猪细小病毒和猪圆环病毒2型多重PCR检测方法的建立与应用

根据GenBank中已发表的猪细小病毒（PPV）和猪圆环病毒2型（PCV2）基因序列，对各病毒基因区进行同源性分析，确定PPV的VP2和PCV2的ORF2基因为各病毒的诊断靶序列，设计特异性引物，在建立各病毒单项PCR技术的基础上，优化多重PCR反应条件，建立了2种病毒的多重PCR技术，可同时扩增PPV的313bp和PCV2的447bp的特异性片段。用多重PCR技术与单项PCR技术对比检测试验证明二者的总符合率为100％。表明建立的多重PCR检测方法，具有特异、快速、准确的特点，可同时鉴别诊断这2种病毒。

利用多重PCR同时检测WSSV和MBV两种对虾病毒的研究

研究了检测斑节对虾(Penaeus monodon)的主要致病病原--对虾白斑综合征病毒(white spot syndrome virus,WSSV)及斑节对虾杆状病毒(monodon baculovirus,MBV)的技术.用多重PCR检测方法,设计了两对特异性引物,从不同虾池中收集斑节对虾,提取DNA模板,同时检测两种对虾病毒.研究结果表明:该方法检测灵敏度高、特异性好,可检测至每毫克组织100个病毒粒子;从对虾组织中提取的DNA模板对病毒DNA的扩增无抑制,适合于对虾中两种病毒的同时检测.

南方、爪哇和花生根结线虫的快速灵敏的PCR鉴定方法

为了研制南方、爪哇和花生根结线虫快速灵敏的检测和鉴定方法，分别分离了4个南方根结线虫和3个爪哇根结线虫特异性的随机扩增多态性DNA(RAPD)片段。在这些RAPD标记DNA序列的基础上，设计了多对SCARPCR引物，并用源于国内外的南方、爪哇、花生、北方和象耳豆根结线虫群体验证其扩增特异性和灵敏度。最终确定了3对高效扩增的SCAR引物，

用PCR技术从cDNA文库中获取目的基因长片段

目的 建立一种简便有效的获取cDNA大片段的实验技术。方法 应用PCR原理 ,设计特异引物结合文库载体引物对大鼠胎肝cDNA文库进行PCR扩增 ;用随机引物标记法标记已知小片段“目的基因”(30 0bp± )作为探针 ,对PCR产物进行Sorthern杂交以检验“目的基因”片段的正确性及长度 ;回收“目的基因”片段并连接入PGEM T载体 ,转染JM 10 9并扩增后 ,提取“目的基因”测序。结果 琼脂糖凝胶电泳发现PCR扩增产物有多条不同长度的段 ,Sorthern杂交发现一段长度为 1 5kb的cDNA片段为“目的基因” ;测序结果与GeneBank进行Blaste分析 ,该基因为一株新的序列 ,已在GeneBank中登录注册 (RatLiverRegeneration relatedPro tein 1,RLRP 1AF2 36 0 5 4 )。

随机引物PCR方法在霍乱弧菌基因型分析中的应用

随着分子生物学的迅速发展，霍乱弧菌的检测和基因分型出现了更加快速、有效的手段。随机引物PCR又称随机扩增多态性DNA（RAPD）是在PCR的基础上发展起来的一种实验技术。不需先了解目的基因的核酸序列等优点，可用于细菌的分子分型。我们采用RAPD方法，对2005年收集的福州市霍乱弧菌菌株分子特征进行检测，现将结果报告如下。

利用M-RAPD技术绘制不同病原微生物基因指纹图

目的 探讨一种多重随机引物 PCR方法 (M- RAPD)对不同种株病原微生物进行鉴定的可能性。方法 将 1 0个碱基的随机引物进行随机组合 ,利用三条组合的随机引物在较高的退火温度下对不同种株病原微生物染色体 DNA进行扩增 ,通过 1 5 g/L 琼脂糖凝胶电泳获得不同种株病原微生物的扩增图谱 ,并用软件 Gelworks1 d Intermediate进行分析。结果 初步实验表明 ,M- RAPD技术可以得到稳定的种株特异的 DNA指纹图谱 ,其条带清晰、数目较多、片段大小分布均匀。三引物的扩增产物包含了其中任意两引物的绝大多数扩增产物 ,大、小片段均可出现增减 ,但小片段更易增加 ;对同一种病原微生物三引物所提供的基因信息要远多于两引物所提供的信息 ,增加的信息量约为原来的 5 0 % ;不同耐药菌株间及其与相应标准株间差异亦很明显 ,但同种不同株间相同的扩增产物要多于不同的扩增产物。软件 Gelworks1 d Interm ediate的分析数据亦支持我们的实验结果。结论 M- RAPD技术对不同种株病原微生物染色体 DNA扩增时 ,能获取较丰富的遗传信息 ,可迅速、简便地鉴定不同种株的病原微生物。

多重PCR法检测外周血单个核细胞中的HBVDNA与HBVcccDNA

目的建立多重聚合酶链反应法(MultiplexPolymerasechainreaction,M-PCR),揭示慢性乙肝患者外周血单个核细胞(PBMC)中HBVDNA的存在状况。方法采用一种把一套扩增乙肝病毒基因组DNA(HBVgenomeDNA)的引物和一套特异性扩增乙肝病毒共价闭合环状DNA(HBVcccDNA)的引物掺入到一个体系中的PCR法,检测PBMC中的HBVDNA核酸分子。结果PCR法可使处于同一PBMC中的总HBVDNA和HBVcccDNA同时分别良好的扩增出来;30例慢性乙肝患者的PBMC中,总HBVDNA与HB VcccDNA同时检出者23例,检出率76.6%;检出HBVcccDNA者占检出总HBVDNA者的82.1%。结论PBMC中的HBVDNA部分参与复制。成功的建立了能同时检测HBV基因组DNA与HBVcccDNA的M-PCR方法。

mRNA差异显示技术的研究进展

针对mRNA差异显示技术中的假阳性高和放射性污染等缺陷,文章从改进引物设计、应用非放射性标记、优化PCR参数、假阳性鉴定等方面进行了综述。1采用4种兼并或单碱基引物作锚定引物;用特异和长序列(≥20bp)专一性引物作为随机引物,可增加特异性;在锚定引物之前加上了一段T7启动子序列,在随机引物前加上一段M13重复序列,可使DDRT—PCR的体系的扩增特异性更一致。2针对放射性同位素检测法的缺点,文章提出并比较了几种常用的非放射性同位素标记方法。3保证起始(模板)mRNA质量和浓度,降低dNTP浓度,选择最适的反转录和PCR退火温度,可优化PCR参数。4用两种不同的反转录酶进行反转录平行实验,很容易区分出RNA制备过程中造成的假阳性,目前假阳性鉴定大多还是以Northern印迹为基础,再作些适当的改进。

四种分枝杆菌快速检测方法的研究

目的建立敏感、特异的快速检测4种分枝杆菌的方法。方法用特异性引物对结核分枝杆菌、鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌和堪萨斯分枝杆菌菌悬液DNA进行PCR扩增,验证其敏感性和特异性。将上述4种分枝杆菌的特异性引物同时放入PCR扩增反应体系中,以此反应体系分别对该4种分枝杆菌菌悬液DNA、及其两两组合或特定的三重组合进行扩增,同时验证其敏感性。结果4种分枝杆菌的特异性引物分别放入各自的PCR扩增反应体系中,可分别特异性地扩增出该4种分枝杆菌对应的DNA片段,敏感性达1×101～1×102个菌细胞/mL。4种分枝杆菌的特异性引物同时放入同一PCR扩增反应体系中可分别特异性地扩增出对应的4种分枝杆菌单菌及其两两组合或三种分枝杆菌组合的DNA片段,敏感性达1×102～1×103个菌细胞/mL;4种分枝杆菌的特异性引物对其他分枝杆菌进行扩增,结果均为阴性。结论多重PCR方法能敏感、特异地快速检测4种分枝杆菌。

基因芯片检测肠出血性大肠埃希菌O157∶H7

目的设计和制备快速、特异、灵敏的检测大肠埃希菌O157∶H7基因芯片。方法选择O157∶H7特异的rfbE、fliC、SLT1和SLT2基因,设计引物和探针,并制备检测芯片,通过两次聚合酶链反应(PCR)扩增,制备荧光标记的靶序列,并与芯片进行杂交,检测O157∶H7菌株和非O157病原体。结果O157∶H7菌株在采用单一和多重PCR两种方法制备的荧光标记靶序列与芯片杂交,均在芯片相应探针处出现阳性信号,非O157杂交结果均为阴性;芯片检测灵敏度比PCR检测高。结论基因芯片可以快速、灵敏、特异地检测O157∶H7,为建立快速灵敏的检测细菌病原体和鉴别诊断的自动分析系统提供了新方法。

酸性环境下唾液分泌型IgA对变形链球菌免疫反应的体外研究

目的探讨在酸性条件下,唾液分泌型免疫球蛋白A(SIgA)与变形链球菌的特异性结合是否会产生变化。方法收集武汉市20位志愿者的牙菌斑样本及无菌颌下腺、舌下腺唾液,随机引物聚合酶链反应(AP-PCR)鉴定临床变形链球菌分离株。分组培养:对照组在pH7.2的培养基中厌氧培养,实验组在pH5.5的培养基中培养。变形链球菌菌株全细胞蛋白凝胶电泳,利用Westernblot方法分析个体唾液SIgA与自身变形链球菌菌株和标准参考菌株S.mutansGS-5,S.mutansIngbrittC的免疫印迹反应。结果①SIgA与自身菌株和标准菌株均有免疫印迹条带;②同一个体对不同基因型的变形链球菌菌株出现不同的免疫印迹条带;③酸休克后,没有新的特异性条带出现,但有某些印迹条带强度增强。结论变形链球菌在酸性条件下可以产生酸休克蛋白,但不足以与SIgA发生特异性结合,仅有部分反应条带强度增加。提示酸性环境不影响SIgA对变形链球菌的识别。