基于PrimerHunter的多重PCR引物设计系统的构建与应用

PrimerHunter是一款多重PCR引物设计软件,该软件能够高效地设计出具有特异性的多重引物,但是只能在Linux系统的命令行中运行,而且没有考虑引物二聚体的问题。针对这些问题,文章建立了基于PrimerHunter的多重PCR引物设计系统,实现了PrimerHunter的界面化,完成了C/S模式向B/S模式的转换,同时增加了原软件不具备的引物二聚体检测模块,能够有效检测引物对之间的二聚体情况,为相关生物学领域研究提供了一种高效的多重PCR引物设计工具。

利用MPprimer设计引物并优化扩增条件以提高多重PCR效率的实验研究

多重PCR技术广泛应用于多个研究领域,其中引物设计及扩增条件是提高多重PCR实验效率的关键因素.为探讨优化多重PCR实验的方法,以小鼠5个看家基因为研究对象,使用实验室新近开发的MPprimer程序设计多重PCR引物,并通过改变多种反应条件来优化多重PCR实验.结果表明,MPprimer程序能够设计出理想的多重PCR引物,并且通过对退火温度及延伸时间进行优化,可显著提高多重PCR实验效率,对于提高基因表达的规模化检测能力具有积极的促进作用.

多重PCR检测猪瘟病毒、猪细小病毒和猪伪狂犬病病毒的研究——猪瘟病毒、猪细小病毒和猪伪狂犬病病毒多重PCR引物设计

在GeneBank中查出CSFV、PPV、PRV的所有已知序列。对病毒各基因区进行同源性分析 ,确定CSFV的E2 基因 ,PPV的VP2 基因和PRV的 gⅡ基因为各病毒扩增的靶序列。利用DNAsis对上述保守区进行引物设计 ,对设计出来的 3种病毒引物利用DNAstar进行引物二聚体分析 ,以避免引物之间形成稳定的引物二聚体。选出扩增序列为CSFV 2 88bp、PPV575bp和PRV 70 0bp的 3对引物 ,并对每对引物扩增序列的同源性或互补性进行分析。避免它们之间有较高的同源性或互补性 ,从而确定了

禽流感病毒H5、H7和H9亚型基因的引物设计与多重RT-PCR扩增

PCR技术是分子生物学领域最基本也是最重要的技术手段之一。然而,找到一对合适的核苷酸片段作为引物,使其有效地扩增模板DNA序列,决定着PCR的成败。在GENEBANK中搜索H5、H7和H9亚型禽流感病毒的血凝素基因序列,并利用DNAStar软件分析它们的同源性,利用Primer Premier5.0软件进行引物设计。多重RT-PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳结果显示引物设计成功。

利用正交设计优化水曲柳ISSR-PCR反应体系

利用正交设计L16(45)对水曲柳ISSR-PCR反应体系的5因素(Taq酶,Mg2+,模板DNA,dNTP,引物)在4个水平上进行优化试验,PCR结果用统计软件MINITAB分析:①各因素的不同水平对PCR反应结果都有显著的影响,其中Taq酶量影响最大;②筛选出各反应因素的最佳水平,建立水曲柳ISSR-PCR反应的最佳体系(20滋l)为:Taq酶1.0U,Mg2+2.0mmol/L,模板DNA50￣200ng,dNTP0.15mmol/L,引物0.3滋mol/L。最后,对水曲柳ISSR-PCR最佳反应体系进行梯度退火,得到最佳退火温度为58.3℃。这一优化系统的建立为今后利用ISSR标记技术,研究水曲柳的地理变异提供一个标准化程序。

多重PCR-RFLP检测XRCC1基因两位点多态性

目的探讨多重聚合酶链反应-限制性片断长度多态性(多重PCR-RFLP)技术在单核苷酸多态性检测中的应用。方法应用多重聚合酶链反应(Multiplex)(多重PCR)原理设计人类X射线交错互补修复基因1(XRCC1基因)194、399位点引物,通过PCR-RFLP技术判断XRCC1基因2个SNP位点多态性。结果设计的两对引物可同时PCR扩增分别含2个多态位点的DNA片段,MspI限制性内切酶酶切可判断2位点多态性,PCR和酶切效果均较好。结论多重PCR-RFLP技术可应用于单核苷酸多态位点的检测,并节省时间和费用,提高检测效率。

猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒和猪A群轮状病毒多重PCR检测方法的建立

为了能够同时快速准确检测出猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒（Porcinetransmissible gastroenteritis virus,TGEV）及猪A群轮状病毒（Porcine rotavirus,RV）,试验通过设计引物、优化PCR条件构建了一个能同时检测出TGEV、PEDV及RV的多重PCR方法。结果表明：该方法能同时检测到TGEV、PEDV及RV,而对猪瘟病毒（CSFV）、猪呼吸与繁殖综合征病毒（PRRSV）、猪伪狂犬病毒（PRV）、猪圆环病毒Ⅱ型（PCV-2）、细小病毒（PPV）、日本乙型脑炎病毒（JEV）、牛病毒性腹泻病毒（BVDV）等无扩增,TGEV、PEDV及RV的最低检测浓度为1×102拷贝/μL。说明试验设计的多重PCR方法不仅省时、省力,而且具有敏感性高、特异性强等优点。

分析鲜切果蔬中四种病原微生物多重PCR检测技术

针对目前多重PCR检测技术应用过程中存在的问题,文章从实践角度出发,阐述了研究鲜切果蔬中四种病原微生物多重PCR检测技术的应用过程,并分析了检测试验结果,其目的是为相关建设者提供一些理论依据。

TPM:基于Taverna的PCR引物设计与评估工作流系统

PCR引物设计是PCR实验中关键而重要的一步,而引物的特异性情况直接影响着PCR实验的成败.首先,设计了基于多因素(序列相似性,引物3′末端自由能,Tm等)的PCR引物特异性评估工具-MFEprimer;其次,在MFEprimer的基础上,结合引物设计软件primer3,在Taverna工作流平台上构建了PCR引物设计(primer3)与评估(MFEprimer)一体的工作流系统-TPM(Taverna-Primer3-MFEprimer),实现了从引物设计到评估的自动化分析流程,使用简单方便.

多重PCR引物在Xp11.2易位/TFE3基因融合中的应用

目的 对Xp11.2易位/TFE3基因不同融合类型设计多重PCR引物,证实多重PCR联合Sanger法测序的可行性,旨在探讨引物设计的重要性.方法 选取已通过高通量RNA-Seq测序证实TFE3融合类型的标本23例,其融合类型包括PSF-TFE3 3种,PRCC-TFE3 3种,ASPL-TFE3 2种, FUBP1-TFE3 1种,NONO-TFE3 2种,RBM10-TFE3 1种,MED15-TFE3 1种以及MATR3-TFE3 1种共计14种,对其用设计好的多重PCR引物进行PCR扩增并联合Sanger法测序进行验证,该次实验分4个多重PCR反应,包括14条不同基因的正向引物以及4条TFE3反向引物.结果 23例标本均与高通量RNA-Seq测序结果完全一致,可见所设计的引物通过多重PCR联合Sanger法测序是可行的.结论该方法的优势在于利用4个多重PCR反应便可确定是否存在上述14种TFE3融合类型阳性,并通过反向测序便可确定具体融合类型.因此从试剂成本方面考虑,尤其在大批量标本的TFE3融合类型筛查过程中,该方法较高通量RNA-Seq测序有很大的优势.

单管多重PCR快速检测中国人三种常见缺失型α-地中海贫血基因

目的 建立一种简单快速、准确可靠、经济实用的检测常见缺失型α-地中海贫血(α-地贫)突变(- - SEA、- α3.7和- α4 .2 )的单管多重PCR技术以用于α-地贫的分子筛查和产前诊断。方法 采用gap- PCR方案设计4组PCR引物并对PCR反应条件进行系统优化以扩增代表这3种地贫和α2 基因存在的特异性DNA片段。此外,还设计1对引物扩增L IS1基因3′-端非翻译区片段作为整个PCR体系扩增成功与否的内在对照。采用盲法分析对该技术的特异性、准确性和可靠性进行评价并应用于产前分子诊断中。结果 所建的单管多重PCR技术成功地检出这3种常见缺失型α-地贫突变的纯合子、杂合子和双重杂合子。正常人出现L IS1和α2 基因特异扩增片段,而- - SEA、- α3.7和- α4 .2杂合子除了出现正常人的2条扩增带外,还分别出现1条指示这些突变存在的特异性扩增片段。盲法分析结果显示,该技术对α-珠蛋白基因型经过Southern印迹法或DNA直接测序确证的DNA标本的诊断准确性达到10 0 % ,并被成功地应用于9个重症α-地贫高风险家庭的产前诊断中。结论 该技术可准确、快速地检测- - SEA、-α3.7和-α4 .2 3种常见缺失型α-地贫突变,且具有经济和实用的优点,非常适合于α-地贫的大人群分子筛查和临床样品的基因诊断。

半巢式多重PCR法对A组轮状病毒VP7基因的分型

目的采用半巢式多重PCR法对A组轮状病毒(group A rotavirus,RVA)VP7基因进行分型。方法根据GenBank中RVA VP7基因5′端保守区设计合成多组基因分型引物,提取11个RVA代表流行毒株病毒的RNA,采用半巢式多重PCR方法进行RVA的VP7基因分型,使用BLAST在线软件与GenBank上相应VP7核苷酸序列比对。结果经琼脂糖凝胶电泳鉴定,11株RVA的多重PCR产物大小均与预期一致,能正确鉴别具有代表性的流行毒株VP7基因型[G1、G2、KN105(Wa-like G3)、To16-01(equine-like,DS-1-likeG3)、G4、G8、G9及G12];经BLAST在线软件比对,RVA病毒株VP7基因序列与设计的上游引物匹配,并与下游引物互补,引物特异性良好。结论利用设计的引物成功建立的半巢式多重PCR方法能正确识别RVA的VP7基因型。

一株产褐藻酸多糖的海洋假单胞细菌 Pseudomonass P．QDA的筛选和鉴定

根据已获褐藻酸多糖生物合成基因簇中褐藻胶裂解酸基因(algL)的序列设计特异性引物，利用PCR技术从海洋微生物中筛选到1株能够分泌胞外多糖的细菌。采用形态学观察和DNA序列分析鉴定该菌株，结果为假单胞属细菌，命名为Pseudomonassp．QDA；系统发育树显示该菌株与P.purida亲缘关系最近。菌株产生的胞外多糖可被褐藻胶裂解酶(AlgL)降解，并在紫外234nm处检测到特征性吸收，初步证明含有褐藻酸多糖。

啤酒污染菌快速检测鉴定技术的开发与应用

本研究针对啤酒酿造过程污染微生物传统培养技术检测时间长、结果严重滞后的现状，围绕提高检测效率、加强微生物监控能力而进行的基因芯片技术与快速培养技术的创新与开发。通过对啤酒有害菌、好氧菌＋肠道致病菌两种啤酒行业专用基因芯片的开发，达到了在6～8小时内完成96个样品的12种啤酒有害菌、3个属的好氧菌和3种肠道致病菌的同步检测和鉴定；通过采用v向应面试验设计方法对传统MRS培养基进行的优化、改良，将使啤酒有害菌的检测时间从原来的7天缩短到2天，解决了以往检测片球菌属所遇到的生长缓慢、菌落微小、甚至不生长的难题。将以上两种检测技术有机结合，为啤酒生产建立了一套经济、快速、高效、全面的微生物污染预防控制体系，避免了检测结果滞后带来的质量问题和经济损失。

单管-套式/多重聚合酶链反应在间日疟原虫基因型鉴定中的价值

目的 对单管 套式多重聚合酶链反应 (PCR)鉴定间日疟原虫基因型方法的应用价值进行研究。方法 以间日疟原虫环子孢子蛋白 (CSP)基因为模型 ,综合套式多重PCR、等位特异PCR和标签引物扩增等技术 ,使用PrimerPremier 5 0软件和NCBI的BLAST网络改进与优化引物设计 ,并用矩阵试验法优化反应条件和程序 ,同时 ,用单管 套式多重PCR和套式PCR对 71份间日疟患者血标本的间日疟原虫基因型鉴定结果作比较。结果 单管 套式多重PCR可同时扩增出 3种不同长度的基因型 /族特异片段 ,且基本消除了二聚体等噪音。用单管 套式多重PCR鉴定检测 71份间日疟患者血标本 ,6 2份与套式PCR鉴定结果一致 ,并新发现 6份不同基因型和PV Ⅱ型的混合感染 ;还将 2份套式PCR鉴定为热带族的血标本纠正为PV Ⅱ型 ,1份阴性血样鉴定为温带族。结论 研究建立的单管 套式 /多重PCR鉴定间日疟原虫基因型的方法 ,简化了试验步骤 ,节省了试剂耗材 ,消除了PCR噪音 ,提高了检出间日疟原虫混合感染和低度感染的敏感性 ;

用VariantSEQr^TM引物进行人类基因再测序

VariantSEQr^TM是一个对人类基因的外显子和5’上游序列进行再测序的系统。该系统包括了将近1.6万个人类基因测序所需的42万对预先设计的PCR引物，每对引物都加了M13通用序列以简化测序反应步骤，所有的引物都能在同样的PCR和测序反应条件下使用。

基因芯片检测肠出血性大肠埃希菌O157∶H7

目的设计和制备快速、特异、灵敏的检测大肠埃希菌O157∶H7基因芯片。方法选择O157∶H7特异的rfbE、fliC、SLT1和SLT2基因,设计引物和探针,并制备检测芯片,通过两次聚合酶链反应(PCR)扩增,制备荧光标记的靶序列,并与芯片进行杂交,检测O157∶H7菌株和非O157病原体。结果O157∶H7菌株在采用单一和多重PCR两种方法制备的荧光标记靶序列与芯片杂交,均在芯片相应探针处出现阳性信号,非O157杂交结果均为阴性;芯片检测灵敏度比PCR检测高。结论基因芯片可以快速、灵敏、特异地检测O157∶H7,为建立快速灵敏的检测细菌病原体和鉴别诊断的自动分析系统提供了新方法。