多重降落PCR检测血流感染产ESBLs肠杆菌科细菌与MRSA方法的建立和应用

目的探索一种可同时检测产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)的肠杆菌科细菌与耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的多重降落PCR方法。方法收集某院20l3年3月—2014年9月102份住院患者血培养阳性标本,针对产ESBLs肠杆菌科细菌的SHV、TEM、OXA基因和MRSA的MecA基因设计4对特异性引物,分别采用单一降落PCR和多重降落PCR对各耐药基因进行扩增,并将结果与药敏纸片法进行比较。结果各单一PCR均可扩增出特异性条带,并用多重降落PCR同时检测了4种耐药基因;建立的多重降落PCR对4种耐药基因(MecA、SHV、TEM、OXA)DNA的检测下限分别为4.37、2.19、4.53和3.59 ng。与药敏纸片法相比,多重降落PCR总灵敏度与特异性分别为100.00%、88.24%,检测ESBLs的灵敏度达100.00%,特异性为87.23%,检测MRSA的灵敏度和特异度均为100.00%。结论该实验建立的多重降落PCR具有高灵敏度与特异性,可用于产ESBLs肠杆菌科细菌和MRSA所致血流感染的快速诊断与流行病学调查,有利于指导临床使用抗菌药物。

快速检测肺炎链球菌recA、ply及16S rRNA基因的多重降落PCR方法建立及应用

目的:建立快速检测肺炎链球菌recA、ply及16S rRNA基因的多重降落PCR方法并应用。方法:设计肺炎链球菌的特异基因recA、ply及其菌属保守序列16S rRNA基因的引物,建立多重降落PCR的反应体系及条件,通过该方法检测13株标准菌株的基因以判定recA、ply、16S rRNA基因的检测特异性;并通过对不同稀释度肺炎链球菌DNA的检测判定该方法的灵敏度。最后,应用多重降落PCR方法检测98份痰标本的肺炎链球菌,并与细胞培养法进行比较。结果:建立的多重降落PCR方法检测肺炎链球菌的特异性达100%,灵敏度达5 pg/μL,该方法对98份痰标本中肺炎链球菌的检测结果与细胞培养法一致。结论:成功建立检测肺炎链球菌的多重降落PCR方法,灵敏度高,特异性强,可用于临床标本肺炎链球菌的快速检测。

多重降落PCR检测痰标本肺炎链球菌与b型流感嗜血杆菌

目的:建立可同时检测痰标本中肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae,Sp)与b型流感嗜血杆菌(Hae-mophilus influenzae type b,Hib)的多重降落PCR。方法:以Sp cpsA基因、Hib capⅡ区为靶标设计引物,并用Primer-BLAST在线软件检测其特异性,多重降落PCR检测492份痰标本,并以标准菌株作为对照,结果与细菌培养法进行比较。结果:所建立的多重降落PCR对Sp、Hib的检测下限分别达6.3 pg、0.2 pg;与细菌培养法相比,灵敏度及总灵敏度均达100%,检测Sp、Hib特异性分别为94%、98%,总特异性达92%。结论:所建立的多重降落PCR具有高灵敏度与特异性,可作为Sp、Hib感染的快速诊断与流行病学研究的备选手段。

副溶血性弧菌和创伤弧菌多重降落PCR体系的建立

目的：建立一种可以同时检测食源性疾病中常见病原性海洋弧菌，主要是创伤弧菌及副溶血性弧菌的多重降落PCR反应体系。方法：收集2017年3月-2017年10月食源性疾病高发期就诊的患者粪便标本进行分离培养鉴定并分析，同时针对创伤弧菌的whA基因、副溶血性弧菌Parcol基因及16S基因靶标分别设计3对特异性引物，应用该引物建立多重降落PCR，并检测103份粪便标本，其结果与细菌培养法进行比较。结果：建立的多重降落PCR对致病菌两种基因（vvhA、col）DNA的检测下限分别为104CFU／mL、103CFU／mL；与细菌培养法相比，灵敏度可迭100％，检测vvhA、col基因特异性分别为97．94％、95．12％，总特异性达96．65％。结论：所建立的多重降落PCR具有高灵敏度与特异性，可直接检测由创伤弧菌和副溶血性弧菌引起的食源性感染，其结果可以直接用于临床检测。该方法可用于由创伤弧菌和副溶血性弧菌引起的食源性感染的快速诊断与流行病学调查。

多重-降落PCR方法在转基因粮食检测中的应用

通过对当前转基因检测方法优缺点的分析,发现相对于其他检测方法,多重-降落PCR方法具有成本低、灵敏度高、特异性强且快速简便等特点,该方法可选作粮食转基因检测方法,为政府相关部门监督、管理和控制转基因粮食及其制品提供技术保障。

检测5种碳青霉烯酶基因的多重PCR方法的建立及临床应用

目的建立并评价一种多重降落PCR(Multiplex Touchdown PCR,MT-PCR)方法检测5种碳青霉烯酶基因。方法收集东部战区总医院保存的42株耐碳青霉烯类菌株和合成的带有OXA-48部分基因质粒,建立5种碳青霉烯酶基因的多重降落PCR方法,分析其特异性、敏感性,并收集东部战区总医院临床微生物实验室送检的临床无菌体液标本67份及其分离菌株36株进行临床应用评价。结果MT-PCR可用于5种碳青霉烯酶基因的检测,对blaOXA-48、blaVIM和blaKPC检测限均为200 CFU/ml,而对blaIMP与blaNDM的检测限为2×10^3 CFU/ml。42株临床分离菌株的MT-PCR检测结果与单重PCR检测结果完全一致。以抗菌药物药敏试验为参考方法,67个无菌体液标本的MT-PCR结果与药敏试验结果差异无统计学意义(P=0.125),且敏感性和特异性分别为80.00%和100.00%。结论MT-PCR方法能有效地用于临床分离物和无菌体液标本中的碳青霉烯酶基因检测。