多重PCR方法检测食品中转基因成分

根据转基因农作物中最常用的花椰菜花叶病毒启动子 (CaMV 3 5S)和根癌农杆菌终止子(NOS)的序列 ,设计合成了两对不同的引物和相对应的两种荧光双链探针 (FDCP) ,分别建立了多重PCR、应用FDCP的实时荧光PCR同时检测转基因成分 3 5S启动子和NOS终止子的方法 .并利用该套方法对马铃薯、大豆、玉米、甜椒、番茄等实物样品进行了检测 ,发现 1 3份样品中有 6份检出3 5S启动子、NOS终止子 ,其余 7份样品的检测结果为阴性 .表明作者建立的多重PCR方法能有效检测出 3 5S和NOS成分 ,其中多重PCR法具有灵敏度高、特异性好的特点 ,多重荧光PCR法则更为简便、快速。

多重PCR方法用于检测猪圆环病毒2型、猪细小病毒、猪伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒诊断方法的建立

本文建立了一种能够同时检测猪圆环病毒2型(PCV2)、猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的多重PCR方法(mPCR)。借助于Oligo6.0引物设计软件,设计了4对引物分别用于扩增PCV2ORF2基因353bp片段、PPVNS-1基因271bp片段、PRRSVMN基因美洲型434bp片段、PRVgB基因194bp片段。通过人为混合以上4种病毒进行特异性及敏感性试验,结果表明,该方法具有很好的特异性和敏感性。对猪瘟病毒、大肠杆菌和双蒸水的PCR扩增结果均为阴性;该mPCR方法对PPV的最低检测量为8.64×10-3μg,PRV的最低检测量为2.36×10-3μg,PRRSV的最低检测量为3.68×10-3μg,PCV2的最低检测量为2.90×10-4μg。该方法的建立对临床上PCV2、PPV、PRV、PRRSV的鉴别诊断以及以上这4种病毒的流行病学调查具有十分重要的意义。

鉴定金黄色葡萄球菌的多重PCR方法

建立了一种快速鉴定和鉴别金黄色葡萄球菌的多重PCR方法。利用金黄色葡萄球菌的特异基因、耐甲氧西林基因和4种肠毒素基因nuc、mecA和sea、sec、sed、see建立6重PCR反应体系,并对PCR体系,引物浓度进行优化。6对PCR引物均能特异地扩出相应的目的基因。对47株金黄色葡萄球菌的检测结果与应用单重PCR鉴定结果完全一致。实验所建立的多重PCR方法能在一个反应体系中鉴定和鉴别金黄色葡萄球菌,为食品中金黄色葡萄球菌的快速检测提供了一种有效的检测手段。

水禽4种常见致病菌多重PCR方法的建立及应用

为建立一种能同时检测大肠杆菌、鸭疫里默氏杆菌、多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌的多重PCR方法,试验根据大肠杆菌phoA基因、鸭疫里默氏杆菌ompA基因、多杀性巴氏杆菌kmt 1基因、金黄色葡萄球菌FemB基因的保守区域设计4对特异性引物,通过优化退火温度和引物浓度建立多重PCR方法,检验该方法的特异性、敏感性性、重复性,应用该方法检测145份病死水禽临床样品,并与传统细菌分离鉴定方法进行比较。结果表明:优化后的最佳退火温度为52℃,引物浓度为10μmol/L。建立的多重PCR方法能特异性地扩增出靶基因,沙门氏菌、链球菌、产气荚膜梭菌等临床常见菌均未扩增出条带,对大肠杆菌、鸭疫里默氏杆菌、多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌4种细菌的检出下限是0.4 pg/mL,单一PCR扩增ompA、kmt 1、phoA和FemB基因的检出下限分别为4×10^(-3),0.4,4×10^(-3),4×10^(-6)pg/mL。多重PCR方法对临床样品的检测结果与传统细菌分离鉴定方法的符合率均在90%以上。说明试验建立的多重PCR方法具有结果稳定、重复性高的特点,适合水禽病原微生物流行病学调查。

广东省蒲瓜病毒种类鉴定及多重RT-PCR检测方法的建立

【目的】探明侵染广东省蒲瓜的病毒种类,建立一种可以同时检测多种蒲瓜病毒的RT-PCR检测方法,提高蒲瓜病毒种类鉴定效率,为蒲瓜病毒病的精准监测与防控提供依据。【方法】2018—2022年间,从广东省广州市、惠州市、清远市、汕头市和湛江市的蒲瓜主要种植区采集蒲瓜病毒病疑似样品78份,对采集的样品按照地区和症状进行分类,提取每份样品的总RNA,将一个地区具有相同症状样品的RNA等量混合后进行小RNA深度测序分析。根据小RNA深度测序分析结果,设计特异引物进行RT-PCR验证,从而明确侵染广东省蒲瓜的病毒种类。挑选6种检出率高、危害严重的蒲瓜病毒,根据GenBank数据库设计多重PCR检测引物,通过优化反应体系和反应条件,建立同时检测6种蒲瓜病毒的多重RT-PCR方法。【结果】从采集的78份蒲瓜疑似病毒病样品中,共检测到12种病毒,按照检出率从高到低分别为葫芦内源RNA病毒(Lagenaria sicerariaalphaendornavirus,LSEV)(64.1%)、黄瓜绿斑驳花叶病毒(cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)(62.8%)、小西葫芦虎纹花叶病毒(zucchini tigre mosaic virus,ZTMV)(51.3%)、西瓜绿斑驳花叶病毒(watermelon green mottle mosaic virus,WGMMV)(43.6%)、西瓜病毒A(watermelon virus A,WVA)(32.1%)、番木瓜环斑病毒(papaya ringspot virus,PRSV)(19.2%)、小西葫芦黄花叶病毒(zucchini yellow mosaic virus,ZYMV)(9.0%)、瓜类蚜传黄化病毒(cucurbit aphid-borne yellows virus,CABYV)(7.7%)、中国南瓜曲叶病毒(squash leaf curl China virus,SLCCNV)(7.7%)、瓜类褪绿黄化病毒(cucurbit chlorotic yellows virus,CCYV)(5.1%)、瓜类黄矮失调病毒(cucurbit yellow stunting disorder virus,CYSDV)(3.8%)、甜瓜黄斑病毒(melon yellow spot virus,MYSV)(1.3%)。78份样品中,复合侵染率高达80.8%,其中2、3、4、5、6和7种病毒复合侵染的检出率分别为14.1%、16.7%、23.1%、17.9%、7.7%和1.3%。在多重RT-PCR体系中先加入WVA+CCYV+ZTMV+PRSV引物,12个反应后再加入CGMMV+WGMMV引物,引物体积依次为WVA 0.5μL、CCYV 0.5μL、CGMMV 0.4μL、WGMMV 0.4μL、ZTMV 0.6μL、PRSV 0.6μL,从而确立了一种同时扩增6种病毒的多重RT-PCR检测方法。【结论】危害广东省蒲瓜的主要病毒有12种,其中CGMMV、ZTMV、WGMMV、WVA为优势病毒;复合侵染现象较普遍,以3、4和5种病毒的复合侵染形式占比较高;研发出一种同时检测蒲瓜上6种病毒的多重RT-PCR检测技术,提高了蒲瓜病毒种类鉴定效率。

多重荧光PCR方法与血清凝集方法对沙门氏菌分型鉴定的结果对比

目的 探讨多重荧光PCR方法和血清凝集方法在沙门氏菌分型鉴定结果中的意义。方法 选取扬州市邗江区疾病预防控制中心在2022年9月—2023年6月接诊的4940例进行门诊健康证筛查的患者,上述患者均接受血清凝集方法以及多重荧光PCR方法进行检测,探究两种检测方式在沙门氏菌中的检出率以及沙门氏菌分型鉴定结果。结果 多重荧光PCR方法检出效能与血清凝集方法检出效能间无统计学意义(P>0.05);在沙门氏菌分型鉴定结果中对比,多重荧光PCR鉴定方法所检测出的沙门氏菌分型中,肠炎沙门氏菌(1株),鼠伤寒沙门氏菌(1株),B群沙门氏菌(3株)较血清凝集鉴定方法检出率高,但组间对无统计学意义(P>0.05)。结论 多重荧光PCR方法和血清凝集方法在沙门氏菌检测和分型鉴定中各有优势,在特定的应用场景下可以选择适合的方法来提高检测效率和准确性,但本研究存在一定的局限性、年限短、样本量少,今后可加大样本量进一步研究。

鉴定五类致泻性大肠埃希菌和志贺菌的多重PCR方法

目的建立一种快速鉴定和鉴别五类致泻性大肠埃希菌和志贺菌的多重PCR方法。方法利用五类致泻性大肠埃希菌和志贺菌的毒力基因stx1、stx2、eaeA、lt、stIb、aggR、ipaH及16SrRNA基因rrs,建立8重PCR反应体系,并对PCR引物、反应体系和循环条件进行优化。结果 8对PCR引物均能特异地扩增相应的基因。对本实验室87株大肠埃希菌及志贺菌的检测结果与先前应用单重PCR的鉴定结果完全一致。结论采用内对照基因和毒力基因建立的多重PCR方法既能在一个反应体系中鉴定和区分五类致泻性大肠埃希菌和志贺菌,又能评价PCR体系的反应效率,为五类致泻性大肠埃希菌的快速鉴定和鉴别提供了一种有效检测手段。

多重PCR方法同时鉴别人参、西洋参、三七

目的:建立一种能同时鉴别人参属人参、西洋参、三七3种药材的多重聚合酶链反应(PCR)方法。方法:通过分析人参、西洋参、三七psb A-trn H基因序列的差异设计了特异性引物对1,利用随机扩增多态性DNA(RAPD)分子标记技术筛选获得的特异性片段的基因序列,设计了特异性引物对2;优化了多重PCR鉴别体系并验证其耐受性和实用性。结果:构建的多重PCR鉴别体系能够成功地鉴别人参、西洋参、三七,人参样本可扩增出片段大小约为150 bp的特异性条带,西洋参样本可扩增片段大小出约为150 bp和400bp 2条特异性片段,三七样本可扩增出片段大小约为400 bp的特异性条带。结论:本多重PCR鉴别体系特异性好,可准确、可靠地鉴别人参、西洋参、三七。

猪瘟和猪伪狂犬野毒与其疫苗株多重PCR鉴别方法的建立

为建立一步法鉴别检测猪瘟病毒(CSFV)和猪伪狂犬病病毒(PRV)野毒株与其疫苗株感染的多重PCR方法(m PCR),本实验通过比对分析Gen Bank中登录的CSFV和PRV的相关基因序列分别设计可以区分CSFV与PRV及其疫苗株的5对特异性引物,建立了其多重PCR鉴别检测方法。结果表明,建立的多重PCR方法对CSFV和PRV扩增为阳性,而对PCV2、PRRSV、JEV和BVDV扩增结果均为阴性;最低核酸检测量分别为1.7×10~3拷贝/μL(CSFV野毒株)、9.9×10~3拷贝/μL(CSFV-C疫苗株)、1.3×10~3拷贝/μL Guizhou-DY)、6.9×10~3拷贝/μL(Bartha-K61)和5.5×10~3拷贝/μL(SA215)。采用该方法对134份可疑临床样品进行检测,结果表明CSFV和PRV疫苗株与野毒株在能繁母猪、育肥猪、保育猪和哺乳仔猪中的5重感染率分别为2.6%(1/38)、7.7%(2/26)、8.3%(3/36)和8.8%(3/34)。本研究建立的多重PCR方法为从病原学方面快速鉴别CSF和PR疫苗毒与野毒提供了新的技术支撑,为规模化猪场实现猪瘟与猪伪狂犬的净化提供一种新方法。

多重PCR检测毒力型艰难梭菌的方法学研究及应用

目的建立多重PCR方法检测毒力型艰难梭菌。方法设计艰难梭菌种特异tpi引物和毒力基因tcdA、tcdB特异性引物,建立多重PCR方法。利用已知菌株,验证方法的特异性和最低检出限。与厌氧培养法、ELISA法比较其检测临床菌株和其毒素分泌的准确性。结果多重PCR方法检测艰难梭菌的最低检出浓度为0.7 pg/μ1,特异性为100%。53株厌氧培养法鉴定的艰难梭菌临床分离株,多重PCR方法检测tpi基因均为阳性,其中tcdA+/tcdB+为39株,tcdA-/tcdB-为14株。ELISA法检测毒素A/B显示23株为阳性、30株为阴性。23株ELISA法毒素A/B阳性的艰难梭菌多重PCR方法检测结果均为tcdA+/tcdB+。结论多重PCR方法可用于检测毒力型艰难梭菌具有较高的临床应用价值。

多重PCR快速诊断猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型与猪细小病毒方法的建立

利用Primer Premier 5.0及DNAstar软件对猪伪狂犬病毒gB基因、猪圆环病毒2型ORF2基因和猪细小病毒VP2基因的保守区进行引物设计,选出扩增序列为猪伪狂犬病毒(373 bp)、猪圆环病毒2型(430 bp)和猪细小病毒(495 bp)的3对引物.敏感性和特异性试验结果表明,mPCR对3种病毒的核酸检测限量从猪伪狂犬病毒至猪细小病毒分别为1.62×10-6、1.47×10-6和1.28×10-4ng,对灭菌双蒸水、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒cDNA和猪瘟病毒cDNA的mPCR扩增结果均为阴性.mPCR可作为临床上猪伪狂犬病、猪圆环病毒2型感染和猪细小病毒病的病原学快速诊断方法.

三种犬呼吸道常见病毒多重PCR检测方法建立

为建立犬呼吸道冠状病毒(Canine respiratory coronavirus,CRCoV)、犬细小病毒(Canine parvovirus,CPV)、犬瘟热病毒(Canine distemper virus,CDV)3种病毒的多重PCR方法,根据GenBank中CRCoV、CPV和CDV的基因序列,进行BLAST同源性分析,找出保守序列,并根据保守序列对每个病毒设计引物,建立扩增3种病毒的多重PCR方法,并通过已建立的方法对收集的呼吸道病犬病料进行检测。结果表明,所建立的三重PCR体系组成为2×Taq Mix 12.5μL,3对上、下游引物各0.6μL,混合模板1μL,ddH 2 O 7.9μL;扩增程序为94℃5 min;94℃30 s,54℃1 min,72℃24 s,共35个循环;72℃8 min。该方法具有较高的灵敏性和特异性。临床验证实验表明,本实验所建立的多重PCR方法可用于临床诊断。

多重PCR快速检测猪伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型方法的建立

根据GenBank上猪伪狂犬病病毒（PRV）、猪圆环病毒2型（PCV2）的已知序列，利用Primer Premier 5.0及DNAstar软件对上述病毒基因保守区进行引物设计，选出扩增序列为PRV gB基因373 bp、PCV2 ORF2基因430 bp两对引物。在优化单项PCR反应条件基础上，建立了PRV-PCV2两重PCR检测方法。敏感性及特异性试验结果显示，该mPCR对2种病毒的核酸检测可至1.47×10-6~1.62×10-6 ng，而对灭菌双蒸水、猪细小病毒（PPV）猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒（PRRSV）、猪瘟病毒（CSFV）多重PCR的扩增结果均为阴性，作为临床上猪伪狂犬病和猪圆环病毒2型感染的病原学快速诊断方法具有可行性。

3种马铃薯病原菌多重PCR检测方法的建立

为了快速准确地鉴定出3种不同的马铃薯(Solanum tuberosum L.)病原菌,即致病疫霉(Phytophthora infestans)、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)和茄链格孢菌(Alternaria solani),根据GenBank中的这3种病原菌基因序列设计特异引物,从影响多重聚合酶链式反应(PCR)扩增的因素(如退火温度和引物浓度)对反应体系进行优化,建立能够同时检测3种马铃薯病原菌的多重PCR方法。结果显示,所建多重PCR方法的检测限为40.0 fg/μL,灵敏度较高,且具有良好的特异性。该检测方法实现了同时对3种马铃薯病原菌的高效、快速的检测,提高了检测效率,降低了检测成本,在马铃薯病害的早期预防、诊断及防控中具有较高的应用潜力。

3种奶牛乳腺炎常见致病菌多重PCR检测方法的建立

在奶牛养殖的实际过程中,乳腺炎是极为常见的一种疾病,如果能够切实做好其主要致病菌检测的话,对于疾病的防治,是有着积极效果的。基于这样的现实背景,本文以奶牛乳腺炎三种常见致病菌(金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、酵母菌)多重PCR检测方法的建立为主要研究对象,在对其进行概述的基础上,展开深入、细致的研究与分析,希望能为进一步做好该病监测,从而为后续的综合防控工作提供一定的依据和参考。

3种食源性致病菌Tem-PCR检测方法的建立

应用靶序列富集多重聚合酶链式反应（t arget-enriched multiplex-polymerase chain reaction,Tem-PCR）技术建立金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和志贺氏菌3种食源性致病菌的快速检测方法。分别以金黄色葡萄球菌fem A基因、沙门氏菌inv A基因和志贺氏菌ipa H基因为靶基因,设计3对特异性引物,并与通用引物连接组成Tem-PCR引物,通过反应条件优化,建立了Tem-PCR检测方法。结果显示,建立的Tem-PCR方法特异性强,对沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和志贺氏菌的检测灵敏度分别为1.1×10^3、2×10^3 CFU/m L和1.2×10^3 CFU/m L。Tem-PCR检测方法有效地解决了传统多重PCR引物扩增效率不均衡的问题。

应用多重PCR同时检测多种转基因成分

以多重 PCR方法在反应体系中加入 1对到 3对引物同时检测转基因矮牵牛与阳性对照质粒中的 1～ 3个外源基因 ,包括花椰菜花叶病毒 (Cauliflower mosaic virus,Ca MV) 35 S启动子、根癌农杆菌胭脂碱合成酶基因终止子(NOS)、大肠杆菌 K12菌株新霉素磷酸转移酶 II(Npt II)编码基因。结果表明多重 PCR方法不但可以提高检测效率、降低检测成本 ,还可以有效防止假阳性。是一种值得推广的方法。

应用Tem-PCR技术同时检测3种致病菌的研究

应用靶序列富集多重PCR(target enriched multiplex PCR,Tem-PCR)技术建立同时检测沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、大肠埃希氏菌O157三种致病菌的高通量简易检测方法.实验分别以沙门氏菌的inv A基因、单核细胞增生李斯特氏菌的hly基因、大肠埃希氏菌O157 rfb E基因为靶基因,设计3对特异性引物,并与通用引物连接组成Tem-PCR引物,通过反应条件优化,建立了TemPCR检测方法.结果表明,建立的Tem-PCR方法特异性强,其检测灵敏度分别为沙门氏菌1.1×103CFU/m L、单核细胞增生李斯特氏菌5.6×102CFU/m L、大肠埃希氏菌O157 2.3×103CFU/m L.方法不需要优化调整各引物对的浓度,易于使用,有效地解决了传统多重PCR方法扩增效率不均衡的问题.

牛病毒性呼吸道疾病主要病原多重PCR检测方法的建立与应用

为建立对牛呼吸道疾病综合征(BRDC)进行快速而准确的病原学检测方法,基于牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)g B 基因、牛病毒性腹泻病毒(BVDV) 5′UTR 基因、牛副流感病毒 3 型(BPIV3)HN 基因和牛呼吸道合胞体病毒(BRSV) N 基因设计检测引物,经过条件优化,建立了检测 IBRV、BVDV、BPIV3 和 BRSV的多重 PCR 方法。 该方法具有良好的特异性和灵敏性,可特异性地同时检测 IBRV、BPIV3、BRSV 和 BVDV,灵敏度分别为 5.86×10^(3)、2.42×10^(3)、1.02×10^(4)和 5.02×10^(4)copies/ μL,且重复性良好。 利用该方法对采集的309 份具有呼吸道症状牛的鼻腔拭子进行检测 ,结果显示 ,IBRV、BVDV、BPIV3 和 BRSV 的阳性率分别为6.15%、28.16%、18.12%和 33.66%,其中 BVDV 与 BRSV 的混合感染率为 5.18%,BVDV 与 BPIV3 的混合感染率为 1.62%,BRSV 与 BPIV3 的混合感染率为 4.21%,BVDV、BRSV 与 BPIV3 的混合感染率为 0.97%。该多重 PCR 方法的建立为 BRDC 主要病毒的鉴别检测及流行病学调查提供了必要的技术支撑。

沙门菌玻片凝集血清分型与多重荧光PCR血清分型检测试剂盒方法比较

目的探讨在肠道多病原监测中,沙门菌多重荧光PCR血清分型检测试剂盒的适用性,扩展沙门菌的分子分型和鉴定方法,提高分型效率,以更快更好地应对由沙门菌引起的腹泻事件。方法利用沙门菌多重荧光PCR血清分型检测试剂盒和传统玻片凝集血清分型方法,对2013—2018年北京市丰台区肠道多病原监测中分离获得的95株沙门菌进行分型分析,比较2种结果的符合程度。结果采用传统玻片凝集法,95株沙门菌被分为21种血清型。采用多重荧光PCR血清分型检测试剂盒,85株沙门菌被分为17种型别,10株菌无法分型,包含Salmonella Goldcoast、S.London、S.Senftenberg、S.Thompson、S.Panama、S.Othmarsche 6种血清型。在试剂盒成功分型的85株菌中,83株菌的分型结果与玻片凝集法一致,符合率为97.65%。结论在沙门菌分型中,玻片凝集法应用良好,多重荧光PCR血清分型检测试剂盒与前者分型结果一致性高,检测效率显著提升,对不常见血清型的鉴定有待扩充,2种方法联合使用可全面提高实验室对沙门菌的分型检测效率和准确率。