多重PCR法检测对虾皮下和造血器官坏死杆状病毒

根据对虾皮下和造血器官坏死杆状病毒 (HHNBV)HHNBV - XIA 靶基因序列设计了 4个多重PCR法用引物 (P1、P2、P3、P4)。采用了五种引物组合形式分别对HHNBV -XIA、HHNBV基因和PRDV -JAPAN片段进行了特异扩增 ,建立了多重PCR检测HHNBV方法。通过优化多重PCR法检测HHNBV条件 ,可从阳性感染的中国对虾fg级DNA中定性检测出皮下和造血器官坏死杆状病毒。

多重PCR法在志贺菌基因分型鉴定中的应用价值

目的探讨多重PCR法在志贺菌基因分型鉴定中的应用价值。方法采用多重PCR法对120例腹泻患者大便细菌标本进行基因分型鉴定,并对不同血清型的志贺菌进行有效性验证。结果采用多重PCR法鉴定志贺菌的检出率为55.00%,血清凝集法检出率为33.33%,多重PCR法灵敏度和特异性均高于血清凝集法(P<0.05)。结论应用多重PCR法鉴定志贺菌基因分型,具有检测敏感性高、特异性强等优点,有助于提高肠道致病菌检测的准确率及有效率。

阿胶的半巢式-多重PCR鉴别方法研究

采用半巢式-多重PCR(聚合酶链式反应)法鉴别阿胶中是否掺杂有马、猪和牛源性成分。首先采用液氮研磨法从阿胶中提取高质量的DNA(脱氧核糖核酸),以通用引物P1和P2进行第一轮扩增,并将扩增产物作为第二轮PCR的模板;再以包含通用引物P1和4种物种(驴、马、猪和牛)特异性引物A、B、C和D的混合引物进行第二轮多重PCR扩增;最后电泳检测第二轮扩增产物,根据电泳条带的分子量大小,判断阿胶产品的动物原材料是否掺假。结果表明,采用本方法可观察到不同动物DNA分子量之间的明显差异,通过DNA电泳结果直接判断阿胶产品中是否掺假。

多重PCR与恒温扩增芯片法在呼吸道病原体中的检测价值

目的评估多重荧光定量PCR法在呼吸道病原体(包括铜绿假单胞菌、肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、结核分枝杆菌、流感嗜血杆菌)检测中的价值。方法以恒温芯片法为参照检测方法,通过检测呼吸道病原体标准菌株以及临床样本,比较多重荧光定量PCR法和恒温芯片法的检出率。结果与恒温芯片法相比多重荧光定量PCR法具有很高的特异性与一致性且呼吸道病原体的检出率差异无统计学意义(χ^(2)=0.410,P=0.522)。同时对单一病原体的检出率显示,两种检测方法的检出率差异无统计学意义(P>0.05),一致性分析(Kappa值)显示两种检测方法具有高度一致性(Kappa>0.75)。结论多重荧光定量PCR法与恒温芯片法相比具有高度一致性,在呼吸道病原体检测中具有良好的应用价值。

改良多重实时荧光定量PCR法测定抑癌基因MGMT、p16、CDH13和RASSF1A甲基化在肺癌早期诊断中的作用

目的:建立改良多重实时荧光定量PCR法,检测抑癌基因MGMR、p16、CDH13和RASSF1A基因甲基化,探讨其在肺癌早期诊断中的应用。方法:选取30例病理确诊为肺癌的患者作为肺癌组,30例病理确诊为良性病变的患者作为对照组。建立改良实时荧光定量PCR体系。检测受试者血清MGMT、p16、CDH13和RASSF1A基因甲基化,对比两组基因甲基化阳性率,计算四项基因甲基化单独及联合用于肺癌早期诊断的敏感度和特异度。结果:肺癌组受试者血清MGMT、p16、CDH13和RASSF1A显著高于对照组(P<0.05);MGMT、p16、CDH13和RASSF1A四项基因甲基化联合检测用于肺癌早期诊断的敏感度和特异度显著高于单项指标检测(P<0.05)。结论:建立了多重实时荧光定量PCR法用于MGMT、p16、CDH13和RASSF1A基因甲基化检测,联合检测用于肺癌早期诊断具有较高的敏感度和特异度。

多重荧光PCR法和免疫荧光法诊断常见急性呼吸道病毒感染的一致性研究

目的观察多重荧光PCR法和免疫荧光法在辅助诊断急性呼吸道感染(acute respiratory infection,ARI)中的一致性。方法对2021年12月至2022年4月山东阳光融和医院620例急性呼吸道感染住院病例采集咽拭子标本,分别采用多重荧光PCR法和免疫荧光法检测6种呼吸道感染病原体(甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒、副流感病毒Ⅰ型及副流感病毒Ⅲ型),以评估两种方法在诊断呼吸道病毒感染中的一致性、灵敏性、特异性。结果620例ARI标本中,多重荧光PCR法检测阳性率高于免疫荧光法,差异具有统计学意义(χ^(2)=26.28,P<0.005)。两种方法显示乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒检出率最高,其次是腺病毒、副流感病毒Ⅲ型。结论多重荧光PCR法检测6种呼吸道病毒阳性率显著高于免疫荧光法,且与临床表现更相符,提示其对于呼吸道病毒检测有更好的临床应用价值。

成人流感样病例13种病原体检测情况及多重PCR毛细电泳片段分析法检测的临床应用

目的探究成人流感样病例中13种病原体分布情况及多重聚合酶链反应(PCR)毛细电泳片段分析法在病原体检测中的应用价值。方法收集2019年12月至2020年2月北方地区189份流感样病例咽拭子标本,采用多重RT-PCR与毛细电泳片段分析法联用技术得到病原体的检测结果。检测病原体包括甲型流感病毒(InfA)、人腺病毒(HADV)、博卡病毒(Boca)、人鼻病毒(HRV)、甲型流感病毒H1N1(2009)(InfA-H1N1)、季节性流感病毒(InfA-H3N2)、副流感病毒(HPIV)、人偏肺病毒(HMPV)、乙型流感病毒(InfB)、肺炎支原体(MP)、肺炎衣原体(CP)、冠状病毒(HCOV)、人呼吸道合胞病毒(RSV)13种病原体。结果189份流感样病例咽拭子标本中有180份(95.24%)检测出病原体,9份(4.76%)未检测出病原体。180份病原体阳性标本单一病原体150份(83.33%),多种病原体30份(16.67%);145份(80.56%)检测出流感病原体,35份(19.44%)检测出非流感病原体。3种最常见的单一病原体是InfA-H3N2(94份,49.74%),MP(26份,13.76%),InfA(16份,8.47%);3种最常见的多种病原体是InfA-H3N2合并MP感染(15份,7.93%),InfA合并MP感染(7份,3.70%),MP合并HRV感染(3份,1.59%)。结论2019年12月至2020年2月冬季我国北方地区的成人流感病毒主要以InfA-H3N2为主;非流感病毒也可引起流感样病例,以MP感染较多见;部分流感样病例可见混合感染。多重PCR毛细电泳片段分析法有助于全面了解成人流感样病例中病原体分布情况。

多重不对称PCR探针熔解曲线法在一管中检测多个肥胖易感基因方法的建立

目的针对中国人群4个常见的肥胖易感基因位点(FTO基因rs1421085位点、APOA5基因rs662799位点、FABP2基因rs1799883位点、ADRB3基因rs4994位点),建立一种方便、精准、低成本的检测方法。方法结合前期研究中发现的与中国人群肥胖密切相关的4个基因位点,设计引物对、荧光探针以及对应等位基因的靶序列,通过熔解曲线法,验证荧光探针与对应等位基因的靶序列的工作效果,确认不同基因型的熔解温度。采用PCR-Sanger测序法为金标准,对收集的人唾液样本进行检测,选取12个基因型的样本,开发多重不对称PCR荧光探针熔解曲线法进行检测。随后,使用多重不对称PCR探针熔解曲线法与PCR-Sanger测序法分别对200例志愿者的唾液样本进行基因分型检测,比较两种方法的结果与优缺点。结果多重不对称PCR探针熔解曲线法可以在一管中同时对4个常见的肥胖易感基因位点进行检测,准确度与PCR-Sanger测序法相同,且与PCR-Sanger测序法需有扩增、电泳、纯化、s测序的复杂步骤相比,可在一管中一次完成检测,操作更为便捷,且成本更加节省。结论本研究建立了一种针对4个常见肥胖易感基因位点的方便、精准、低成本的基因分型方法,为人群肥胖易感基因的批量筛查提供了一种有效的检测手段。

叶片直接PCR法在玉米转基因快速检测中的应用

采用直接PCR方法跳过DNA提取步骤直接对小块玉米植株叶片进行转基因检测,并设计出针对转基因玉米叶片进行直接PCR及多重PCR的事件特异性检测体系和程序,从而极大简化了检测步骤,大大缩短了检测时长。通过对CC-2和2A-5转基因玉米及复合转基因玉米检测待测样品叶片进行直接PCR检测后发现,该直接PCR检测方法获得的PCR检测结果准确、可靠,适用于多样品玉米叶片转基因植株的快速鉴定。

使用多重PCR检测奶牛乳房炎乳汁中的病原菌

本试验运用多重PCR检测技术检测奶牛乳房炎乳汁中的金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)和绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)3种病原菌,确认该方法在乳汁病原菌检测中的适用性和有效性,并探讨病原菌的感染情况。选取四川奶牛场送检的191份奶样(经过加州乳房炎检测法检测,其中16份为正常奶样,64份为隐性乳房炎奶样,111份为临床型乳房炎奶样),分别进行多重PCR法和传统细菌学培养法检测,并对照和分析2种方法的差异。结果显示,多重PCR检测法检出135株致病菌,检出率为70.7%;传统细菌学培养法检出99株致病菌,检出率为51.8%;通过卡方分析证明2种检测方法的检出率差异显著(P<0.05)。鉴于多重PCR法表现出较强的特异性、灵敏度,且操作方便,非常适用于3种混合感染病原菌在奶牛临床型乳房炎、隐性乳房炎奶样的检测和流行病学调查。

应用多重PCR技术鉴定食源性沙门菌血清型的研究

目的:建立多重PCR技术鉴定食源性鼠伤寒沙门菌血清型的方法。方法:从60株菌株中随机选取4株食源性的沙门菌(分别命名为84号,95号,99号和06号),采用多重PCR法扩增其鞭毛抗原(H抗原)I相鞭毛素编码基因fliC和II相鞭毛素编码基因fljB,经测序比对鉴定各菌株的血清型。结果:多重PCR技术鉴定结果与生化鉴定法结果完全一致,84号菌株血清型模式为1,4:z4,12:e,h:1,2,其血清型为S.Saintpaul;95号血清型模式为1,4,12:i:1,2,其血清型为S.Typhimurium;99号菌株血清型模式为6,8:z4,z23:e,n,z15,其血清型为S.Chailey;06号菌株血清型模式为8,20:i:z6,不能确定其血清型。此外,测序结果还发现上述菌株存在新的变异位点。结论:本研究建立的多重PCR技术结果可靠,操作方便,适用于食品中沙门菌血清型的鉴定。

3种蜱传细菌性病原体多重实时荧光定量PCR法的建立

目的建立一种多重实时荧光定量PCR法,同时检测常见蜱传病原体嗜吞噬细胞无形体、伯氏疏螺旋体及斑点热群立克次体(SFGR)。方法针对各病原体的保守区序列设计特异性引物及TaqMan探针,建立并优化多重实时荧光定量PCR反应体系,评价方法的特异性、灵敏度、重复性及对蜱样本的检测准确性。结果建立的多重实时荧光定量PCR法检测嗜吞噬细胞无形体、伯氏疏螺旋体、SFGR,与大肠埃希菌、问号钩端螺旋体、布鲁氏菌等病原体间无交叉反应,特异性良好;灵敏度均达到102拷贝/μl,重复性变异系数均<2.00%;蜱样本检测中,多重实时荧光定量PCR法与单重实时荧光定量PCR法检测结果一致性为100%。结论研究建立的3种蜱传细菌性病原体多重实时荧光定量PCR法特异性好、灵敏度高,为蜱传病原体的检测提供了技术手段。

三种肺炎支原体PCR耐药检测方法的临床意义探讨

目的探讨PCR测序法、AS-PCR法、多重荧光PCR法检测肺炎支原体(MP)及大环内酯类耐药肺炎支原体(MRMP)的临床意义。方法采集呼吸道感染患儿的咽拭子样本116例,使用PCR测序法、AS-PCR法、多重荧光PCR法检测MP和MRMP,探讨三种方法的特点和临床价值。结果共采集116份咽拭子样本,PCR测序法检测MP阳性69例,阳性率59.48%,其中耐药株67例,包含1株耐药株与敏感株混合感染,耐药率97.1%,均为A2063G点突变,敏感株2例。AS-PCR法检测MP阳性63例,阳性率54.31%,其中耐药株58例,耐药率92.06%,敏感株5例,58例耐药株中混合感染21例,混合感染率33.33%(21/63),混合感染中18例耐药株比例超过50%。与PCR测序法比较,对MP阳性检测结果一致性极好(Kappa=0.86),对MRMP检测结果有较高的一致性(Kappa=0.652)。多重荧光PCR法检测MP阳性共67例,阳性率57.76%,其中耐药株61例,耐药率91.04%,敏感株6例,与PCR测序法相比,对MP阳性检测结果有极好的一致性(Kappa=0.929),对MRMP检测结果中度一致(Kappa=0.476)。结论PCR测序法、AS-PCR法和多重荧光PCR法检测敏感性和特异性均较高,三种方法均可同时进行MP和MRMP检测。AS-PCR法和多重荧光PCR法操作简单,适合临床应用,能为临床诊疗快速提供MP和MRMP检测结果。AS-PCR法能检测MP耐药株和敏感株混合感染,检测敏感性好。三种检测方法可为临床医生合理用药提供数据支持。

改良的纸片表型筛选法用于AmpC酶的检测

目的建立并评价一种检测大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌产AmpC酶的新方法。方法采用改良的纸片表型筛选法,以头孢西丁三维试验和多重PCR法作为对照,对临床分离的耐第三代头孢菌素的164株大肠埃希菌和40株肺炎克雷伯菌进行AmpC酶的检测。结果164株大肠埃希菌中,改良的纸片表型筛选法检出8株产AmpC酶的阳性菌株(8/164,4.88%),其中有2株同时产ESBLs酶;40株肺炎克雷伯菌中未检出产AmpC酶菌株,但检出2株(2/40,5.00%)诱导产AmpC酶菌株。头孢西丁三维试验在大肠埃希菌中检出AmpC酶阳性菌株8株(8/164,4.88%),在肺炎克雷伯菌中未检出产AmpC酶株。多重PCR法检出大肠埃希菌AmpC酶耐药基因阳性9株(9/164,5.49%),肺炎克雷伯菌阳性2株(2/40,5.00%)。结论改良的纸片表型筛选法可用于检测大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌产AmpC酶和诱导产酶株,并可同时检测产ESBLs酶菌株,该法操作简便、结果可靠、无需特殊仪器,可在普通临床实验室应用。

两种检测方法检测12种高危型人乳头状瘤病毒的分析比较

目的观察两种检测方法检测12种高危型人乳头状瘤病毒的分析比较。方法分别采用HC2法与实时荧光定量多重PCR检测HPVDNA，比较两种HPV检测方法的一致性和相关性。结果HC2法检测HPVDNA结果：178例临床样本中，检出阳性病例144例，检出率为80．9％其中样本RLU／阳标RLU比值在≥1且〈10、≥10且〈100、≥100且〈500、～〉500且〈5000之间的样本分别为32、40、36、36例；实时荧光定量多重PCR检测HPVDNA结果：178例临床样本中，检出阳性病例140例，检出率为78．7％。以HC2法结果为参照标准，根据诊断试验评价四格表（表2），计算荧光定量多重PCR检测HPVDNA的敏感度、特异度、准确性、假阳性率、假阴性率、阳性似然比、阴性似然比、诊断比数比分另0为93．1％、88．2％、92．1％、11．8％、6．9％、7．9、0．1、100．5，具有较高的诊断价值。结论与HC2法相比，荧光定量多重PCR具有较好的敏感度、特异性、准确性及一致性，在宫颈病变筛查中具有应用价值。

端粒酶活性多重荧光定量PCR(Taqman探针)检测方法的建立及验证

目的 建立端粒酶活性的多重荧光定量PCR(Taqman探针)检测方法,并进行验证。方法 针对端粒酶催化亚基(telomerase reverse transcriptase,TERT)的CDS序列设计特异性逆转录引物、2对定量引物及探针。优化反应体系中的逆转录引物(特异性逆转录引物和随机引物)及定量引物(2对定量引物探针单独及混合使用),与内参基因GAPDH引物和探针在单管中进行多重荧光定量PCR反应。用293T及MRC-5细胞分别制备端粒酶阳性标准品及阴性标准品,并验证方法 的稳定性及精密性。采用建立的方法 检测19份正常间充质细胞样本和32份乳腺癌细胞样本的端粒酶活性。结果 最佳反应体系为:以特异性逆转录引物合成的cDNA为模板,将TERT基因2对定量引物和探针混合后与内参基因GAPDH引物和探针在单管中进行多重荧光定量PCR反应。优化后大幅提高了体系的灵敏性,TERT荧光信号量(2Rn)增强了3倍。阳性标准品TERT基因扩增曲线正常,且与GAPDH基因之间的2Ct保持稳定;阴性标准品GAPDH基因扩增曲线正常,无TERT基因扩增曲线。反复冻融;3及5次阳性标准品的TERT与GAPDH基因之间的ΔCt与未冻融过的阳性标准品比较,差异较小;组内和组间精密性CV均<1%。19份正常间充质细胞样本端粒酶活性均为阴性,32份乳腺癌细胞样本端粒酶活性均为阳性,两者TERT基因的Ct值差异有统计学意义(t=4.236,P <0.001)。结论 建立的端粒酶活性多重荧光定量PCR(Taqman探针)检测方法 具有良好的稳定性及精密性,有望应用于肿瘤早期诊断和基因治疗。

一种驴和马及狐狸源性成分快速检测方法的研究

实验旨在建立快速检测驴、马和狐狸源性成分的方法。以驴、马和狐狸的线粒体保守序列16S r RNA基因为靶基因,设计通用引物和以不同荧光素标记的特异Taq Man探针,构建与通用引物共用的阳性扩增内标(Internal Amplification Control,IAC)作为PCR监控反应体系。通过优化PCR反应体系和条件,建立能同时检测驴、马和狐狸源性成分的四重实时荧光PCR方法。结果表明:利用驴、马、狐狸、牛、猪、羊、水貂、狗、鸡、鸭、大豆、小麦、玉米等物种检测没有交叉反应,证明该方法特异性高,准确性好。该方法模板DNA检测灵敏度为0.01 ng。本研究建立的驴、马和狐狸源性四重荧光实时PCR检测体系灵敏度高、特异性强,能有效鉴别动物产品中驴、马和狐狸的源性成分,也可用作相关动物皮张真伪的鉴别方法。

2021~2022年深圳市某医院常见呼吸道病毒流行病学特点

目的 分析2021年7月至2022年7月在我院就诊的急性呼吸道感染患者呼吸道病毒的感染情况,并比较多重荧光定量PCR法和胶体金法检测流感病毒的诊断效能。方法 收集我院1 263例急性呼吸道感染患者的鼻拭子标本,采用多重荧光定量PCR法进行检测,分析不同性别、年龄、季节6种常见呼吸道病毒的感染特点。随机抽取2022年1月至7月407例患者标本,采用胶体金法检测甲型流感病毒(influenza A virus, Flu A)和乙型流感病毒(influenza B virus, Flu B),并与多重荧光定量PCR法检测结果进行比较。结果 1 263例患者中,呼吸道病毒阳性检出率为21.54%(272/1 263),呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus, RSV)阳性检出率最高,为8.55%(108/1 263)。不同性别患者阳性检出率差异无统计学意义(P>0.05)。秋季呼吸道病毒阳性检出率最高(P<0.001),其中RSV在秋季检出率最高,Flu A在夏季检出率最高、Flu B在春季检出率最高、副流感病毒Ⅰ型(parainfluenza virus Ⅰ,PIV Ⅰ)和副流感病毒Ⅲ型(parainfluenza virus Ⅲ,PIV Ⅲ)在冬季检出率最高(P<0.05)。不同年龄组患者呼吸道病毒阳性检出率差异具有统计学意义(P<0.001),其中<18岁组,特别是<3岁婴幼儿检出率最高(P<0.001)。多重荧光定量PCR法检测Flu A阳性检出率高于胶体金法,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论 6种常见呼吸道病毒中RSV的阳性率最高。呼吸道病毒流行特征具有年龄、季节差异,未成年人,特别是3岁以下婴幼儿是呼吸道病毒感染的高危人群,应加强对低龄儿童呼吸道传染病防控。多重荧光定量PCR法对于呼吸道病毒检测具有更高的临床应用价值。

皮内注射用卡介苗特异性鉴别试验多重PCR检测方法的建立及验证

目的建立皮内注射用卡介苗(Bacillus Calmette Guerin vaccine,BCG)特异性鉴别试验的多重PCR法,并进行验证。方法根据GenBank登录的Pasteur 1173P2株序列(AM408590. 1)设计并合成引物,以制备的BCG特异性鉴别试验国家参考品(简称BCG鉴别参考品)DNA为模板,多重PCR法扩增其特异性缺失区RD1,产物经3%琼脂糖凝胶电泳鉴定,验证方法的重复性、中间精密度、特异性、耐用性及灵敏度;采用该方法检测8批皮内注射用BCG供试品。结果 BCG鉴别参考品在重复检测6次、2名检测人员分别重复检测3 d、不同PCR退火温度及不同DNA聚合酶加量时均扩增出约200 bp的核酸片段;最低可检10 pg/mL的目的基因,仅对结核分枝杆菌H37Rv及皮内注射用BCG样品DNA扩增出特异性条带。经该方法检测,8批供试品PCR产物电泳均可见单一的目的条带,无RD1序列存在,大小与BCG鉴别参考品一致。结论多重PCR法的重复性、中间精密度、特异性、耐用性及灵敏度良好,可应用于皮内注射用BCG特异性鉴别试验。