高,≤27岁、28~30岁、31~33岁、34~36岁和≥37岁患者非整倍体胚胎数目分别为34个(43.04%)、43个(52.44%)、37个(59.68%)、10个(32.26%)、12个(57.14%)。然而,不同年龄女性患者的胚胎整倍体率与非整倍体率比较无统计学差异(χ^2=8.35,P>0.05)。④在不同PGS指征中,以相互易位(36.84%)和复发性流产(RSA,占18.60%)最为常见。相互易位、罗氏易位、倒位、非整倍体及衍生染色体患者产生的非整倍体胚胎数目分别为71个(67.72%)、8个(40.00%)、2个(66.67%)、11个(42.31%)和7个(77.78%);不良孕产史、反复种植失败、RSA患者产生的非整倍体胚胎数目分别为11个(39.29%)、2个(22.22%)、24个(45.28%);不同PGS指征患者的整倍体率与非整倍体率比较具有统计学差异(χ^2=23.94,P<0.05)。⑤胚胎染色体异常中11、13、14、22号染色体及性染色体异常发生率较高(分别占9.19%、10.95%、6.71%、6.01%、8.83%)。结论通过对PGS患者的染色体结果分析得出,随着年龄的增长,胚胎非整倍体率逐渐升高。在不同PGS指征中,以相互易位和RSA最为常见。平衡易位、倒位、衍生染色体等双亲染色体异常可能更易导致胚胎染色体非整倍体。染色体异常的胚胎中以异常染色体数目为1条和2条最为常见。染色体异常的女性患者胚胎非整倍体率较高。

MALBAC-NGS和array CGH检测染色体异常囊胚的结果比较

目的比较基因组杂交微阵列芯片(array CGH)与多次退火环状循环扩增-二代测序(MALBAC-NGS)两种方法进行胚胎植入前染色体筛查的结果差异。方法收集西北妇女儿童医院生殖中心行胚胎植入前遗传学筛查/诊断(PGS/PGD),并经array CGH(BlueGnome 24SureV3软件)检测异常的囊胚(共32枚),复苏培养后再次活检,通过MALBAC-NGS的方法进行胚胎染色体非整倍体筛查,比较两种不同检测方法的结果差异。结果32枚囊胚中,内细胞团与外胚层分别活检的有16枚,通过MALBAC-NGS的方法检测,内细胞团与外胚层检测结果完全一致的为14枚,一致率87.5%(14/16);2枚囊胚内细胞团与外胚层部分不一致,不一致率12.5%(2/16)。32枚囊胚中,两种方法检测结果完全一致的有7枚,一致率21.87%(7/32);array CGH法检测为染色体异常的囊胚中,其中有15枚囊胚MALBAC-NGS法检测为正常(46XN),array CGH的假阳性率46.88%(15/32)。array CGH法检测染色体嵌合的胚胎数为0,MALBAC-NGS检测出染色体嵌合的胚胎数为3枚,嵌合率9.37%(3/32)。结论与array CGH法相比,MALBAC-NGS法检测能够降低假阳性率,嵌合检出率高。MALBAC-NGS法检测囊胚内细胞团与外胚层的整倍体一致性较高。

卵裂期优质胚胎的染色体嵌合体研究

目的应用基于多次退火环状循环扩增(multiple annealing and looping-based amplification cycles,MALBAC)的单细胞测序技术分析卵裂期优质胚胎的嵌合体率及类型。方法收集接受卵胞浆内单精子显微注射治疗并生育正常后代的夫妇捐献的卵裂期冷冻优质胚胎,解冻,消化透明带,收集卵裂球,进行单细胞全基因组扩增及二代测序。结果共解冻胚胎23枚,收集184个卵裂球。175个(95.1%)卵裂球获得了测序结果,其中100个(57.1%)为非整倍体。在23枚胚胎中,3个(13.0%)为正常的二倍体,20个(87.0%)为嵌合体,其中包括5个(21.7%)非整倍体嵌合型、7个(30.4%)为二倍体-非整倍体嵌合型、5个(21.7%)为异常嵌合型、3个(13.0%)为无规律分离型。结论卵裂期优质胚胎中存在较高的染色体嵌合体率。复杂染色体异常或高比例异常细胞的嵌合体可能是影响胚胎发育潜能的重要因素。