多重链接探针扩增技术的原理及应用

多重链接探针扩增技术是将核酸杂交和PCR链式扩增相结合的一项高通量检测技术。该技术特异性强、敏感性高,可以实现多达50个靶分子的同步检测。自2002年被报道以来,该技术取得了很大进展,目前已广泛用于遗传性疾病的基因检测、肿瘤预后及传染病高通量检测领域。本文就多重链接探针扩增技术的原理、优缺点及应用等进行了探讨。

自行设计的多重链接探针扩增组合对多发畸形患儿的诊断价值

目的尝试基于多重链接探针扩增(MLPA)技术设计的探针组合对多发畸形(MCA)患儿的诊断价值。方法以临床发现≥2个的畸形表型患儿为病例,基于MLPA技术选择13种常见的MCA的关键基因和关键区域自行设计MLPA探针组合(SIGMA公司合成),以微阵列比较基因组杂交(aCGH)作为金标准,检验该探针组合的诊断准确性,再以MLPA探针组合行MCA临床诊断效果评估,对MLPA探针组合阳性的病例结合临床资料进行分析。结果 1MLPA探针组合涉及的13种常见MCA,包括:21-三体综合征(KCNJ6、DYRK1A、RCAN1基因)、18-三体综合征(MC2R、DTNA、TCF4基因)、13三体综合征(EDNRB、CENPJ、ERCC5、FREM2基因)、1p36区域缺失综合征(GABRD、SKI、TP73基因)、5q35.3区域缺失综合征(Sotos综合征,NSD1基因)、CHARGE综合征(CHD7基因)、7q11.23区域缺失综合征(Williams Beuren综合征,CLIP2、ELN、LIMK1基因);22q11.21区域缺失、重复综合征(DiGeorge综合征,SNAP29、TBX1、ZNF74基因)、17p11区域缺失综合征(Smith-Magenis综合征,RAI1、MFAP4基因)、5p15.2区域缺失综合征(Cri du Chat综合征,CTNND2、TERT基因)、15q1113区域缺失综合征(Prader-Willi综合征,OCA2、UBE3A、GABRB3基因)、4p16.3区域缺失综合征(Wolf Hirschhorn综合征,MSX1、WHSC1、LETM1基因)、17q21.31区域缺失综合征(MAP3K14、MAPT基因)。235例MCA中,aCGH检测阳性11例(31.4%),共诊断9种;MLPA探针组合检测阳性6例(17.1%),共诊断4种;MLPA组合探针检测阳性的6例微缺失和重复与11例aCGH检测阳性一致,6例MLPA探针组合检测阳性的变异位点均位于设计的MLPA探针组合中,122例临床MCA中,MLPA探针组合检测阳性21例(17.2%),诊断6种。3在157例MCA患儿中,应用MLPA探针组合共诊断阳性病例27例,共检出7种(53.8%),分别为21-三体综合征8例,18-三体综合征1例,5p15区域缺失综合征3例,22q11区域重复综合征1例、缺失综合征9例,5q35区域缺失综合征1例,15q11-q13区域缺失综合征3例,7q11.23区域微缺失综合征1例。结论自行设计合成的MLPA探针组合对非典型临床表型的MCA病例有较好的诊断价值。

有向制造网格节点多重链接权重计算方法

将制造网格与Web技术相结合建立了一个新的制造网格控制模型,可有效地刻画制造网格的有向控制过程,同时具有易管理和易控制的特征.在构建模型过程中给出了状态汇聚代理的概念,并分析了状态汇聚代理在有向制造网格进行协同控制管理的过程中提高管理效果和可控性的工作机理.基于该工作机理提出一种基于多重链接的有向制造网格节点权重计算方法,可根据节点权重计算结果排序来识别有向制造网格中的状态汇聚代理.采用T检验、Kendall-tau和斯皮尔曼等级相关系数这3种统计学检验标准对不同的状态汇聚代理识别算法进行对比实验,同时还对算法的准确率和召回率以及计算时间进行了实验验证.结果表明,从状态汇聚代理识别能力、准确率和召回率以及计算时间等综合指标来看,新方法更具优势.

基于多重链接的微博网络节点权重计算方法

随着Web2.0技术的发展,微博网络已成为当前互联网中非常流行的网络应用,以即时性、碎片化、聚合性为特点的信息传播特性受到广大用户的欢迎。意见领袖在信息传播过程中发挥了重要的推动作用,有效地识别网络意见领袖,对于提高信息传播效果和可控性具有重要的现实意义。根据微博网络特点,提出一种基于多重链接的微博网络节点权重计算方法,根据节点权重计算结果并排序来识别意见领袖。采用T-Test、Kendall-tau和Spareman Rank三种统计学检验标准对不同的意见领袖识别算法进行对比实验,同时还对算法的准确率和召回率以及计算时间进行了实验。实验结果表明,从意见领袖识别能力、准确率和召回率以及计算时间等综合指标来看,该方法更具优势。

一个新的无证书多重无链接签名方案

基于无证书密码体制,提出一个新的多重无链接签名方案。新方案允许用户在不同的应用场合中使用不同的身份信息,并要求由这些身份所导出的不同公钥对应的签名密钥是唯一的,不同公钥的使用可以保证公钥的无链接性,从而更好地保护用户的隐私。在随机预言模型下,新方案可以抵抗适应性选择消息攻击。

全外测序联合拷贝数变异检测在遗传性耳聋的应用

目的探讨全外显子测序(WES)联合拷贝数变异(CNV)检测在遗传性耳聋中的临床应用价值,并加深对CNV的认识。方法选取广州市红十字会医院耳鼻咽喉头颈外科就诊的双耳中度感音神经性聋患儿,无家族遗传史、用药史,完善内镜、影像学、主观和客观听力学等检查,采集外周血样本,行WES寻找致聋原因并验证。结果患儿无家族遗传史、耳毒性药物用药史等,听性脑干反应阈值、ASSR及纯音听阈测听提示双侧中度感音神经性聋。在该患儿全外显子组发现12个纯合变异,分别定位于1(CR1基因,剪接变异)、5(ZSWIM6基因、SMN1基因,同义突变)、6(ATXN1基因,框内缺失突变;TENT5A基因,框内插入突变)、7(CFTR基因,内含子)、8(TG,启动子)、9(PRDM12基因,框内缺失突变)、10(TUBGCP2基因,剪接变异)、11(TENM4基因,剪接变异)、15(STRC基因,缺失)、16(ABCC11基因,错义变异)号染色体。根据美国医学遗传学与基因组学学会指南、综合病史分析,只有STRC基因NM_153700.2:EX1-EX29E Del变异为致病变异,其余变异为良性或可能良性。多重链接探针扩增技术对靶序列进行验证,结果证实。结论本例患儿为DFNB16(OMIM:603720)的STRC基因变异导致双耳中度感音神经性聋。临床诊疗中,可根据病史,选择不同深度、广度的检测技术;加强耳科医师对CNV引起遗传性耳聋的认识。

杜氏肌营养不良症的临床表现与基因表型的关联

目的：分析杜氏肌营养不良症（DMD）患者的基因突变特点,探讨疾病的临床表现与基因型的关联。方法：回顾性分析52例DMD患者的临床表现和基因特点。结果：患者多表现为肢体无力、走路姿势异常,发育迟缓,部分患者伴智力下降,心脏功能减退等。多重链接探针依赖扩增技术发现基因检测无异常4例（7.69%）,DMD基因缺失40例（76.9%）,重复8例（15.3%）。基因突变发生在外显子45~55 22例（40.74%）,2~19区域10例（19.23%）。48例基因异常患者中,符合阅读框架原则42例（87.5%）。结论：基因缺失的大小与临床症状的关系不大,病情严重程度关键取决于突变是否会破坏阅读框结构。基因突变越接近5＇端对智力的影响越轻,越接近3＇端对智力的影响越重。

正常人群中发现Dystrophin基因外显子缺失的分子遗传学分析

目的对存在Dystrophin基因外显子缺失家系进行分子遗传学诊断,分析该家系Dystrophin基因突变情况及临床表型,探讨该基因缺陷的分子遗传学基础,为临床遗传咨询提供更多的咨询意见。方法采用染色体微阵列分析技术对胎儿染色体进行拷贝数变异分析,应用多重链接依赖探针扩增技术对胎儿Dystrophin基因进行外显子缺失检测,同时对家系其他成员进行Dystrophin基因外显子进行检测。结果染色体微阵列分析技术发现胎儿Xp21.1(31,738,181-31,806,661)缺失,多重链接依赖探针扩增技术检测出Dystrophin基因外显子51~52缺失,家系女性均为Dystrophin基因外显子51~52缺失携带者,两位男性为Dystrophin基因外显子51~52缺失半合子,一位男性未发现Dystrophin基因外显子缺失。结论 Dystrophin基因缺失突变可出现于正常人群,Dystrophin基因缺失突变不一定导致Duchenne/Becker型肌营养不良,为临床基因诊断及遗传咨询提供了重要依据。

1个脆性X综合征家系的FMR1基因CGG重复及甲基化状态分析

目的应用PCR微流控芯片毛细管电泳联合MS-MLPA技术对1个脆性X综合征家系进行CGG重复序列和甲基化状态分析,探讨FMR1基因甲基化程度和临床表型的关系。方法应用PCR微流控芯片毛细管电泳法对该家系22个成员进行FMR1基因CGG重复数检测,采用甲基化特异性多重连接依赖探针扩增(MS-MLPA)技术检测FMR1基因启动子区域CpG岛的甲基化情况,并用Southern印迹杂交技术对全突变患者进行验证。结果22个家系成员中检出前突变携带者8例,全突变女性携带者1例,脆性X综合征男性患者4例。MS-MLPA分析发现女性正常型和前突变携带者的甲基化比值分别为0.25~0.48(中位数0.33)和0.33~0.46(中位数0.38),两组间差异无统计学意义(t=0.095,P>0.05),1例女性全突变携带者甲基化比值为0.52,高于正常型和前突变携带者,4例男性全突变患者甲基化比值均>0.64,中度智力障碍组和重度智力障碍组之间甲基化比值差异无统计学意义(t=0.58,P>0.05)。结论CGG重复数检测和甲基化分析可为脆性X综合征家系成员提供准确全面的分子诊断;男性患者临床表型和甲基化程度相关。

Russel Silver综合征19例病例系列报告

目的总结分析经甲基化特异性多重链接探针扩增技术(MS-MLPA)确诊的Russel Silver综合征(RSS)患儿的临床特征、基因型(表观突变)以及表型和基因型的相关性,旨在提升对该病的认识。方法收集2015年1月1日至2019年6月30日复旦大学附属儿科医院(我院)分子医学中心经MS-MLPA确诊的RSS连续病例的临床资料。MS-MLPA行11p15区域甲基化和拷贝数变异(CNV)情况检测,应用Gene Marker软件对实验数据进行均一化处理及结果判读。结果19例RSS患儿,女8例,男11例,确诊年龄中位数3.3岁(3月龄至10岁)。小于胎龄儿18例,就诊时18例患儿身高均低于同龄儿童身高P3,体重均低于同龄儿童体重P10。特殊面容发生率较高的表型有前额突出9例,三角脸7例,肢体不对称和手指短或内侧弯曲6例,小下颌5例。其他表现包括眼距宽、低耳位、高腭弓、牙齿突出、胸廓畸形、脊柱侧凸和房间隔缺损等。19例RSS患儿有3例检测到携带11p15区域拷贝数重复,余16例均显示H19-DMR低甲基化且无CNV。结论有宫内和出生后生长发育迟缓、肢体不对称和特殊面容的儿童,应注意RSS的可能,首选MS-MLPA检测,以利于及早干预和遗传咨询。

Klinefelter综合征在18318例羊水染色体产前诊断中的检出情况及临床特点

目的了解Klinefelter综合征在羊水染色体产前诊断中的检出情况及其临床特点。方法收集18318例行羊水染色体核型分析孕妇的检测结果及其产前筛查、产前诊断的结果,并追踪其妊娠结局。结果在18318例羊水产前诊断样本中检出Klinefelter综合征34例(检出率为1.86‰),其中47,XXY 30例、嵌合体型3例、48,XXYY 1例。34例Klinefelter综合征中,28例选择引产,6例继续妊娠;仅2例产前超声存在异常;15例接受无创产前检测(NIPT),均提示性染色体异常;25例采用分子诊断学多重连接探针扩增技术(MLPA)或基因组拷贝数变异测序的方法验证,其中24例与染色体核型分析一致。结论Klinefelter综合征在产前诊断中检出率不高,以典型的47,XXY为最常见的核型。部分Klinefelter综合征患者在胎儿期表现正常,而在出生后才表现异常的临床表征。NIPT或可作为Klinefelter综合征的产前筛查的有效手段,而染色体核型分析结合MLPA等分子诊断学技术可更准确地检出Klinefelter综合征。

基于图形的资源管理支撑平台——卷烟生产企业的生产技术管理的关键系统

文章介绍一种新的以图形为平台对卷烟生产企业的生产技术要素进行集成管理的软件系统。系统采用"可动态编辑的多重链接浏览器"技术及数据库技术,将设备图纸、技术手册、设备图像、资料图表、设备信息、设备检修、故障处理等信息有机地集成到一起,动态生成图形信息集成平台,从图形上即可直接快速获取所需的各种相关信息。它能大幅度提高工作效率,降低劳动强度,有效增强生产设备的事故抢修反应速度,缩短维保时间,为建立设备维护和故障处理的快速反应机制提供了强有力的技术手段,同时为领导快速决策提供技术支持,从而提高设备管理质量和运行效率、降低运营成本、保障生产的安全性和可靠性。

单核苷酸多态性（SNP）在近交系小鼠遗传检测中的应用

目的 利用单核苷酸多态性（SNP）位点构建多重聚合酶链反应和链接酶反应（PCR-LDR）方案,为近交系小鼠的遗传检测提供一种快速、简便的方法.方法 在SNP公共数据库中挑选51个SNP位点,该51个位点分布于每条常染色体和性染色体,共分为5组,进行多重PCR-LDR方案构建,并将该方案作为遗传质量检测方法对采集的7个近交系样本进行检测.结果 在送检的7个近交系小鼠样本中,纯合度都为100％,相同来源相同品系小鼠的遗传背景一致,但在不同单位的近交系小鼠中,某些SNP位点有差异,CBA/Ca/BK1和CBA/JSlac在a9、a10、b5、b9、c1、c12、e1、e2位点的遗传检测结果不同,C57BL/6/BK1和C57BL/6JS1ac在c7、c10位点的遗传检测结果不同.另外,两家公司各有5个位点在所有品系中基因型相同,因此有效位点数各为46个.结论 构建的多重PCR-LDR方案能有效对两家动物生产单位的近交系小鼠进行检测,可用于常见近交系小鼠快速、高通量的基因分型,有利于大规模遗传质量检测和品系鉴定.

中国成年特殊类型糖尿病人群中肝细胞核因子1β基因大片段缺失、重复筛查

目的 了解上海及其周边地区汉族特殊类型糖尿病人群中肝细胞核因子1β（HNF-1β）基因大片段缺失、重复的发生情况.方法 选取2003年1月至2006年12月在上海市糖尿病研究所住院治疗的糖尿病患者104例,其中男74例,女30例,平均年龄（65±14）岁.患者酪氨酸磷酸酶样蛋白抗体和谷氨酸脱羧酶65抗体检测阴性,并且存在肾脏结构异常或肾功能受损.剔除其中3例存在HNF-1β基因点突变患者.其余101例患者应用多重链接探针扩增技术进行HNF-1β基因大片段缺失、重复筛查.结果 在1例多发肾囊肿伴右肾发育不全、双子宫、胰腺体尾部萎缩的患者中见到HNF-1β整个基因杂合性缺失.结论 HNF-1β基因大片段缺失在中国上海及其周边地区汉族特殊类型糖尿病人群中发生率较低,约占临床疑似HNF-1β基因突变糖尿病表现人群的1％,且大片段杂合性缺失患者的临床表现与点突变携带者相似.

联合应用MLPA和测序技术检测地中海贫血基因缺陷

目的构建并优化可对HBA和HBB基因缺失和突变进行检测的技术,评价该技术应用于深圳市人群地中海贫血的诊断效应。方法联合采用基因测序技术和多重链接依赖探针扩增(MLPA)技术对收集的88例样本分别进行α地贫和β地贫的基因诊断,并用常规方法验证。结果从88例高度疑似地贫患儿中检出α地贫患者43例,β地贫患者40例,α合并β地贫患者5例。同时,MLPA技术检测出1例不常见的α珠蛋白大片段缺失型地贫,基因测序检测出1例HBA1基因突变。结论 MLPA技术和基因测序技术结合应用,能够有效地进行α地贫和β地贫的基因诊断,提高诊断的准确度,具有良好的临床应用价值。

Duchenne型肌营养不良分子遗传学分析

目的对临床诊断为Duchenne型肌营养不良（DMD）的患儿进行基因检测，分析抗肌萎缩蛋白基因（DMD基因）突变类型及变异大小，探讨DMD分子遗传学诊断策略。方法对临床诊断为DMD的28例患儿采用多重链接探针依赖扩增技术（MLPA）进行DMD基因检测，然后随机选择MLPA检测阳性的5例和阴性的1例采用DMD全基因捕获探针进一步行全基因组新一代测序（NGS），最后采用PCR和Sanger测序法对所得结果验证。结果采用MLPA技术对28例患儿进行检测，发现22例阳性结果，包括外显子大片段缺失突变16例，重复突变4例，同时合并缺失和重复突变2例；随机选择MLPA检测阳性的5例和阴性的1例采用NGS技术检测，发现3例外显子缺失突变（exon51del，chrX：31779857—31795289；exon53del，chrX：31685440-31747548；exork51-55del，chrX：31632504—31827732），及2例外显子重复突变（exon45dup，chrX：31970766—32023816；exon55dup，chrX：31540860—31649750），与MLPA结果一致，且精确定位了断裂点区域和片段大小，同时发现MLPA检测阴性的1例为点突变（exon54，chrX：31676176，C．7948delG，P．D2650IfsX12），该点突变经PCR扩增和Sanger测序验证，所得结果与NGS检测结果一致。结论DMD基因突变类型多样，包括外显子缺失和（或）重复、点突变等，应用MLPA技术能有效检出DMD基因外显子大片段缺失、重复以及杂合突变，应用NGS技术不仅能检出缺失和重复突变，并精确判断断裂点位置及大小，还能准确检出微小缺失和点突变，为临床DMD的早期诊断、预后判断及产前诊断提供遗传学帮助。

Prader-Willi综合征2例的临床及遗传学分析

目的探讨Prader-Willi综合征(Prader-Willi Syndrome,PWS)的临床特征及遗传学特点。方法回顾性分析2例于河北省人民医院确诊为PWS患儿的临床资料及基因学特点,并对相关文献进行讨论复习。结果病例1,男,年龄6岁3个月,因身材矮小就诊,智力轻度低下,构音障碍,脊柱侧弯,隐睾,小阴茎,长颅、窄面、杏仁眼、小嘴,薄上唇、嘴角向下,皮肤白皙。婴儿期肌张力低下、喂养困难,后逐渐食欲亢进,1.5岁行双侧隐睾手术,但效果不佳。病例2,男,年龄4岁,主因肥胖就诊,食欲亢进,体质量增长过快,语言、认知功能落后,构音不清,脊柱侧弯。婴儿早期曾有喂养困难,2岁行双侧隐睾手术效果不佳。分别采用甲基化特异性聚合酶链反应及甲基化特异性多重链接探针扩增技术进行了基因检测:结果均检测到PWS关键区域(15q11-13)的父源片段丢失,确诊为PWS。结论PWS是一种较为罕见的遗传性疾病,临床表现复杂多样,各年龄段特点不同,对不明原因婴儿期肌张力低下、喂养困难;儿童期矮小、肥胖患儿,需警惕该病,可通过分子遗传学技术明确诊断。

MLPA技术在快速产前诊断染色体非整倍体异常的应用

目的探讨多重链接探针扩增(multiplexligation-dependentprobeamplification,MLPA)技术在快速产前诊断染色体非整倍体异常的临床应用。方法选取我院2016年1月至2016年12月具有产前诊断指征孕妇,在适宜孕周进行穿刺取羊水、脐血或绒毛,采用MLPA技术进行21、18、13、X和Y染色体非整倍体快速检测,同时进行细胞培养后染色体核型分析双盲检测。结果在5396例产前诊断样本21、13、18、性染色体非整倍体与染色体核型分析比较的符合率为99.9%,141例异常结果涉及21、13、18、X/Y染色体分别为81例、12例、18例、30例。结论 MLPA技术对染色体非整倍体检测具有低成本、高通量、检测周期短等优势,结合染色体核型分析可应用于快速产前诊断染色体非整倍体异常。

一例假肥大型肌营养不良家系DMD基因分析及产前诊断

目的对1例临床症状疑似假肥大型肌营养不良(DMD/BMD)的患儿进行基因诊断,并进行携带者筛查及产前诊断。方法使用多重链接探针扩增技术(MLPA)进行DMD基因79个外显子缺失或重复检测,同时应用高通量测序技术(NGS)对神经肌肉相关基因进行靶向测序,并通过Sanger测序对先证者及家系成员进行验证。结果 MLPA检测未发现患儿DMD基因外显子发生缺失或者重复突变,NGS测序发现DMD基因第39号外显子c.5544-5548delGATAA半合子突变。Sanger测序验证发现患儿母亲、弟弟(胎儿)均存在c.5544-5548delGATAA突变。结论本研究发现一种尚未病例报道的新发突变,该缺失突变是导致患儿发病的原因,MLPA结合NGS技术可有效提高疾病的诊断效率,为产前诊断提供准确信息。